Vesikel Unilamellar Kecil Bebas Fosfolipid yang Diisi Imiquimod Mengaktifkan Mikrolingkungan Imun Tumor untuk Mengobati Kanker Hati dan Metastasis Hati

Abstrak
Kanker hati sering didiagnosis pada stadium lanjut dan merupakan penyebab kematian akibat kanker terbanyak keempat di dunia. Metastasis hati, terutama dari kanker kolorektal, terjadi pada 66% pasien. Imunoterapi untuk kanker ini dibatasi oleh lingkungan mikro tumor yang bersifat imunosupresif. Untuk mengatasi hal ini, vesikel unilamelar kecil bebas fosfolipid (PFSUV) dikembangkan untuk menyalurkan agonis reseptor tol-like 7 Imiquimod (IMQ) ke hepatosit. PFSUV terdiri dari 83 mol% kolesterol dan 17 mol% Tween80, dengan IMQ yang dienkapsulasi dalam partikel berukuran 75 nm ini. Pemberian PFSUV-IMQ secara intravena mempertahankan kadar IFN- α hati selama 24 jam sekaligus mengurangi paparan sistemik. Dalam model metastasis hati CT26, PFSUV-IMQ yang dikombinasikan dengan Oxaliplatin mengurangi ukuran tumor, meningkatkan infiltrasi sel T CD8+, dan meningkatkan apoptosis tumor. Dalam model kanker hati HCA-1, pengobatan yang sama menurunkan beban tumor, meningkatkan apoptosis, dan mengurangi metastasis paru-paru. Flow cytometry mengungkapkan peningkatan sel dendritik CD86+/MHC-II+ dan sel T IFN -γ + CD8+ pada tumor yang diobati. RNA-seq menunjukkan pengayaan gen aktivasi imun bawaan setelah satu dosis. Temuan ini menunjukkan bahwa pemberian IMQ yang ditargetkan mengaktifkan lingkungan mikro imun tumor, yang mengarah pada pengurangan beban tumor pada model kanker hati dan metastasis.

1 Pendahuluan
Kanker hati adalah penyebab kematian akibat kanker paling umum keempat secara global. [ 1 ] Karsinoma hepatoseluler (HCC) mencakup ≈75% dari semua indikasi hati primer dan umumnya ditandai dengan perkembangan yang cepat dan prognosis yang buruk. [ 2 ] Tingkat kelangsungan hidup standar 5 tahun hanya 20% pada stadium lanjut, di mana HCC sering didiagnosis. [ 3 ] Sementara indikasinya biasanya diobati dengan reseksi bedah, kekambuhan tumor umum terjadi sekitar 50–60% dalam literatur. [ 4 ] Imunoterapi telah menunjukkan keberhasilan dengan toksisitas yang dapat dikelola dalam pengobatan tumor padat dan uji coba eksplorasi telah dilakukan untuk pengobatan HCC. [ 5 ] Hati adalah organ yang toleran secara imunologis, dan lingkungan mikro tumor HCC sangat imunosupresif. [ 6 ] Faktor-faktor ini menimbulkan tantangan bagi kemanjuran imunoterapi yang tersedia saat ini seperti inhibitor titik pemeriksaan imun (ICI). Saat ini, kombinasi imunoterapi seperti atezolizumab (anti PD-L1) dan bevacizumab (anti-VEGF) menawarkan tingkat respons keseluruhan ≈35%, sehingga masih ada ruang yang cukup untuk perbaikan. [ 7 ]

Bahasa Indonesia: Di luar tumor hati primer, metastasis hati umum terjadi pada indikasi kanker lainnya, mencakup ≈25% kasus. [ 8 ] Sementara metastasis dapat berasal dari berbagai sumber tumor primer, kanker kolorektal (CRC) adalah yang paling umum. CRC adalah salah satu kanker paling umum di dunia dan ≈66% pasien akan mengembangkan metastasis hati. [ 9 ] Perawatan saat ini untuk metastasis hati mencakup reseksi bedah atau reseksi bedah dengan kemoterapi neoadjuvan. Meskipun pendekatan ini, kelangsungan hidup bebas kekambuhan 5 tahun hanya ≈27%. [ 10 ] ICI telah terlibat memiliki potensi manfaat dalam subset tertentu dari kanker kolorektal dengan defisiensi perbaikan ketidakcocokan (dMMR) karena beban mutasi yang lebih tinggi. [ 11 ] Pembrolizumab (anti PD-L1) telah ditunjukkan dalam studi kasus kecil untuk menunjukkan respons histopatologis lengkap pada beberapa pasien dengan lesi hati dari kanker kolorektal metastatik dMMR. [ 12 ] Namun karena subtipe kanker kolorektal ini hanya mencakup sekitar 10–20% kasus, strategi yang berbeda untuk mengaktifkan sistem imun dapat membantu memperluas manfaat imunoterapi.

Salah satu metode untuk mengaktifkan sistem imun adalah dengan menggunakan reseptor tol-like (TLR). TLR adalah reseptor pengenalan pola yang mengenali motif virus, bakteri atau jamur, dan akan menginduksi respons imun setelah diaktifkan. [ 13 ] Imiquimod (IMQ) adalah molekul kecil yang disetujui FDA dari kelas imidazoquinolinamine yang menginduksi pelepasan sitokin pro-inflamasi melalui TLR7. [ 14 ] Karena tidak larut, IMQ biasanya diracik menjadi krim untuk pemberian topikal, dan akan memerlukan teknologi yang lebih canggih untuk memberikannya secara sistemik. [ 15 ] Selain itu, aktivasi imun yang berlebihan melalui TLR dapat memicu badai sitokin, yang berpotensi menyebabkan kerusakan multiorgan. [ 16 ] Oleh karena itu, kemampuan untuk menargetkan pengiriman Imiquimod ke hati menggunakan nanopartikel dapat menjadi strategi yang layak untuk membalikkan imunosupresi pada tumor hati sambil mengurangi aktivasi imun sistemik. Nanomedicine sebelumnya telah dilaporkan digunakan secara efektif dalam modulasi lingkungan mikro imun tumor, oleh karena itu menyoroti kelayakan strategi ini. [ 17 , 18 ] IMQ telah diformulasikan ulang menjadi beberapa bentuk yang berbeda, beberapa contohnya termasuk obat awal lipofilik untuk pengiriman ke kelenjar getah bening usus untuk pemberian oral, nanopartikel berbasis asam hialuronat untuk pengobatan kanker payudara, atau nanopartikel lipid lainnya untuk pengobatan Human Papilloma Virus. [ 19 – 21 ] Namun, tidak ada formulasi IMQ lain yang dilaporkan saat ini untuk pengobatan kanker hati yang diberikan secara intravena.

Dalam penelitian ini, vesikel unilamelar kecil bebas fosfolipid (PFSUV) dibuat dengan mencampur cepat larutan alkohol kolesterol (83 mol%) dan Tween80 (17 mol%) dengan penyangga berair menggunakan perangkat mikrofluida. IMQ secara aktif dimuat ke dalam inti berair PFSUV. Pengiriman yang ditargetkan ke hati dan aktivasi imun lokal PFSUV-IMQ dibandingkan dengan obat bebas yang dilarutkan dalam DMSO. Khasiat antitumor dari kedua formulasi IMQ ini dibandingkan dalam satu model metastasis hati dan satu model kanker hati primer pada tikus. Aktivasi lingkungan mikro imun tumor dinilai dengan flow cytometry, pewarnaan imunohistokimia, imunofluoresensi, dan RNA-sequencing untuk mengukur infiltrasi tumor dari berbagai sel efektor imun dan sel penekan dan sitokin pro-inflamasi, masing-masing, untuk memberikan wawasan mekanistik.

2 Hasil dan Pembahasan
2.1 Karakterisasi Partikel
PFSUV yang terdiri dari 83 mol% kolesterol dan 17 mol% Tween80 dihasilkan menggunakan pencampuran mikrofluida, [ 22 ] dan IMQ dimuat ke dalam partikel menggunakan gradien amonium sulfat pada rasio obat terhadap lipid 1/20 (b/b) dengan adanya <10% dimetil sulfoksida (DMSO), diikuti oleh dialisis untuk menghilangkan DMSO dan obat yang tidak dimuat. PFSUV kosong ditemukan berukuran 56,12 ± 0,94 nm dengan indeks polidispersitas (PDI) 0,15 ± 0,02. Saat dimuat, PFSUV-IMQ berukuran 75,44 ± 1,17 nm dengan PDI 0,166 ± 0,022, dan efisiensi enkapsulasi obat adalah 98,2 ± 4,7%. Potensi zeta adalah -3,97 ± 2,07, yang menunjukkan PFSUV adalah partikel netral. Ukuran partikel dan morfologi PFSUV dikonfirmasi dalam mikroskopi elektron kriotransmisi (cryo-TEM) ( Gambar 1 A ), yang menampilkan struktur vesikular unilamelar (SUV) kecil. Kepadatan elektron yang meningkat divisualisasikan dalam inti berair PFSUV-IMQ, yang menunjukkan enkapsulasi IMQ. Eksperimen pelepasan obat in vitro dalam rasio 1:4 (v/v) PFSUV-IMQ dalam serum sapi janin pada suhu 37 °C menunjukkan retensi obat yang stabil selama 2 jam dengan kebocoran obat <10%. (Gambar S1 , Informasi Pendukung) Ini menunjukkan IMQ tertahan secara stabil dalam PFSUV dalam serum setidaknya selama 2 jam. PFSUV juga ditemukan sangat spesifik untuk hati setelah injeksi intravena (iv). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1B , dalam waktu 30 menit, PFSUV yang diberi tag fluoresensi (DiR-PFSUV) secara efektif terakumulasi di hati, sementara penyerapan oleh jaringan lain minimal. Untuk memvisualisasikan distribusi DiR-PFSUV di organ, limpa, ginjal, hati, dan otak dikeluarkan, difiksasi, dan divisualisasikan di bawah sistem pencitraan in vivo (IVIS) satu hari pasca injeksi. Sinyal DiR tertinggi ditemukan di hati dengan rata-rata radiansi 3,7x lebih tinggi daripada limpa, 11,1x lebih tinggi daripada ginjal, dan rata-rata radiansi 45,4x lebih tinggi daripada otak. (Gambar 1C,D ) Sementara ginjal memiliki sinyal rendah, tidak jelas apakah sinyal ini berasal dari DiR-PFSUV atau ekskresi DiR bebas. Untuk menentukan sel mana di hati yang berkontribusi terhadap penyerapan PFSUV, sampel hati dikumpulkan 2 jam pasca-injeksi, dipotong dan diwarnai dengan FITC-Phalloidin dan DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole). untuk membedakan hepatosit dan sel sinusoidal berdasarkan morfologi inti dan selularnya yang berbeda. PFSUV-DiR ditemukan diserap secara selektif oleh hepatosit (ditandai dengan tanda panah pada Gambar 1E), dengan 60% hepatosit menunjukkan penyerapan DiR sedangkan hanya 12% sel sinusoidal yang positif dengan DiR. Mekanisme kerja selektif ini unik dibandingkan dengan formulasi nanopartikel lain yang umumnya dibersihkan oleh sel sinusoidal, seperti sel Kupffer. Untuk menyelidiki apakah penargetan spesifik PFSUV-IMQ ini akan menghasilkan efek stimulasi imun lokal, kami memberikan formulasi pada 1 mg kg −1 iv dan menemukan bahwa sementara IMQ bebas dan PFSUV-IMQ menginduksi kadar IFN- α yang sebanding di hati (Gambar 1F ), IMQ bebas memicu paparan plasma IFN- α dua kali lipat lebih tinggi (area di bawah kurva = 14180 ± 4961 mg*h/L vs 7266 ± 1545 mg*h/L). IFN- α adalah sitokin perangsang imun poten yang dapat mengubah lingkungan mikro tumor imunosupresif (TME) menjadi lingkungan aktif imun, tetapi juga menyebabkan efek samping yang signifikan. Data menunjukkan risiko keamanan yang berkurang dari pengiriman IMQ spesifik hati menggunakan PFSUV (Gambar 1G ). Karena sel dendritik merupakan sumber utama sekresi IFN -α dan mampu matang setelah terpapar interferon tipe I dan sitokin, kami juga menilai kemampuan PFSUV-IMQ untuk mengaktifkan DC 2.4 secara in vitro. (Gambar S2 , Informasi Pendukung) Kami menemukan bahwa paparan PFSUV-IMQ selama 24 jam menghasilkan persentase sel yang mengekspresikan CD80 dan CD86 secara signifikan lebih tinggi dibandingkan dengan IMQ bebas dan kontrol relevan lainnya, yang menunjukkan peningkatan presentasi antigen. Ketika melihat kontrol kami, kami menemukan bahwa DMSO (0,1%) dan PFSUV kosong menunjukkan beberapa aktivasi DC 2.4. DMSO sebelumnya telah diamati untuk menginduksi tingkat minor aktivasi monosit yang konsisten dengan temuan kami. [ 23 ] PFSUV kosong juga ditemukan untuk mengaktifkan DC 2.4s, namun pada tingkat yang lebih rendah, dan kami menduga bahwa ini adalah karena adanya Tween80 dalam formulasi, yang juga telah terbukti memiliki efek imunogenik minor. [ 24 ] Perlu juga dicatat bahwa karena IMQ hanya larut dalam DMSO tetapi tidak dalam air atau pelarut suntik lainnya, formulasi IMQ bebas ini tidak dapat digunakan secara klinis tetapi hanya berfungsi sebagai kontrol dalam penelitian ini. Faktanya, IMQ yang disetujui secara klinis berada dalam bentuk sediaan krim topikal untuk mengobati lesi kulit lokal, termasuk kutil kelamin, karsinoma sel skuamosa in situ, karsinoma sel basal, dan keratosis aktinik karena keterbatasan kelarutan dan selektivitas yang buruk. Selain itu, kadar IFN- α dipertahankan sepanjang periode 24 jam di dalam hati pada kelompok yang diobati PFSUV-IMQ, menunjukkan potensi signifikan untuk kemanjuran imunoterapi.

Gambar 1
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Karakterisasi PFSUV-IMQ. A) Ukuran dan morfologi dievaluasi dengan mikroskopi elektron kriotransmisi (cryo-TEM). B) Biodistribusi DiR-PFSUV pada tikus setelah injeksi intravena menggunakan sistem pencitraan in-vivo (IVIS). C) Biodistribusi otak, limpa, hati, dan ginjal yang diambil dari tikus dengan DiR-PFSUV yang disuntikkan secara intravena atau tanpa DiR (B) Kuantifikasi rata-rata radiansi dari berbagai organ. E) Penyerapan DiR-PFSUV (merah) di hati. Hepatosit (ditunjukkan oleh anak panah (2, kuning)) dan sel sinusoidal (ditunjukkan oleh anak panah (1)) di hati dapat dibedakan berdasarkan morfologi seluler (pewarnaan Phalloidin, hijau) dan nukleus (pewarnaan DAPI, biru). F) Kadar IFN- α plasma dan hati setelah tikus disuntik iv dengan PFSUV-IMQ atau IMQ bebas pada 1 mg kg −1 (n = 4). G) Luas di bawah kurva kadar IFN- α plasma tikus yang diberi PFSUV-IMQ atau IMQ bebas pada 1 mg kg −1 (n = 4). Data disajikan sebagai rata-rata ± rata-rata kesalahan standar (SEM). Statistik dilakukan menggunakan uji-t tak berpasangan (****, p<0,0001, **, p<0,01, *, p<0,05).
2.2 Efikasi dalam Model Metastasis Kanker Kolorektal ke Hati
Untuk menilai efikasi formulasi kami dalam model metastasis hati, tikus diinokulasi secara bedah dengan 2 × 105 sel CT26-luc dalam 10 µL Matrigel ke dalam hati. Pada Hari ke-4, tikus diberikan suntikan ip Oxaliplatin (Oxa) pada 6 mg kg −1 , dan kemudian PFSUV-IMQ pada 1 mg kg −1 diberikan secara iv pada Hari ke-5, 7, 9, 11, 13, dan 15 ( Gambar 2A ) . Oxaliplatin (Oxa) diberikan secara intraperitoneal (ip). karena tantangan dalam memberikan lebih dari 6 suntikan iv pada satu tikus. Pada Hari ke-16, tikus di-eutanasia, tumor hati dipanen, dan pengukuran volume dilakukan menggunakan jangka sorong. Volume tumor ditemukan menurun secara signifikan pada kelompok yang diobati PFSUV-IMQ dibandingkan dengan kontrol, sebanyak 11 kali lipat (Gambar 2B ). Sementara analisis statistik tidak menghasilkan signifikansi ketika membandingkan ukuran tumor dari PFSUV-IMQ dengan Oxa saja, dan kelompok IMQ bebas karena variasi data yang besar, ukuran tumor rata-rata menurun sebanyak 8,8 kali lipat dibandingkan dengan kelompok Oxa saja, dan 9,3 kali lipat dibandingkan dengan kelompok IMQ Bebas. Kelompok Oxa saja dan Oxa+IMQ Bebas tidak menunjukkan pertumbuhan tumor CT26 yang ditekan di hati. Pewarnaan terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) menunjukkan persentase sel apoptotik yang lebih tinggi pada kelompok yang diobati PFSUV-IMQ (Gambar 2C ) dibandingkan dengan Oxaliplatin saja (peningkatan 4,2 kali lipat), kontrol IMQ bebas (peningkatan 2,4 kali lipat), dan kontrol yang tidak diobati (peningkatan 3,4 kali lipat) (Gambar 2D ). Hasilnya sebanding dengan data ukuran tumor pada Gambar 2A , yang menunjukkan bahwa hanya Oxa+PFSUV-IMQ yang menginduksi apoptosis signifikan pada tumor, sementara efek dari perawatan lain, termasuk Oxa saja dan Oxa+Free IMQ tidak signifikan. Pewarnaan imunohistokimia (IHC) mengungkapkan bahwa tumor tikus yang dirawat dengan PFSUV-IMQ memiliki persentase sel T CD8+ yang secara signifikan lebih tinggi (Gambar 2E ), dengan peningkatan 2,9 kali lipat relatif terhadap kelompok yang tidak dirawat dan peningkatan 3,2 kali lipat relatif terhadap Oxa saja. Namun, perbedaan antara Oxa+PFSUV-IMQ dan Oxa+Free IMQ dalam filtrasi sel T CD8+ tidak signifikan (Gambar 2F ). Untuk mengesampingkan kemungkinan bahwa efikasi antitumor sebagian disebabkan oleh sitotoksisitas IMQ, kami memeriksa sitotoksisitas Oxa, Oxa+PFSUV-IMQ dan Oxa+Free IMQ terhadap sel CT26 dan HepG2. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar S4(Informasi Pendukung), baik Free IMQ maupun PFSUV-IMQ tidak bersifat sitotoksik pada kedua lini sel itu sendiri, dan tidak pula meningkatkan sitotoksisitas Oxa saat dikombinasikan dalam berbagai konsentrasi. Hal ini menegaskan bahwa aktivitas antitumor PFSUV-IMQ dimediasi melalui respons imun. Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahwa pengobatan menggunakan PFSUV-IMQ dalam kombinasi dengan Oxa menurunkan beban tumor dengan meningkatkan infiltrasi sel T CD8+ dan sel apoptotik dalam tumor.

Gambar 2
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Khasiat Oxa saja, Oxa + IMQ bebas, dan Oxa+PFSUV-IMQ dalam model metastasis hati pada kanker kolorektal. A) Skema eksperimen. B) Volume tumor dalam kelompok perlakuan yang berbeda pada titik akhir eksperimen. C) Pewarnaan TUNEL pada tumor yang dipanen pada titik akhir eksperimen. D) Kuantifikasi pewarnaan TUNEL. E) Imunohistokimia infiltrasi sel T CD8+ pada tumor yang dikumpulkan pada titik akhir eksperimen. F) Kuantifikasi infiltrasi sel T CD8+ ke dalam tumor. Data disajikan sebagai mean ± standard error mean (SEM). Statistik dilakukan menggunakan ANOVA satu arah dengan beberapa perbandingan Tukey sebagai uji post-hoc. (****, p<0,0001. ***, p<0,001. **, p<0,01. *, p<0,05).
2.3 Efektivitas dalam Model Kanker Hati Primer
Kami kemudian menguji apakah PFSUV-IMQ memiliki khasiat antikanker pada model tikus kanker hati primer dengan kecenderungan bermetastasis ke paru-paru. Kelompok kontrol dalam percobaan ini berisi tikus yang tidak diobati, hanya Oxa, serta Oxa+IMQ bebas. Untuk mengembangkan model, tikus C3H diinokulasi dengan sel kanker hati HCA-1. Setelah 10 hari, suntikan Oxa 6 mg kg −1 ip diberikan kepada semua kelompok eksperimen selain yang tidak diobati. Pada Hari ke-11, 13, 15, 17, 19, dan 21, tikus dalam kelompok IMQ bebas atau kelompok PFSUV-IMQ menerima 1 mg kg −1 dari setiap pengobatan iv Pada Hari ke-24, tumor tikus dan jaringan paru-paru dipanen dan diproses untuk analisis ( Gambar 3 A ). Volume tumor pada Hari ke-24 ditemukan menurun secara signifikan pada tikus yang diobati dengan Oxa+PFSUV-IMQ relatif terhadap kontrol Oxa (2,6 kali lipat), dan kontrol tanpa pengobatan (4,4 kali lipat) (Gambar 3B ). Meskipun tidak ada perbedaan statistik, volume tumor rata-rata pada kelompok Oxa+PFSUV-IMQ 1,7 kali lipat lebih kecil daripada kelompok Oxa+IMQ bebas. Tikus yang diobati dengan PFSUV-IMQ juga menunjukkan perlindungan signifikan terhadap nodul paru metastasis, sedangkan semua tikus lain yang diobati mengalami metastasis. Tikus yang diobati dengan PFSUV-IMQ mengalami penurunan signifikan 11,8 kali lipat, 10,8 kali lipat, dan 7 kali lipat dalam jumlah rata-rata nodul paru dibandingkan dengan kelompok IMQ yang tidak diobati, hanya Oxa, dan Oxa+bebas. Pewarnaan imunofluoresens TUNEL juga mengungkap lebih banyak sel apoptotik pada tumor hati yang diobati dengan PFSUV-IMQ dibandingkan dengan tikus yang diberi IMQ gratis (peningkatan 3,9 kali lipat), hanya Oxa (peningkatan 8,6 kali lipat), dan tikus yang tidak diobati (peningkatan 55,3 kali lipat) (Gambar 3E,F ). Data ini menunjukkan bahwa Oxa+PFSUV-IMQ lebih efektif dalam menginduksi apoptosis pada tumor hati C3H dibandingkan dengan pengobatan lain, yang menyebabkan penurunan ukuran tumor hati primer dan metastasis ke paru-paru.

Gambar 3
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Khasiat Oxa saja, Oxa + IMQ bebas, dan Oxa+PFSUV-IMQ pada model tikus kanker hati primer. A) Skema eksperimen. B) Volume tumor hati primer pada kelompok perlakuan berbeda diukur menggunakan jangka sorong pada Hari ke-24. C) Gambar pewarnaan hemotoxylin dan eosin pada paru-paru yang dikumpulkan dari tikus dengan perlakuan berbeda pada Hari ke-24. D) Kuantifikasi nodul tumor pada paru-paru pada Hari ke-24. E) Pewarnaan TUNEL pada tumor hati yang dikumpulkan pada Hari ke-24. F) Kuantifikasi sel positif TUNEL pada tumor hati yang dikumpulkan pada Hari ke-24. Data disajikan sebagai mean ± standard error mean (SEM). Statistik dilakukan menggunakan ANOVA satu arah dengan beberapa perbandingan Tukey sebagai uji post-hoc. (****, p<0,0001. ***, p<0,001. **, p<0,01. *, p<0,05).
2.4 PFSUV-IMQ Meningkatkan Infiltrasi Sel Dendritik Aktif dan Sel T CD8+ Sitotoksik ke dalam Tumor Hati
Berikutnya, kami meneliti perubahan dalam sel imun yang menyusup ke dalam tumor hati HCA-1 setelah berbagai perawatan yang dijelaskan dalam Gambar 3A . Sementara persentase sel dendritik yang menyusup (CD45+/CD11c+) tetap relatif sama antara kelompok perawatan, peningkatan 1,7 kali lipat dalam persentase sel dendritik yang diaktifkan (CD86+, MHCII+) dalam tumor diamati dalam kelompok Oxa+PFSUV-IMQ, sementara Oxa saja dan Oxa+IMQ bebas tidak menunjukkan efek seperti itu ( Gambar 4 ). Sel dendritik (DC) adalah sel penyaji antigen profesional, dan bertindak sebagai penghubung antara sistem imun bawaan dan adaptif. Aktivasi dan peningkatan populasi ini menunjukkan bahwa lingkungan mikro imun tumor (TIME) terpolarisasi menuju fenotipe yang lebih aktif secara imun. Sel T sitotoksik yang menyusup (CD3+, CD8+) juga meningkat secara signifikan pada kelompok yang diobati dengan Oxa+PFSUV-IMQ sebanyak 1,7 kali lipat dibandingkan dengan kelompok yang hanya diberi Oxa, dan 2,1 kali lipat dibandingkan dengan kelompok yang tidak diobati. Selain itu, persentase sel T CD8+ yang diaktifkan (IFNγ+) meningkat secara signifikan sebanyak 2,4 kali lipat relatif terhadap kontrol yang tidak diobati. Tidak ditemukan manfaat awal TME seperti itu pada kelompok pengobatan lain, termasuk hanya Oxa dan IMQ bebas Oxa+. Sementara sel T regulator dan sel T CD4+ juga diperiksa melalui flow cytometry, tidak ada signifikansi antar kelompok yang dapat diamati (Gambar S5 , Informasi Pendukung). Dengan memeriksa jenis sel imun yang menyusup ke dalam tumor, kita dapat menyimpulkan bahwa Oxa+PFSUV-IMQ meningkatkan aktivasi DC dan presentasi MHC-II. Hal ini kemudian meningkatkan persentase sel T CD8+ yang mensekresi IFNγ aktif yang menyusup untuk pembersihan tumor. Peningkatan signifikan dalam sel T CD8+ konsisten dengan pewarnaan yang diamati dalam IHC (Gambar 2E,F ). Secara keseluruhan, data flow cytometry menunjukkan peningkatan aktivasi imun dalam lingkungan mikro imun tumor setelah pengobatan menggunakan PFSUV-IMQ. Peningkatan regulasi DC CD86+/MHCII+ menunjukkan peningkatan presentasi antigen dan pelatihan sel T CD8+ sitotoksik, yang dipastikan juga meningkat secara signifikan. Kurangnya perubahan dalam populasi sel regulator T menegaskan bahwa TIME tumor hati ini tetap imunosupresif pada tingkat tertentu meskipun telah diobati. Namun, karena penyusutan tumor diamati, pengobatan Oxa+PFSUV-IMQ ini dapat ditingkatkan lebih lanjut dengan mengoptimalkan dosis atau rejimen dosis.

Gambar 4
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Infiltrasi tumor HCA-1 pada sel dendritik, sel dendritik aktif, sel T CD8+ dan sel T IFNγ+ CD8+ setelah berbagai perawatan pada Hari ke-24 dinilai melalui flow cytometry. Data disajikan sebagai rata-rata ± rata-rata kesalahan standar (SEM). Statistik dilakukan menggunakan ANOVA satu arah dengan beberapa perbandingan Tukey sebagai uji post-hoc. (**, p<0,01. *, p<0,05).
2.5 Pada Dosis Tunggal, PFSUV-IMQ Meningkatkan Aktivasi Sel Imun Bawaan di Nodul Tumor
Bahasa Indonesia: Untuk lebih memahami cara kerja PFSUV-IMQ, kami melakukan analisis RNA-seq untuk menangkap perubahan dalam lingkungan mikro imun tumor dengan fokus pada gen imunomodulasi. Tikus C3H ditanamkan tumor hati HCA-1, dan dosis tunggal PFSUV-IMQ (4 mg kg −1 ) diberikan iv pada hari ke-17 setelah penanaman. Pada 3 jam pasca pengobatan PFSUV-IMQ, tumor dipanen dan dikirim untuk analisis NGS ( Gambar 5A ) . Titik waktu ini dipilih karena dalam analisis IFN- α kami di hati, kami menemukan bahwa kadar mencapai puncaknya sekitar 1 jam dan bertahan hingga 3 jam dan mulai turun setelah 5 jam. Karena IFN- α adalah sitokin penting untuk aktivasi imun dini, kami ingin memvisualisasikan perubahan dalam transkriptom sebelum kadar ini turun. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5B , 591 gen ditemukan mengalami peningkatan regulasi sedangkan 128 ditemukan mengalami penurunan regulasi. Di antara gen yang mengalami peningkatan regulasi relatif terhadap tikus kontrol, gen yang terkait dengan aktivasi imun bawaan seperti Ifit1, Ifit3, Mx1 dan Mx2, Ifit3b, Isg15, Cxcl10, Cmpk2, Ifit1bl1 dan Rsad2 diidentifikasi. Ekspresi Ifit1 dan Ifit3 sering dikaitkan dengan respons anti-virus, dan semua gen lainnya biasanya mengalami peningkatan regulasi sebagai respons terhadap interferon. Karena IMQ mengaktifkan TLR7, sensor untuk infeksi virus, peningkatan regulasi gen tersebut menunjukkan keberhasilan pengiriman IMQ ke tumor menggunakan PFSUV. Proses biologis yang ditemukan diperkaya melalui analisis Gene Ontology (GO) mencakup respons terhadap Interferon beta, proliferasi sel pembunuh alami dan aktivasi respons imun bawaan (Gambar 5C ). Sel pembunuh alami biasanya ditemukan dalam tumor ketika MHC Kelas I mengalami penurunan regulasi, yang merupakan teknik penghindaran imun yang umum. Pengayaan jalur ini setelah pemberian menunjukkan bahwa titik waktu yang dipilih adalah awal penyebaran respons imun terhadap tumor. Sementara aktivasi sel T alfa beta positif CD8 juga diperkaya, titik waktu 3 jam kemungkinan juga terlalu dini untuk menilai respons imun adaptif yang signifikan. IMQ diketahui menginduksi pelepasan interferon alfa melalui jalur TLR7 dan MyD88, sehingga pengayaan jalur ini juga diharapkan. Baik jalur pensinyalan TLR3 maupun TLR4 juga ditemukan meningkat dalam analisis ini. Sementara IMQ adalah agonis TLR7, ada kemungkinan bahwa peradangan keseluruhan yang dihasilkan oleh keberadaannya berperan dalam pelepasan antigen yang memicu aktivasi TLR3 dan TLR4. Aktivasi jalur TLR ini dapat melepaskan faktor-faktor yang menekan proliferasi kanker dan menarik sel T dan sel pembunuh alami untuk meningkatkan efek antikanker secara keseluruhan. [ 25 ]Transduksi sinyal NF-κB, gen yang dapat diinduksi asam retinoat (RIG-1), dan jalur pensinyalan yang dimediasi inflammasome juga mendukung hipotesis respons imun yang diaktifkan. Fungsi RIG-1 terletak pada penginderaan RNA virus untuk memicu respons inflamasi melalui pelepasan interferon tipe I dan sitokin. [ 26 ] RIG-1 juga merupakan regulator positif untuk pensinyalan NF-κB, yang selanjutnya dapat berkontribusi pada pengayaan jalur aktivasi inflammasome. Secara keseluruhan, gugus pengayaan jalur ini menunjukkan bahwa PFSUV-IMQ menstimulasi TLR yang mengaktifkan pensinyalan NF-κB, menghasilkan transkripsi interferon tipe I dan sitokin seperti TNF- α . Ini mungkin menghasilkan perkembangan inflammasome dan priming respons imun adaptif. Sementara titik waktu mungkin terlalu dini untuk menilai respons imun adaptif dengan baik, jalur aktivasi sel T alfa beta positif CD8 dan pensinyalan kematian sel terprogram yang dimediasi granzim sedikit diperkaya, yang menunjukkan ada peningkatan sel T CD8+ yang mensekresi granzim. Semua jalur Proses Biologis Gene Ontology (GOBP) dirangkum dalam Tabel 1. Hasil ini berkorelasi baik dengan peningkatan infiltrasi tumor dari DC yang diaktifkan dan sel T CD8+ yang ditunjukkan pada Gambar 4. Setelah pemberian PFSUV-IMQ, jalur aktivasi imun bawaan ditemukan meningkat secara signifikan dalam RNA-seq, yang cocok dengan peningkatan IFN- α yang diamati di hati (Gambar 1F ). Karena sel dendritik dihipotesiskan sebagai pendorong utama di balik sekresi interferon tipe 1 dan ditemukan diperkaya dalam tumor setelah pemberian obat, kami memvalidasi aktivasi DC 2.4 oleh PFSUV-IMQ dalam kultur sel. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar S2 (Informasi Pendukung), peningkatan DC 2.4 ditemukan mengekspresikan CD80 dan CD86 ketika diobati dengan PFSUV-IMQ, yang menunjukkan bahwa pengobatan ini efektif dalam meningkatkan kemampuan penyajian antigen sel-sel ini melalui aktivasi TLR7. Secara keseluruhan, pensinyalan TLR7 dimulai ketika TLR merasakan IMQ, yang kemudian memicu kaskade melalui jalur dependen MyD88, yang menghasilkan peningkatan sekresi interferon dan sitokin. Aktivasi TLR7 juga mengakibatkan peningkatan regulasi protein pematangan DC seperti CD80/CD86. [ 27 ] Karena CD80/CD86 adalah molekul ko-stimulator yang mengaktifkan CD28 pada sel T sitotoksik, DC yang diaktifkan ini dapat menyajikan antigen ke sel T CD8+, sehingga mengaktifkannya (IFN-y+) untuk pembunuhan spesifik tumor. [ 28 ] (Gambar 4) Penting untuk dicatat bahwa mekanisme PFSUV-IMQ berbeda dari imunoterapi yang ada seperti inhibitor titik pemeriksaan imun (ICIs) karena PFSUV-IMQ mengaktifkan DC dalam tumor untuk menyajikan antigen ke sel T CD8+. Berdasarkan RNA-seq, kami mengamati modulasi lingkungan mikro imun tumor dari fenotipe imunosupresif menjadi fenotipe aktif-imun. ICI yang tersedia saat ini hanya berfokus pada pemblokiran interaksi negatif antara sel T dan sel kanker, oleh karena itu, kami memperkenalkan mekanisme imunoterapi baru melalui PFSUV-IMQ. Secara keseluruhan, analisis NGS menunjukkan peningkatan ekspresi gen inflamasi dini pada tumor tikus yang diobati relatif terhadap kontrol yang tidak diobati. Hasilnya konsisten dengan data flow cytometry, di mana sel dendritik ditemukan diaktifkan setelah pengobatan PFSUV-IMQ. Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahwa PFSUV-IMQ efektif dalam mengubah lingkungan mikro imun tumor dari imunosupresif menjadi imunoaktif, sehingga memfasilitasi penurunan volume tumor secara keseluruhan. Karena mekanisme imunologi PFSUV-IMQ berbeda dari imunoterapi yang disetujui, seperti ICI, terapi baru ini dapat bersinergi dengan obat-obatan yang ada untuk meningkatkan kemanjuran.

Gambar 5
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Data RNA-seq pada tumor hati HCA-1 3 jam setelah dosis tunggal PFSUV-IMQ. A) Skema pengobatan untuk pengambilan sampel RNA-seq. B) Plot gunung berapi untuk gen yang mengalami peningkatan dan penurunan regulasi pada tumor yang diobati dengan PFSUV-IMQ dibandingkan dengan kontrol yang tidak diobati. C) Analisis Gene Ontology dari PFSUV-IMQ dibandingkan dengan kontrol yang tidak diobati. D) Peta panas RNA-seq.
Tabel 1. Analisis jalur Proses Biologi Gene Ontology (GOBP) mengungkapkan ekspresi diferensial jalur regulasi imun bawaan dan adaptif pada tumor HCA-1 murine yang diobati dengan PFSUV-IMQ dibandingkan dengan yang tidak diobati.

3 Kesimpulan
Singkatnya, PFSUV dimuat dengan IMQ, agonis TLR7 yang biasanya tidak larut untuk pemberian sistemik. Formulasi ini menunjukkan selektivitas hati dan hepatosit yang kuat dan mengaktifkan respons imun di hati secara berbeda. Pemberian PFSUV-IMQ intravena menghasilkan kadar IFN- α yang berkelanjutan di hati dengan kadar plasma yang jauh lebih rendah dibandingkan dengan IMQ bebas. Ketika diuji dalam kombinasi dengan kemoterapi Oxa pada model tikus metastasis hati dari kanker kolorektal, tumor ditemukan berkurang secara signifikan dalam volume dengan peningkatan sel apoptosis dan sel T CD8+ yang menyusup. Dalam model tikus kanker hati, kombinasi PFSUV-IMQ dengan Oxa juga menunjukkan penurunan beban tumor, serta kontrol yang lebih unggul untuk metastasis paru-paru. Flow cytometry dan RNA-seq tumor setelah pemberian PFSUV-IMQ mengungkapkan peningkatan yang signifikan dalam DC yang diaktifkan dan sel T CD8+ yang diaktifkan dalam tumor serta peningkatan ekspresi gen yang menunjukkan aktivasi imun bawaan. Secara keseluruhan, pemberian IMQ sistemik menggunakan PFSUV menunjukkan penyetelan TIME yang spesifik dan pengurangan beban tumor hati.

4 Bagian Eksperimen
Persiapan dan Karakterisasi Vesikel Unilamelar Kecil Bebas Fosfolipid (PFSUV)
PFSUV yang mengandung kolesterol dan Tween80 disiapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya. [ 22 ] Kolesterol dan Tween80 (rasio molar 5:1) dilarutkan dalam etanol (total lipid 10 mg/mL) dan dicampur dengan 250 mM amonium sulfat pada rasio alir 1:3 dan laju alir total 20 mL min −1 pada suhu ruangan menggunakan NanoAssemblr Benchtop (Precision Nanosystems, Vancouver, BC, Kanada). Partikel dikumpulkan dan didialisis semalaman terhadap buffer natrium asetat 100 mM (pH 5) untuk menghilangkan etanol. Ukuran partikel, PDI, dan potensi zeta PFSUV diukur dengan hamburan cahaya dinamis menggunakan Zetasizer NanoZS (Malvern Instruments, Malvern, Inggris).

Imiquimod (IMQ) Memuat
IMQ secara aktif dimuat ke dalam PFSUV menggunakan teknik pemuatan berbantuan pelarut (SALT). [ 29 ] IMQ dilarutkan dalam DMSO dan dicampur dengan PFSUV pada rasio obat terhadap lipid 1/5 (b/b). Konsentrasi akhir DMSO dalam campuran tersebut <10% (v/v). Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37 °C selama 1 jam dan didinginkan dalam es selama 2 menit. Formulasi selanjutnya didialisis terhadap HEPES (asam 4-(2-hidroksi etil)-1-piperazineetansulfonat) larutan penyangga garam (HBS, pH 7,4) semalaman. Untuk pengukuran Kromatografi Cair Kinerja Ultra Tinggi (UPLC), 15 µL PFSUV dicampur dengan 45 µL etanol dan disonikasi selama 5 menit, diikuti dengan penyuntikan 10 µL sampel untuk analisis.

Krio-TEM
PFSUV kosong dan PFSUV-IMQ (25 mg lipid/mL) ditambahkan ke kisi tembaga bermuatan cahaya menggunakan FEI Mark IV Vitrobot (FEI, Hillsboro, OR, AS). Pencitraan dilakukan menggunakan mikroskop Glacios 200 kV yang dilengkapi dengan kamera Falcon III di fasilitas Mikroskopi Krio-Elektron Makromolekul Resolusi Tinggi UBC (Vancouver, BC, Kanada).

Kromatografi Cair Kinerja Ultra (UPLC)
Konsentrasi IMQ diukur menggunakan Sistem ACQUITY UPLC Kelas-H (Waters, Milford, MA) yang disambungkan secara daring ke detektor susunan fotodioda (PDA) (panjang gelombang 320 nm). Kolom BEH-C18 (diameter dalam: 2,1 mm; panjang: 100 mm; ukuran partikel: 1,7 m, Waters) digunakan untuk pemisahan dengan fase gerak gradien yang mengandung campuran eluen A dan B (masing-masing 0,1% TFA berair dan 0,1% TFA dalam metanol) pada laju alir 0,3 mL menit -1 . Gradien yang digunakan adalah sebagai berikut: 0 menit: A/B (95/5); 2 menit: A/B (95/5); 8 menit: A/B (0/100); 11 menit: A/B (0/100); 11,1 menit: A/B (95/5); 13 menit: A/B (95/5). Konsentrasi lipid ditentukan menggunakan metode kromatografi yang sama bersama dengan detektor hamburan cahaya evaporatif (ELS).

Tikus
Untuk studi distribusi jaringan dan stimulasi sitokin, tikus betina CD-1 (18–20 g, usia 5–6 minggu) dibeli dari The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Studi in vivo ini dilakukan sesuai dengan protokol yang ditetapkan (A22-0141) yang disetujui oleh Animal Care Committee dari University of British Columbia (Vancouver, BC, Kanada). Untuk model tikus metastasis hati dari asal kanker kolorektal, tikus jantan BALB/c (usia 4-5 minggu, 18–20 g) dibeli dari Japan SLC (Shizuoka, Jepang). Semua percobaan hewan dilakukan dengan persetujuan dari Animal and Ethics Review Committee dari Tokushima University (Disetujui No. T2022–36). Untuk studi model kanker hati primer, tikus jantan C3H/HeNCrNarl (usia 4–6 minggu, 25 g) dibeli dari National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan). Semua hewan menerima perawatan yang manusiawi, sesuai dengan “Panduan Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium” yang diterbitkan oleh National Academy of Sciences. Semua percobaan pada hewan dilakukan sesuai dengan protokol yang ditetapkan (Protokol #109074), yang disetujui oleh Komite Penelitian Hewan Universitas Nasional Tsing Hua.

Stimulasi Sitokinin di Hati
PFSUV-IMQ diberikan secara intravena dengan dosis 1 mg kg −1 ke tikus betina CD-1. Darah dan hati dikumpulkan pada menit ke-30, 1 jam, 3 jam, 5 jam, dan 24 jam. Setelah dikumpulkan, darah dipindahkan ke tabung berlapis EDTA (asam etilendiamin triasetat) dan dipisahkan menjadi plasma melalui sentrifugasi selama 10 menit pada 500 xg pada suhu 4 °C. Hati tikus dikumpulkan setelah eutanasia dan dicuci dua kali dengan PBS, dikeringkan, dan ditimbang (≈0,5 g) ke dalam tabung mikro 1,5 mL (Next Advance, Inc., Troy, NY, AS). Campuran penghambat protease dalam PBS (pengenceran 1:100 v/v, Sigma Aldrich) ditambahkan ke jaringan (0,3 mL per 0,1 g jaringan) dan dihomogenkan pada suhu 4 °C selama 5 menit menggunakan blender homogenizer jaringan Bullet (Next Advance, Inc., Troy, NY, AS) pada kecepatan instrumen 10. Sampel kemudian dikenakan analisis ELISA untuk kadar IFN- α sesuai dengan protokol pabrik (Thermofisher, Katalog # BMS6027).

Biodistribusi
Tikus CD-1 betina (18–20 g, umur 5–6 minggu) yang dibeli dari The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) disuntik iv dengan DiR-PFSUV pada dosis 0,3 µg g −1 . Tikus divisualisasikan menggunakan Sistem Pencitraan IVIS (Caliper Life Sciences, Waltham, MA) di bawah anestesi isoflurana yang diberikan melalui hidung pada 30 menit, 1 jam, 4 jam, dan 24 jam. Untuk biodistribusi organ, tikus CD-1 betina (31-39 g, umur 18–20 minggu) dibeli dari Charles River Laboratories (Senneville, QC, Kanada). DiR-PFSUV disuntikkan pada dosis 0,3 µg g −1 dan satu hari setelah injeksi, tikus disuntik mati, dan otak, hati, ginjal, dan limpa diambil, dicuci dengan PBS, dan disimpan dalam formalin 10% (v/v) dalam PBS semalaman pada suhu ruangan. Organ-organ tersebut kemudian dicitrakan menggunakan Sistem Pencitraan IVIS yang sama. Rata-rata radiansi diukur menggunakan Perangkat Lunak Living Image 3.1 (Caliper Life Sciences, Waltham, MA).

Ko-Lokalisasi Intrahepatik
PFSUV-DiR disuntikkan secara intravena ke tikus dengan dosis 0,3 µg DiR/g. Tikus kemudian disuntik mati 2 jam setelah penyuntikan dan hati diambil, dicuci dengan garam penyangga fosfat (PBS) dan kemudian disimpan dalam formalin 10% (v/v) dalam PBS pada suhu ruangan semalaman. Potongan jaringan 40 µm kemudian disiapkan dari hati yang difiksasi menggunakan vibratom (Precisionary Instruments LLC, Boston, MA). Potongan-potongan ini ditambahkan ke PBS dan diinkubasi dalam Triton X-100 0,1% (v/v) dalam PBS selama 5 menit, sebelum dicuci tiga kali dalam PBS dan kemudian diinkubasi dalam albumin serum sapi 1% (v/v) dalam PBS selama 10 menit. Potongan jaringan dicuci 3 kali dengan PBS lagi dan kemudian diinkubasi dalam Alexa Fluor 488 Phalloidin (APh, 80 µL, 1 U mL −1 ). Untuk menghilangkan pewarnaan berlebih, potongan jaringan dicuci lebih lanjut dengan PBS dan kemudian dipasang pada slide kaca dengan setetes Fluoroshield yang mengandung DAPI (Sigma–Aldrich). Mikroskop confocal (Zeiss LSM 700) pada perbesaran 20x dan dianalisis dengan perangkat lunak ZEN (keduanya Carl Zeiss, Oberkochen, Jerman).

Khasiat dalam Model Metastasis Hati dari Asal Kanker Kolorektal
Untuk mengembangkan model metastasis hati, tikus ditempatkan dalam posisi terlentang, dan sayatan kulit sepanjang 1 hingga 1,5 cm dibuat di dinding perut bagian atas, diikuti oleh sayatan sepanjang 1 cm di peritoneum untuk mengekspos hati. Sel CT26-Luc 2,0 × 105 dalam 10 µl 2:1 RPMI 1640/Matrigel (Corning, NY, AS)] disuntikkan dengan hati-hati di bawah permukaan lobus kiri hati. Tempat penyisipan ditutup dengan bahan hemostatik yang dapat diserap (SURGICEL, Johnson and Johnson, New Brunswick, NJ, AS). Hati dikembalikan ke dalam tubuh setelah injeksi, dan sayatan perut ditutup dalam 2 lapisan dengan benang bedah sutra 4-0 (Natsume Seisakusho, Tokyo, Jepang). Setelah 4 hari, tikus disuntik secara intraperitoneal (ip) dengan 6 mg kg −1 Oxaliplatin. Pada hari ke-5, 7, 9, 11, 13, dan 15, tikus disuntik iv dengan 1 mg kg −1 PFSUV-IMQ, 1 mg kg −1 IMQ bebas, atau salin. Selama percobaan, pertumbuhan tumor dipantau menggunakan luminesensi di mana 100 µL garam kalium D-luciferin 15 mg mL −1 (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Jepang) disuntikkan ip dan kemudian tikus dicitrakan pada IVIS (Xenogen, CA, AS). Tikus dikorbankan pada Hari ke-16 dan tumor dikumpulkan dan pengukuran volume dilakukan. Tumor kemudian difiksasi dalam formalin 10% (v/v) dalam PBS. Irisan hati yang tertanam dalam parafin, pewarnaan IHC untuk sel T CD8+, pewarnaan TUNEL, dan pencitraan mikroskopis dilakukan oleh Wax-it Histology Services Inc. (Vancouver, BC, Kanada). Analisis dan kuantifikasi gambar dilakukan menggunakan ImageJ.

Khasiat dalam Model Kanker Hati Primer
Model kanker hati primer dikembangkan seperti yang dijelaskan. [ 30 ] Setelah 10 hari, tikus disuntik ip dengan 6 mg kg −1 Oxa. Pada hari ke-11, 13, 15, 17, 19, dan 21, tikus disuntik iv dengan 1 mg kg −1 PFSUV-IMQ, 1 mg kg −1 IMQ bebas atau salin. Tikus dikorbankan pada Hari ke-24 dan tumor, dan paru-paru dikumpulkan. Pengukuran volume dilakukan pada tumor hati. Jaringan paru-paru dipotong menjadi potongan-potongan kecil dan difiksasi dalam 4% PFA (dalam PBS) semalaman sebelum ditanamkan dalam lilin parafin. Potongan-potongan itu kemudian diwarnai dengan pewarna imunofluoresen dan diamati dengan mikroskop terbalik (IX83, Olympus, Jepang).

Analisis Sitometri Aliran
Untuk mengevaluasi profil imun dalam model HCC ortotopik, tikus pada titik akhir dari studi efikasi di atas diperfusi dengan PBS melalui injeksi intrakardiak, diikuti oleh eutanasia. Tumor dicerna secara enzimatik pada suhu 37 °C selama 30 menit menggunakan kolagenase tipe 1A (1,5 mg mL −1 ) dan hialuronidase (1,5 mg mL −1 ) yang disiapkan dalam medium RPMI. Suspensi sel yang dihasilkan diwarnai dengan antibodi spesifik untuk analisis flow cytometry. Antibodi yang digunakan meliputi CD45-FITC (no. 30-F11), 7-AAD, CD11c-APC (no. 550261), CD86-PE-Cy7 (no. 560582), CD3e-APC (no. 145-2C11), CD8-PE-Cy7 (no. 53–6.7), CD16/CD32 BD Fc Block (no. 2.4G2), semuanya diperoleh dari BD Biosciences (CA); MHCII-APC-eflour780 (no. 47-5321-82) dari eBioscience (California, AS).

Untuk mendeteksi ekspresi IFN- γ pada sel T CD8, suspensi sel difiksasi dengan paraformaldehida 4%, dipermeabilisasi menggunakan larutan Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences), dan diwarnai secara intraseluler dengan IFN -γ -APC-Cy7 (no. 561479, BD Biosciences, California, AS) sesuai dengan petunjuk pabrik pembuatnya. Profil imun sampel tumor dilakukan menggunakan flow cytometer BD FACSAria III dan data dianalisis menggunakan perangkat lunak FACSDivaTM. Strategi gating untuk data flow cytometry ditunjukkan pada Gambar S3 (Informasi Pendukung).

Analisis Ekspresi Gen Pengurutan Generasi Berikutnya
Tikus C3H ditanamkan secara orthotopik dengan tumor HCA-1 seperti yang dijelaskan sebelumnya. Pada hari ke-17, tikus diberi salin atau 4 mg kg −1 PFSUV-IMQ pada dosis tunggal iv Setelah 3 jam, tikus di-eutanasia dan tumornya diambil untuk dianalisis. Sampel RNA diekstraksi dari kelompok perlakuan dan kontrol menggunakan RNeasy Kit (Qiagen), dan integritas sampel dinilai dengan kit uji RNA Nano6000 (Agilent Technologies, CA, AS). Persiapan dan pengurutan pustaka dilakukan oleh Biotools Co., Ltd. File FASTQ yang dihasilkan diselaraskan dengan genom referensi menggunakan TopHat v2.0.12, dan hitungan bacaan tingkat gen dihitung dengan HTSeq v0.6.1. Tingkat ekspresi gen ditentukan sebagai FPKM (Fragmen Per Kilobase transkrip per Juta bacaan yang dipetakan) berdasarkan panjang gen dan hitungan bacaan yang dipetakan.

Jumlah bacaan yang diperoleh dari sekuensing RNA digunakan untuk menghitung ekspresi gen. Analisis normalisasi dan ekspresi diferensial dilakukan masing-masing menggunakan edgeR (v3.28.1) dan DESeq2 (v1.26.0). Gen yang diekspresikan secara diferensial (DEG) diidentifikasi dengan edgeR menggunakan nilai-p dan ambang batas false discovery rate (FDR) <0,05. Peta panas ekspresi diferensial divisualisasikan melalui server web ClusVis, dan analisis pengayaan set gen (GSEA) diterapkan untuk menginterpretasikan variabilitas biologis. Data yang diproses diserahkan ke repositori Gene Expression Omnibus (GEO) dengan nomor akses GSE289163 (tanggal rilis GEO, 1 Maret 2025 ).

Analisis Statistik
Semua data disajikan sebagai mean ± SEM. Analisis statistik dilakukan dengan GraphPad Prism versi 8.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, AS). Perbandingan antar kelompok dilakukan dengan uji-t tak berpasangan dan ANOVA satu arah. Perbedaan dengan p < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.

Etika Hewan
Semua hewan menerima perawatan yang manusiawi, sesuai dengan “Panduan Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium” yang diterbitkan oleh National Academy of Sciences. Semua penelitian in vivo dilakukan sesuai dengan protokol yang ditetapkan (A22-0141) yang disetujui oleh Animal Care Committee dari University of British Columbia (Vancouver, BC, Kanada), protokol hewan (No. T2022-36) yang disetujui oleh Animal and Ethics Review Committee dari Tokushima University, atau protokol hewan (Protokol #109074) yang disetujui oleh Animal Research Committee dari National Tsing Hua University