Rekayasa Biologi Model Tumor Paru-paru Vaskularisasi yang Berasal dari Pasien pada Chip untuk Menguraikan Imunomodulasi oleh Endotelium

Abstrak
Kompartemen endotelium merupakan pemain kunci dalam inisiasi dan perkembangan tumor, tetapi sebagian besar model tumor-on-chip yang ada tidak memiliki relevansi klinis. Di sini, model tumor-on-chip (vToC) vaskularisasi 3D, yang dihasilkan dengan sel endotel mikrovaskular (EC) yang berasal dari pasien yang baru saja diisolasi dari sampel kanker paru-paru bedah, disajikan. Identitas molekuler, morfologi, dan fungsionalitas pembuluh darah mikro dinilai dengan uji transkriptomik, imunofluoresensi, stimulasi TNF-α, dan permeabilitas. Sel kanker paru-paru, fibroblas terkait kanker (CAF), dan limfosit CD8+ yang menyusup ke tumor ditanamkan ke dalam matriks kolagen di sekitarnya untuk merangkum sebagian lingkungan mikro tumor paru-paru (TME). Bukti konsep kelayakan untuk menghasilkan vToC imunokompeten yang dipersonalisasi yang terdiri dari jenis sel autolog primer sepenuhnya disediakan. Model vToC ini digunakan untuk menyelidiki interaksi antara EC dan komponen seluler TME lainnya dengan analisis transkriptomik. Dengan menggunakan panel gen endotel yang dirancang secara rasional, ditemukan bahwa keberadaan sel kanker dan CAF dalam lingkungan endotel menurunkan ekspresi protein adhesi leukosit VCAM-1 oleh sel-sel EC, pengatur penting infiltrasi imun, dan banyak kemokin imunomodulatori, yang merangkum anergi sel endotel. Model in vitro ini akan menjadi alat yang relevan secara klinis dan berharga untuk mempelajari interaksi tumor-CAF-imun-endotelium.

1 Pendahuluan
Dalam beberapa tahun terakhir, teknologi organ-on-a-chip (OoC) telah muncul sebagai alternatif yang menjanjikan untuk eksperimen hewan untuk rekapitulasi in vitro dari proses biologis utama dan untuk pengujian obat praklinis, dengan daya prediksi yang lebih besar jika dibandingkan dengan model kultur sel 2D konvensional. [ 1 ] Sistem OoC, juga disebut sistem mikrofisiologis, terdiri dari perangkat rekayasa mikro yang berisi matriks biomimetik 3D dan populasi sel hidup dengan fitur yang sesuai (identitas sel, kompartementalisasi, geometri, kepadatan sel, sifat kimia-fisik, rangsangan mekanis, dll.) yang memungkinkan rekapitulasi fungsi tingkat organ utama. Berdasarkan konsep yang sama, model tumor-on-chip (ToC) telah ditetapkan, [ 2 – 4 ] di mana fitur spesifik dari lingkungan mikro tumor manusia (TME) dapat diciptakan kembali dengan kontrol yang belum pernah terjadi sebelumnya. Teknologi ToC yang baru ini memiliki potensi besar untuk penelitian kanker, pengembangan terapi, pengujian kemanjuran obat, dan pengobatan presisi, serta memberikan solusi nyata terhadap masalah etika eksperimen pada hewan. [ 5 ]

Sel endotel (EC), yang membentuk lapisan dalam pembuluh darah, adalah komponen kunci TME dengan fungsi imunomodulatori yang penting. Endotelium tumor adalah penghalang fisik yang mengendalikan perekrutan sel imun ke tempat tumor. Perekrutan imun adalah proses multi langkah dan aktif yang diatur dengan baik oleh interaksi sel-ke-sel fisik antara sel imun dan EC, serta oleh interaksi sinyal sitokin/kemokin kompleks antara kompartemen imun, endotel, dan tumor. [ 6 ] Selain peran utamanya dalam mempromosikan perekrutan sel imun ke dalam jaringan saat peradangan, sel endotel dapat secara langsung mempromosikan imunosupresi dengan menurunkan ekspresi molekul adhesi (seperti E-selectin, VCAM-1, ICAM, VE-Cadherin) dan dengan melepaskan sitokin imunomodulatori spesifik (seperti IL6, [ 7 ] CXCL9, CXCL10, atau CXCL11 [ 8 ] ). Lebih jauh lagi, sel endotel mungkin mengekspresikan molekul yang memengaruhi kelangsungan hidup, fungsi, dan fenotipe sel imun (seperti ligan kematian FAS-L, enzim imunosupresif IDO-1 atau bahkan titik pemeriksaan imun, seperti PDL-1/2) dan oleh mekanisme lain yang telah disarankan oleh penjelasan molekuler terbaru dari heterogenitas EC [ 9 ] tetapi yang masih harus diuraikan oleh uji fungsional. Karena efek imunosupresif EC ini dapat menyebabkan resistensi terhadap imunoterapi, [ 10 , 11 ] kombinasi strategi anti-tumor yang menargetkan kompartemen vaskular dan blokade titik pemeriksaan imun saat ini sedang diselidiki dalam banyak uji klinis, dengan beberapa kombinasi yang baru-baru ini disetujui oleh Food and Drug Administration. [ 12 , 13 ]

Pembentukan model in vitro yang kuat sangat penting untuk mempelajari lebih lanjut fungsi imunomodulatori endotelium. Beberapa pendekatan telah diterapkan untuk mencapai vaskularisasi tumor-on-chip. Model ToC vaskularisasi (vToC) paling sederhana pertama menciptakan kembali antarmuka tumor-vaskular di dalam saluran mikro 3D, menggunakan pilar mikro [ 14 ] atau membran berpori. [ 15 ] Namun, geometri dan ukuran berbentuk persegi dari desain chip ini cukup jauh dari situasi in vivo. Pendekatan yang sangat elegan untuk menghasilkan lebih banyak pembuluh fisiologis in vitro memanfaatkan kapasitas perakitan mandiri alami EC untuk membentuk jaringan mikrovaskular yang dapat perfusi. [ 16 ] Namun, pengorganisasian mandiri EC hanya terjadi dalam matriks fibrin, tidak mewakili matriks ekstraseluler tumor, dan sebagai tambahan tidak mungkin untuk mengendalikan organisasi 3D dari jaringan mikrovaskular yang dihasilkan. Solusi kompromi untuk membuat mikro pembuluh pada chip adalah penggunaan jarum pemandu sebagai cetakan pengorbanan. [ 17 – 22 ] Meskipun pendekatan ini memungkinkan untuk menghasilkan mikrokanal linier sederhana tanpa tortuositas yang rumit, pendekatan ini menawarkan keuntungan besar dalam hal kontrol yang tepat terhadap bentuk bulat dan diameter pembuluh, penyemaian sel, perfusi lumen, dan komposisi matriks 3D. Dalam penelitian ini, kami memilih pendekatan teknologi ini untuk menghasilkan vToC kami.

Salah satu ambisi yang paling menarik di bidang ToC adalah pengembangan model yang andal untuk pengobatan yang dipersonalisasi, untuk memprediksi kemanjuran pengobatan bagi pasien kanker dan berkontribusi pada proses pengambilan keputusan klinis. Namun, model vToC saat ini masih kekurangan beberapa properti penting agar relevan secara klinis, terutama asal sel endotel yang tepat (yaitu, sel mikrovaskular dari organ yang diinginkan), lingkungan mikro seluler yang tepat (yaitu, kultur bersama dengan sel autolog yang berasal dari pasien yang sama), dan personalisasi (yaitu, EC yang secara khusus berasal dari setiap pasien). Faktanya, batasan utama adalah kesulitan yang terkenal untuk bekerja dengan EC primer. Sel endotel vena umbilikalis manusia (HUVEC) adalah sumber EC yang paling banyak digunakan sejauh ini. Menurut tinjauan komprehensif terbaru dari literatur ToC, sekitar 75% publikasi tentang vToC menggunakan HUVEC sebagai model sel endotel. [ 5 ] Namun, karena HUVEC berasal dari endotelium vena dari tali pusat, sel-sel ini merupakan sel makrovaskular dan tidak dapat dianggap sebagai model yang baik untuk sel-sel EC mikrovaskular TME. Sel-sel EC mikrovaskular sulit diisolasi dan dikultur, dan sangat mahal jika tersedia secara komersial.

Di sini, kami menggambarkan platform pembuluh pada chip tempat pembuluh mikro endotel tunggal dan perfusibel dihasilkan dalam matriks ekstraseluler kolagen, menggunakan sel-sel EC mikrovaskular yang berasal dari pasien yang baru saja diisolasi dari sampel kanker paru-paru bedah. Sel-sel kanker paru-paru (yang diabadikan atau primer), fibroblas terkait kanker (CAF), dan limfosit penginfiltrasi tumor CD8+ (TIL) tertanam dalam matriks kolagen untuk merekapitulasi sebagian TME paru-paru. Kami memanfaatkan tumor paru-paru yang divaskularisasi yang berasal dari pasien pada chip yang unik ini untuk menyelidiki fungsi imunomodulatori endotelium menggunakan pendekatan transkriptomik. Berkat pengendalian kondisi ko-kultur 3D, kami dapat menguraikan bagaimana komposisi seluler TME memengaruhi ekspresi diferensial gen imunomodulatori spesifik oleh sel-sel EC. Akhirnya, kami memberikan bukti konsep kelayakan untuk menghasilkan vToC imunokompeten yang dipersonalisasi yang terdiri dari empat jenis sel autologus, yang merupakan tonggak teknologi dan konseptual utama menuju model tumor-pada-chip yang relevan secara klinis.

2 Hasil
2.1 Implementasi Tumor Paru Vaskularisasi yang Berasal dari Pasien pada Chip
Untuk bioteknologi in vitro dari pembuluh mikro, kami menyusun desain chip baru yang menggabungkan dua aspek mikrofabrikasi: teknik pencetakan jarum untuk menghasilkan bukaan tubular dalam matriks 3D kolagen tipe I [ 17 – 22 ] dan dinding geser untuk membatasi gel kolagen [ 23 ] ( Gambar 1A dan S1 , Informasi Pendukung). Pilihan dinding geser mengatasi banyak keterbatasan dari pendekatan utama lainnya yang memungkinkan kontrol posisi hidrogel pada chip, seperti pendekatan berbasis aliran laminar atau berbasis kapiler. Secara khusus, dinding geser menawarkan antarmuka bebas hambatan sementara tidak sensitif terhadap viskositas hidrogel pra-polimer, tanpa batasan pada tinggi chip, memungkinkan untuk dengan mudah mengakomodasi struktur yang relatif besar seperti pembuluh mikro beberapa ratus mikron dalam lingkungan sekitarnya.

Gambar 1
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Bioteknologi in vitro pada pembuluh darah mikro paru-paru. A) Tinjauan umum pembuatan chip mikrofluida PDMS. Skala batang = 1 cm. B) Tinjauan umum pembuatan pembuluh darah mikro. C) Gambaran kontras fase representatif dari pembuluh darah mikro berukuran penuh (gambar atas) dan gambar fluoresensi (gambar bawah) yang menunjukkan sel hidup (hijau) dan mati (merah) setelah kultur selama 48 jam. Sel endotel paru-paru (EC) komersial digunakan. Skala batang = 200 µm.
Perangkat mikrofluidik terdiri dari dua saluran lateral untuk medium kultur sel dan ruang tengah yang berisi hidrogel kolagen I. Dua dinding geser dijaga pada posisi tertutup untuk memungkinkan pembatasan larutan kolagen dan ditarik kembali setelah polimerisasi untuk memungkinkan difusi medium ke dalam gel kolagen dan untuk memperoleh antarmuka bebas hambatan antara gel dan medium. Untuk membuat bejana pada chip, jarum berdiameter 200 µm dimasukkan sebelum mengisi ruang tengah dengan larutan prepolimer kolagen tipe I (Gambar 1B ). Setelah kolagen terpolimerisasi, jarum dicabut, menghasilkan saluran kolagen berongga yang terhubung mulus dengan saluran polidimetilsiloksan (PDMS) dari chip. Setelah dilapisi dengan fibronektin, sel-sel endotel disemai di dalam saluran berongga ini. Untuk menerapkan model pembuluh mikro, pertama-tama kami menggunakan sel-sel EC mikrovaskular primer manusia komersial dari paru-paru (HMVEC-L). Rotasi perangkat memungkinkan adhesi sel endotel di semua sisi saluran mikro. Setelah 24–48 jam kultur, lapisan tunggal endotel konfluen terbentuk di sepanjang mikrokanal dalam ruang kolagen. Mikropembuluh darah yang direkayasa memiliki cakupan sel lengkap sepanjang total panjangnya 3,75 mm dan penampang melintang berongga melingkar dengan diameter rata-rata 209 ± 1,4 µm ( n = 47). Pewarnaan hidup/mati menunjukkan viabilitas sel 92,5 ± 2% ( n = 3) (Gambar 1C ). Model mikropembuluh darah ini viable dan stabil selama minimal 3 hari tanpa aliran. Chip tersebut dapat ditembus, tetapi kami tidak menerapkan aliran untuk sebagian besar eksperimen dalam naskah ini.

Selanjutnya kami mengembangkan strategi untuk mengisolasi sel endotel mikrovaskular baru dari sampel bedah pasien kanker paru non-sel kecil (NSCLC). Upaya kami untuk mengisolasi sel endotel (EC) yang hidup dari jaringan tumor gagal karena jumlah EC tumor yang sangat rendah. Sebagai alternatif, karena operasi paru-paru terdiri dari pengangkatan seluruh lobus atau segmen, kami berhasil dalam isolasi EC yang efisien mulai dari bagian paru-paru yang sehat (berat sampel sekitar 2–5g). Prosedur isolasi EC melibatkan penyortiran sel teraktivasi magnetik (MACS) berurutan menggunakan manik-manik mikro terkonjugasi anti-CD31 diikuti dengan membudidayakan sel dalam media endotelium yang sesuai pada labu berlapis gelatin ( Gambar 2A ). Dengan protokol ini, kami mengisolasi dan membudidayakan EC dengan tingkat keberhasilan 100% dari enam pasien (Gambar 2B , Gambar S2 , Informasi Pendukung). 4–5 hari setelah MACS CD31 , sel-sel yang melekat yang diamati mulai membentuk gugus dan sel-sel mencapai konfluensi setelah 6 hingga 10 hari. Pada titik ini, sel-sel menunjukkan morfologi batu bulat mirip sel EC yang khas saat diamati dengan mikroskop fase kontras (Gambar S3A , Informasi Pendukung). Sel-sel EC yang terisolasi disimpan dalam kultur dan diperbanyak hingga 20 hari, dengan tambahan satu atau dua putaran seleksi MACS CD31, tergantung pada keberadaan sisa sel kontaminan, terutama CAF, yang dapat dikenali secara visual berdasarkan morfologi fibroblastik khasnya. Sel-sel low-passage dibekukan untuk penggunaan lebih lanjut.

Gambar 2
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Isolasi sel endotel paru yang berasal dari pasien dan karakterisasi transkriptomik. A) Tinjauan umum isolasi sel endotel (EC) dari jaringan juxtatumoral sampel NSCLC bedah. B) Data klinis pasien. C) Pengelompokan hierarkis data RNA-Seq massal sel endotel paru komersial (HMVEC-L) dan yang berasal dari pasien (pasien #11), dalam kultur monolayer 2D standar atau model pembuluh mikro 3D ( n = 1 sampel per kondisi). D) Skor pengayaan geneset (ssGSEA), dihitung dari data RNA-Seq massal sel endotel paru komersial dan yang berasal dari pasien (pasien #11), dalam kultur monolayer 2D standar atau model pembuluh mikro 3D, ditampilkan sebagai peta panas ( n = 1 sampel per kondisi). Baris menunjukkan kumpulan data. Kolom menunjukkan tanda tangan. Sebagai kontrol kumpulan data positif, data pseudo-massal dari atlas RNA-Seq sel tunggal endotel paru in vivo digunakan. [ 9 ] 13 kolom pertama sesuai dengan tanda tangan endotel paru yang dipublikasikan (empat tanda tangan in vitro, sembilan tanda tangan in vivo) seperti yang dijelaskan dalam. [ 9 ] Sebagai tanda tangan kontrol negatif non-endotel, tanda tangan fibroblas digunakan: satu tanda tangan fibroblas normal dan tujuh tanda tangan fibroblas terkait kanker (CAF) (subtipe CAF-S1).
Identitas endotel dipastikan dengan mikroskopi imunofluoresensi, flow cytometry, dan analisis transkriptomik. Sel EC paru komersial (HMVEC-L) dan fibroblas masing-masing digunakan sebagai kontrol positif dan negatif. Gambar imunofluoresensi menunjukkan populasi homogen untuk sel EC yang baru diisolasi, dengan pewarnaan positif untuk dua penanda sel EC: VE-kadherin pada sambungan sel-ke-sel dan faktor Willebrand intraseluler (vWF) (Gambar S3B , Informasi Pendukung). Kemurnian >98% dari sel EC yang diisolasi dikonfirmasi dengan flow cytometry menggunakan penanda endotel CD31 (Gambar S3C , Informasi Pendukung). Analisis RNA-Seq massal dilakukan pada sel EC komersial dan yang berasal dari pasien, baik sebagai lapisan tunggal dalam cawan 2D berlapis gelatin maupun sebagai endotelium dalam pembuluh mikro 3D. Pengelompokan hierarkis menunjukkan bahwa sumber EC (komersial atau yang berasal dari pasien) memiliki dampak lebih besar pada profil transkripsi daripada geometri (lapisan tunggal 2D atau pembuluh mikro 3D) (Gambar 2C ). Kami menggunakan tanda tangan EC yang dipublikasikan (empat tanda tangan in vitro dan sembilan tanda tangan in vivo) [ 9 ] untuk menilai sampel EC kami dengan analisis pengayaan set gen (Gambar 2D ). Tanda tangan non-endotel digunakan sebagai kontrol negatif. Sampel EC kami menunjukkan identitas endotel yang jelas, dengan kesamaan yang kuat di antara mereka. Seperti yang diharapkan, tanda tangan EC in vitro menunjukkan skor yang lebih tinggi dibandingkan dengan tanda tangan EC in vivo, konsisten dengan gagasan yang ditetapkan bahwa heterogenitas EC yang diamati secara in vivo oleh scRNA-Seq sebagian besar hilang ketika sel dikultur secara ex vivo. [ 9 ]

2.2 Karakterisasi Fenotipik dan Fungsional Mikropembuluh Darah Paru yang Direkayasa
Integritas lapisan endotel di sepanjang permukaan bagian dalam tabung kolagen dinilai dengan imunofluoresensi dan mikroskopi konfokal. Pewarnaan protein sambungan adheren VE-kadherin dan protein terkait sambungan ketat ZO-1 menunjukkan bahwa sel-sel endotel membentuk lapisan padat kontinu dengan sambungan sel-ke-sel yang tepat, bahkan paling cepat 24 jam pasca penyemaian sel ( Gambar 3A ; Film S1 , Informasi Pendukung). Untuk menilai secara fungsional pembentukan penghalang endotel, permeabilitas pembuluh diukur dengan uji permeabilitas menggunakan dekstran fluoresen (70 kDa). Difusi dekstran fluoresen melintasi endotelium diukur setelah perfusi kontinu melalui pembuluh dan dengan merekam gambar fluoresen setiap 10 detik. Hasilnya menunjukkan bahwa keberadaan sel endotel, baik yang baru diisolasi dari sampel bedah dua pasien atau HMVEC-L komersial, juga membatasi difusi makromolekul fluoresensi melintasi endotelium, dibandingkan dengan tabung kolagen aselular (Gambar 3B ; Gambar S4 , Informasi Pendukung). Permeabilitas nyata berkurang secara signifikan pada saluran yang ditutupi oleh sel endotel (permeabilitas nyata, Papp , 4,9 × 10 −6 ± 1,24 × 10 −6 cm s −1 untuk HMVEC-L, 4,75 × 10 −6 ± 0,99 × 10 −6 cm s −1 untuk EC pasien) berkenaan dengan saluran aselular ( Papp , 1,25 × 10 −5 ± 0,52*10 −5 cm s −1 ), menunjukkan pembentukan fungsi penghalang yang efisien setelah 24 jam pasca penyemaian sel.

Gambar 3
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Karakterisasi fenotipik dan fungsional dari pembuluh darah mikro paru hasil rekayasa yang berasal dari pasien. A) Pencitraan konfokal dari pembuluh darah hasil rekayasa. Gambar representatif dari pewarnaan VE-kadherin (merah), ZO-1 (hijau), dan Hoechst 33342 (biru) pada pembuluh darah yang dihasilkan dengan sel-sel EC hasil rekayasa (pasien #4) setelah kultur 24 jam (panel kiri). Proyeksi 3D representatif (sel-sel HMVEC-L, panel kanan, lihat juga Film S1 , Informasi Pendukung). Skala batang = 50 µm. B) Permeabilitas pembuluh darah mikro. Permeabilitas nyata barier endotel (Papp) ditentukan dengan uji permeabilitas FITC-dekstran (70 kDa). Sel-sel HMVEC-L endotel paru komersial dan kolagen aselular masing-masing berfungsi sebagai kontrol positif dan negatif. Rata-rata ± kesalahan baku rata-rata (SEM) ditunjukkan. Setiap titik merepresentasikan pembuluh darah mikro independen, n = 4–6 per kondisi. Distribusi data dinilai menggunakan uji Shapiro–Wilk dan tidak memenuhi asumsi normalitas; akibatnya, analisis statistik dilakukan menggunakan uji Kruskal–Wallis diikuti oleh uji perbandingan berganda Dunn. ns = tidak signifikan, * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. C) Aktivasi oleh TNF-α. Tingkat mRNA ICAM-1, VCAM-1, dan E-selectin dalam pembuluh darah mikro paru dianalisis dengan mRNA dalam kondisi istirahat dan setelah aktivasi dengan TNF-α (100 ng mL −1 selama 4 jam). Sel endotel paru komersial HMVEC-L berfungsi sebagai kontrol positif. Gen housekeeping β2-microglobuline (B2M) digunakan untuk menormalkan kandungan RNA. Ekspresi relatif = 2 −∆∆Ct . Rata-rata 2 −∆∆Ct disajikan ± SEM, n = 4 pembuluh darah mikro independen per kondisi. Distribusi data dinilai menggunakan uji Shapiro–Wilk dan tidak memenuhi asumsi normalitas; akibatnya, analisis statistik dilakukan menggunakan uji Mann–Whitney. ns = tidak signifikan, * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. D) Uji adhesi leukosit. Uji adhesi dilakukan dengan perfusi limfosit T Jurkat berlabel fluoresensi pada pembuluh darah mikro paru yang beristirahat atau yang diobati dengan TNF-α. Skala batang = 50 µm. E) Kuantifikasi uji adhesi. Jumlah limfosit T yang melekat kuat dihitung per area. Rata-rata ± SEM ditunjukkan, n = 3–4 pembuluh darah mikro independen per kondisi. Sel endotel paru komersial HMVEC-L berfungsi sebagai kontrol positif. Distribusi data dinilai menggunakan uji Shapiro–Wilk dan memenuhi asumsi normalitas; akibatnya, analisis statistik dilakukan menggunakan uji perbandingan berganda Tukey ANOVA satu arah. ns = tidak signifikan, * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001.
Selain itu, kami mengevaluasi fungsionalitas endotelium dengan menilai keadaan istirahatnya serta kemampuannya untuk beralih dari keadaan istirahat ke keadaan aktif imun. Pada keadaan istirahat atau istirahat, sel-sel EC tidak mengikat leukosit. Di bawah stimulasi dengan sitokin pro-inflamasi, seperti TNF-α, ekspresi molekul adhesi permukaan diatur ke atas pada endotelium, yang mendorong adhesi leukosit. [ 24 ] Analisis PCR kuantitatif waktu nyata (RT-qPCR) menunjukkan bahwa tingkat mRNA molekul adhesi ICAM-1, VCAM-1, dan E-selectin sangat diatur ke atas setelah pengobatan TNF-α (100 ng mL −1 , selama 4 jam) di pembuluh darah mikro paru yang dibentuk oleh sel-sel EC yang berasal dari pasien atau komersial, bahkan setelah 24 jam pasca-penyemaian sel (Gambar 3C ). Selain itu, setelah pengobatan TNF-α, jumlah leukosit yang menempel pada pembuluh darah mikro secara signifikan lebih tinggi dibandingkan dengan kondisi istirahat (Gambar 3D,E ). Secara keseluruhan, data ini memvalidasi status fungsional pembuluh darah mikro paru hasil rekayasa kami yang dihasilkan dari sampel pasien.

2.3 Pendekatan Transkriptomik dalam vToC untuk Menilai Imunomodulasi oleh Endotelium
Dengan tujuan untuk secara spesifik dan efisien menyelidiki regulasi gen endotel dalam konteks TME yang direkonstruksi secara in vitro, kami menyusun strategi eksperimental untuk mengisolasi RNA dari sel-sel EC yang melapisi pembuluh mikro, tanpa kontaminasi RNA dari sel-sel non-endotel yang tertanam dalam kolagen. Sel-sel EC dipisahkan dengan enzim TryPLE yang tidak mencerna kolagen, kemudian dikumpulkan dan segera dilisiskan dalam TRIzol ( Gambar 4A ). Meskipun jumlah sel-sel EC rendah (≈1500 sel per pembuluh mikro), jumlah RNA yang diekstraksi cukup untuk analisis RT-qPCR berikutnya. Yang penting, fakta bahwa kami tidak mendeteksi mRNA gen spesifik kanker (AZGP1 dan KRT19), atau gen spesifik CAF (LUM dan DCN), mengonfirmasi tidak adanya kontaminasi RNA non-endotel. Sebaliknya, kami dengan jelas mendeteksi mRNA gen spesifik endotel (PLVAP dan vWF), memvalidasi metode ekstraksi RNA (Gambar S5 , Informasi Pendukung).

Gambar 4
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Dampak komponen sel TME pada imunomodulasi yang dimediasi endotelium. A) Isolasi RNA endotel dari tumor-on-chip yang divaskularisasi. Mikropembuluh darah pada chip dikultur sendiri atau dengan sel TME lain (sel kanker, CAF) yang tertanam dalam gel kolagen. Sel EC secara khusus diambil dari chip menggunakan enzim TrypLE, diikuti oleh ekstraksi RNA dan analisis RT-qPCR. Gambar mikroskopi sebelum (kiri) dan setelah disosiasi TrypLE (kanan) menunjukkan penghilangan sel endotel secara spesifik. Anak panah putih menunjuk ke lapisan tunggal sel EC. Skala batang = 200 µm. B) Deskripsi panel gen. 42 gen endotel dipilih berdasarkan kontribusinya yang dilaporkan terhadap imunomodulasi dan perkembangan tumor. C) Analisis ekspresi panel 42 gen dalam mikropembuluh darah yang dikultur bersama dengan sel kanker atau CAF. Analisis RT-qPCR dilakukan pada sel EC yang berasal dari pasien (pasien #3 dan #4), atau HMVEC-L komersial, setelah kultur bersama selama 24 jam. Dua lini sel, A549 dan IGR-Heu, digunakan sebagai model sel kanker paru-paru, dan CAF autolog (pasien #3) atau CAF07AD komersial digunakan sebagai model CAF. Ekspresi relatif mRNA (2 −ΔΔ C t ) dilaporkan relatif terhadap kondisi kontrol (sel EC saja), n = 1–3 pembuluh darah mikro independen. Kotak abu-abu yang disilang menunjukkan kondisi di mana ekspresi gen tidak terdeteksi dalam RT-qPCR menggunakan teknik TLDA (Taqman Low density array).
Berikutnya, berdasarkan penelusuran pustaka ekstensif tentang interaksi antara endotelium dan imunitas, kami secara rasional menyusun panel yang terdiri dari 42 gen (dengan enam gen pembantu tambahan) yang diekspresikan oleh sel-sel EC dan diketahui terlibat dalam imunomodulasi, lebih khusus lagi dalam adhesi sel imun, transmigrasi, apoptosis sel T efektor, kelangsungan hidup Treg, dan fungsi sel T (Gambar 4B ; Gambar S6 , Informasi Pendukung). Kami juga memasukkan ke dalam panel gen-gen yang terlibat dalam perkembangan tumor dan penyebaran metastasis atau gen-gen yang dilaporkan sebagai penanda sel-sel endotel tumor (TEC), dengan alasan bahwa infiltrasi imun dan ekstravasasi sel kanker memiliki mekanisme molekuler yang sama.

Secara lebih rinci, panel kami terdiri dari gen yang mengkode protein yang terlibat langsung dalam perekrutan imun, seperti molekul adhesi (E-dan P-selectin, VCAM-1, ICAM-1), [ 25 – 27 ] pengatur molekul adhesi sel (reseptor endotelin B [ 28 ] dan endoglin [ 29 , 30 ] ), serta panel besar kemokin dan sitokin yang mengatur infiltrasi imun (CCL2, [ 31 ] CCL5, [ 32 ] CCL18, CXCL10, CXCL11, [ 33 ] IL-8, [ 34 ] CXCL2, dan CX3CL1) dan dua aktor yang dilaporkan meningkatkan adhesi selektif sel T pengatur (CLEVER [ 35 ] dan CD166). Di antara regulator apoptosis/kelangsungan hidup sel T, kami memilih CD73 (ektonukleotidase yang mengkatalisis hidrolisis adenosin monofosfat ekstraseluler menjadi adenosin yang merupakan sinyal pro-apoptosis yang kuat untuk sel T CD8+), [ 36 ] IDO1 (enzim yang terlibat dalam metabolisme triptofan yang meningkatkan aktivitas sel T CD8+), [ 37 ] dan ligan kematian FAS L (yang menginduksi apoptosis bergantung FAS). [ 38 ] Ligand titik pemeriksaan imun terpilih (PD-L1, [ 39 ] PD-L2, [ 40 ] TIM-3, [ 41 ] B7-H3/CD276, [ 42 , 43 ] B7-H4/VTCN1 [ 44 ] ), interleukin (IL-6 [ 45 ] dan IL-12), molekul anti-inflamasi (eNOS, [ 46 ] PTGES, [ 47 ] dan galectin 9 [ 11 ] ), dan protein kompleks histokompatibilitas utama (MHC) Kelas II (HLA DQ α1 dan β1 [ 48 ] ) juga ditambahkan karena telah dilaporkan diekspresikan oleh EC dan dapat meningkatkan ekosistem imunosupresif. Kami memilih CXCR7, [ 49 ] angiopoietin 2, [ 50 ] dan ANTXR1 (juga dikenal sebagai penanda endotel tumor 8, TEM 8), [ 51 ]sebagai penanda dugaan TEC. Kami menambahkan enam aktor yang memiliki peran dalam remodeling matriks ekstraseluler (ECM), sehingga mendorong angiogenesis, migrasi sel tumor, dan penyebaran metastasis: dua anggota keluarga metalloprotease matriks (MMP2 dan MMP9), [ 52 ] oksidase amina yang bergantung pada tembaga LOX, [ 53 ] proteoglikan biglycan, [ 54 ] Slit2, protein yang disekresikan dengan potensi panduan sel kanker, [ 55 ] dan Jagged1, ligan notch. [ 56 ]

Dengan analisis RT-qPCR menggunakan larik Taqman yang dibuat khusus, kami pertama-tama menerapkan panel gen ini ke pembuluh darah mikro yang terbuat dari sel-sel yang berasal dari pasien dengan atau tanpa pengobatan TNF-α (Gambar S7A , Informasi Pendukung). Seperti yang diharapkan, kami mengamati lagi peningkatan regulasi yang kuat dari gen yang mengkode molekul adhesi: ICAM-1, VCAM-1, dan E-selectin seperti di atas, dan lebih ringan juga dari P-selectin. Sebenarnya, sebagian besar gen panel dilaporkan terkait dengan respons imun efektif (CCL18, CCL2, CCL5, CXC3CL1, CXCL11, GROβ, IL-8, IL-6, dan MHC II) mengalami peningkatan regulasi yang kuat, yang mengonfirmasi bahwa endotelium pembuluh darah mikro paru-paru dalam keadaan istirahat dan tidak menunjukkan anergi endotel basal, karena kami mengamati respons stereotip terhadap rangsangan pro-inflamasi. Beberapa aktor imunosupresif juga diturunkan regulasinya (endoglin, CD166, CD73, PDL2, dan eNOS), memperkuat aktivasi endotel dan keadaan pro-inflamasi setelah stimulasi TNF-α.

Berikutnya, kami membandingkan endotelium pembuluh darah mikro 3D yang berasal dari pasien dengan sel-sel EC yang sama yang tumbuh dalam cawan 2D berlapis gelatin (Gambar S7B , Informasi Pendukung), dalam keadaan istirahat tanpa TNF-α. Menariknya, sel-sel EC yang dikultur dalam cawan 2D menunjukkan peningkatan ekspresi beberapa molekul adhesi (ICAM-1, VCAM-1, E-selectin, dan P-), serta beberapa kemokin atraktan (CCL18, CCL2, CCL5, dan CX3CL1) dan molekul MHC (MHC kelas II DQ α1 dan β1). Hal ini menunjukkan bahwa kondisi kultur 2D dapat menyebabkan aktivasi endotelium parsial dan reversibel, tidak fisiologis, dan memperkuat pentingnya untuk meniru pengaturan 3D in vivo, termasuk geometri dan kekakuan.

2.4 Dampak Komponen Sel TME pada Imunomodulasi yang Dimediasi Endotelium
Kami menanamkan populasi sel TME dalam kolagen yang mengelilingi pembuluh darah mikro. Kami pertama kali memulai dengan dua lini sel manusia yang diabadikan: sel adenokarsinoma paru A549 (dari ATCC) dan sel karsinoma sel besar IGR-Heu (didirikan di Institut Gustave Roussy). [ 57 ] Sebagai model sel CAF paru, kami menggunakan CAF primer yang diisolasi dari pasien #3 serta CAF07A komersial (Neuromics). CAF primer tumbuh dengan mudah pada cawan kultur standar. Berdasarkan keahlian laboratorium kami tentang heterogenitas CAF, [ 58 – 62 ] kami mengetahui bahwa CAF yang dikultur dalam cawan 2D standar sesuai dengan subpopulasi CAF-S1 FAP+ imunosupresif, subset ECM-myCAF.

Untuk mengidentifikasi modulasi TME yang dilestarikan, terlepas dari model sel spesifik, kami menghasilkan tumor-on-chip vaskularisasi menggunakan tiga jenis sel EC paru yang berbeda (pasien #3, pasien #4, HMVEC-L), dua lini sel kanker paru yang berbeda (A549, IGR-Heu), dan dua jenis primer CAF-S1 paru yang berbeda (pasien #3, komersial). Setelah 24 jam kultur bersama on-chip dan pembentukan endotelium, RNA sel EC diekstraksi dan analisis susunan RT-qPCR dilakukan menggunakan panel 42-gen yang dijelaskan sebelumnya. Nilai Δ C t dari 42 gen sangat konsisten antara ketiga jenis sel endotel (Gambar S8 , Informasi Pendukung).

Profil ekspresi gen panel endotelium dalam berbagai kondisi kultur bersama dilaporkan relatif terhadap kondisi kontrol dengan hanya endotelium (Gambar 4C ). Ekspresi sekitar sepertiga gen terlalu rendah untuk dideteksi menggunakan TLDA (Taqman low density array). Meskipun variabilitas tergantung pada model sel, secara keseluruhan, keberadaan sel kanker atau CAF sebagian besar berdampak negatif pada ekspresi gen imunomodulator daripada efek positif (rata-rata 64,5% ± 6,5% dari gen yang terdeteksi mengalami penurunan regulasi, yaitu, perubahan lipat <1 sehubungan dengan kondisi EC saja). Ada beberapa pengecualian yang menarik. Misalnya, CD73, ekto-nukleotidase yang bertanggung jawab untuk produksi adenosin ekstraseluler yang merupakan imunosupresan kuat [ 36 ] dan yang tampaknya meningkat dalam keberadaan sel kanker dan CAF dalam dua pembuluh mikro yang berasal dari pasien. Untuk pasien #3 dan pasien #4, rata-rata tingkat ekspresi mRNA CD73 dibandingkan dengan kondisi EC saja, meningkat setelah kultur bersama (1,40, 1,71, dan 6,87 untuk pasien #3, dan 1,8, 1,09, dan 2,36, pada pasien #4, dengan IGR-Heu, A549, dan CAF, masing-masing). Namun, tidak ada modulasi substansial yang diamati dengan sel HMVEC-L (perubahan 0,97, 1,71, dan 0,98 kali lipat setelah kultur bersama dengan IGR-Heu, A549, dan CAF, masing-masing).

Menariknya, ekspresi VCAM-1 secara sistematis dan kuat mengalami penurunan regulasi di ketiga model sel endotel dan di ketiga kondisi ko-kultur (perubahan 0,44, 0,16, dan 0,17 kali lipat, dibandingkan dengan kondisi EC saja, untuk pasien #3, setelah ko-kultur dengan IGR-Heu, A549, dan CAF, masing-masing; perubahan 0,95, 0,37, dan 0,49 kali lipat untuk pasien #4; perubahan 0,10, 0,23, dan -0,24 kali lipat untuk HMVEC-L). Hasil analisis array ini pada ekspresi VCAM-1 dikonfirmasi oleh analisis RT-qPCR dupleks standar ( Gambar 5A ). Selain itu, penurunan regulasi VCAM-1 yang substansial dalam pembuluh darah mikro divalidasi pada tingkat protein dengan imunopewarnaan: setelah ko-kultur dengan sel kanker A549, tingkat protein VCAM-1 dalam EC menurun dua kali lipat (Gambar 5B,C ).

Gambar 5
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Penurunan regulasi VCAM-1 pada pembuluh darah mikro paru-paru. A) Analisis RT-qPCR ekspresi mRNA VCAM1 pada pembuluh darah mikro paru-paru yang dikultur bersama selama 24 jam dengan sel kanker (IGR-Heu atau A549) atau CAF. Setiap titik menunjukkan nilai rata-rata ekspresi relatif mRNA VCAM-1 dari n = 1-3 pembuluh darah mikro independen per kondisi. Rata-rata ± simpangan baku ditunjukkan. Uji normalitas statistik Shapiro dan uji-T berpasangan digunakan. ns = tidak signifikan, * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. B) Gambar imunopewarnaan VCAM-1 representatif dari pembuluh darah mikro paru-paru dengan sel EC saja (HMVEC-L komersial), dikultur bersama selama 24 jam dengan sel kanker A549, atau distimulasi dengan TNF-α (100 ng mL −1 selama 4 jam). Hoechst digunakan untuk pewarnaan nuklir. Skala batang = 20 µm. C) Kuantifikasi pewarnaan fluoresensi rata-rata protein VCAM-1 per sel. n = 60–80 sel dikuantifikasi secara manual dari dua keping independen per kondisi. Rata-rata ± simpangan baku ditunjukkan. Karena uji normalitas Statistik Shapiro tidak lulus, uji Kruskal–Wallis diikuti oleh uji perbandingan ganda Dunn digunakan. ns = tidak signifikan, * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001.
Modulasi menarik lainnya adalah penurunan regulasi CCL2 yang kuat secara keseluruhan pada tiga model sel endotel, dalam delapan dari sembilan kondisi kultur bersama dengan sel kanker atau CAF (Gambar 4C ). Karena CCL2 [ 31 ] merupakan pemain utama dalam kemoatraktan sel imun, khususnya monosit, temuan ini menunjukkan bahwa keberadaan sel kanker dan CAF dalam TME dapat mengganggu produksi CCL2 oleh endotelium dan menurunkan rekrutmen imun.

2.5 Pembuatan Tumor Paru Vaskularisasi Imunokompeten yang Berasal dari Pasien pada Chip
Bahasa Indonesia: Untuk menghasilkan vToC autolog sepenuhnya, dengan sel imun yang menyusup ke tumor, kami memproses sampel bedah pasien #14 dengan menggabungkan protokol isolasi EC dari jaringan sehat seperti dijelaskan di atas (Gambar 2A ) dengan protokol isolasi sel kanker, CAF, dan CD8+ TIL dari jaringan tumor, yang telah kami jelaskan sebelumnya. [ 63 ] Keempat populasi sel autolog dikultur dalam media dan pendukung yang sesuai selama beberapa minggu (lihat Bagian Eksperimen) sebelum disemai dalam vToC. Pencitraan sel hidup dimulai setelah adhesi EC, selama waktu pengamatan 48 jam ( Gambar 6 ; Film S2–S4 , Informasi Pendukung). Keempat jenis sel menunjukkan morfologi dan dinamika yang diharapkan. EC dalam endotelium pembuluh darah mikro tampak padat dan aktif. Sel kanker berbentuk bulat dan statis, dengan gerakan plasma-membran yang dinamis. CAF sangat memanjang, dengan tonjolan panjang dan bergerak lambat. Sel T CD8+ bergerak sangat cepat dan melakukan banyak kontak sel-ke-sel. Dengan menerapkan frekuensi akuisisi yang cukup tinggi (1 gambar setiap 1–5 menit), lintasan sel T dilacak secara manual (Gambar 6B ). Secara keseluruhan, pengamatan ini menunjukkan untuk pertama kalinya kelayakan untuk menyusun kembali ekosistem tumor yang berasal dari pasien, yang terdiri dari sel kanker dan CAF, EC, dan sel imun yang sepenuhnya autologus.

Gambar 6
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Pembuatan tumor paru vaskularisasi turunan pasien pada chip dengan empat populasi sel autolog primer (EC, sel kanker, CAF, sel T CD8+). A) Gambar mikroskop cahaya terpancar representatif dari vToC dari pasien #14 yang menunjukkan pembuluh darah mikro endotel (kiri, lihat juga Film S2 , Informasi Pendukung) dan sel kanker paru autolog tertanam kolagen (panah hijau), CAF (panah merah muda), dan sel T CD8+ (panah biru muda) (kanan, lihat juga Film S3 , Informasi Pendukung). Area putus-putus putih sesuai dengan wilayah minat (ROI) yang digunakan untuk panel B. Skala batang = 50 µm. B) Gambar selang waktu yang menunjukkan dinamika seluler dalam ROI yang digambarkan dalam panel A (lihat juga Film S4 , Informasi Pendukung). Sel kanker paru-paru (panah hijau), CAF (panah merah muda), dan sel T CD8+ (panah biru muda) ditunjukkan pada titik waktu yang berbeda (0, 280, 300, dan 425 menit). Jejak satu sel T CD8+ digambar dengan warna biru tua. Skala batang = 20 µm.

3 Diskusi
Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk membangun model in vitro yang relevan secara klinis dari TME vaskularisasi dengan menggunakan sel-sel EC yang berasal dari pasien. Ambisi awal kami adalah untuk mengisolasi sel-sel EC langsung dari jaringan tumor paru-paru, pada saat yang sama dengan sel-sel kanker primer, TIL dan CAF, [ 63 ] tetapi jumlah sel-sel EC tumor yang diekstraksi tidak cukup untuk membangun kultur primer, kemungkinan karena sel-sel EC hanya mewakili fraksi yang sangat rendah (≈2%) dari keseluruhan sel dalam tumor. [ 64 ] Namun, kami berhasil memperoleh sel-sel EC juxta tumor (kemurnian ≥99%) dari bagian-bagian lobus paru-paru pasien yang sehat yang diangkat selama operasi (tingkat keberhasilan 100%, enam dari enam pasien). Penelitian lain menunjukkan kelayakan membangun kultur primer sel-sel EC tumor, sebagai tambahan sel-sel EC juxta tumor, [ 9 , 65 ] tetapi tanpa kemungkinan untuk secara bersamaan mengisolasi jenis sel TME lainnya.

Kami membandingkan pembuluh darah mikro yang dihasilkan dengan sel-sel EC yang berasal dari pasien dengan pembuluh darah mikro yang dihasilkan dengan sel-sel EC mikrovaskular primer paru-paru komersial dari donor sehat (HMVEC-L). Secara keseluruhan, analisis fenotipik, fungsional, dan transkriptomik menunjukkan perilaku yang serupa, yang menunjukkan bahwa protokol isolasi/amplifikasi sel-sel EC kami, dan metodologi fabrikasi chip, memungkinkan untuk secara efisien menghasilkan pembuluh darah mikro fungsional dengan sifat endotelium yang diharapkan. Dalam penelitian ini kami menggunakan kelompok pasien yang sangat kecil (enam pasien), oleh karena itu kami tidak dapat mengevaluasi perbedaan antar pasien secara statistik. Namun, personalisasi vToC kami dengan sel-sel EC yang berasal dari pasien membuka kemungkinan untuk menjawab pertanyaan baru, seperti dampak variabilitas pasien pada sifat endotelium, respons terhadap obat, atau interaksi dengan komponen TME lainnya. Untuk karsinoma sel ginjal, model pembuluh darah mikro in vitro dibuat dengan sel-sel EC yang berasal dari pasien dan digunakan untuk pengujian pengobatan, seperti obat antiangiogenik, [ 65 , 66 ] yang mendukung gagasan bahwa model vToC memiliki aplikasi potensial untuk menginformasikan respons obat spesifik pasien. Namun, uji klinis yang tepat perlu dirancang untuk mengevaluasi korelasi dengan respons klinis pasien.

Bahasa Indonesia: Dibandingkan dengan studi tumor-on-chip sebelumnya, [ 5 ] strategi eksperimental kami memiliki keuntungan penting karena menawarkan kemungkinan untuk mengisolasi secara simultan dari sampel bedah yang sama keempat populasi sel primer (sel kanker, TIL, CAF, dan EC) dan menggabungkannya ke dalam chip setelah amplifikasi singkat. Oleh karena itu, pendekatan kami merupakan kemajuan signifikan di bidang ini dengan menerapkan model perfusi 3D menggunakan sel yang berasal dari pasien. Upaya sebelumnya untuk menyusun kembali model kanker paru yang berasal dari pasien sebagian besar dilakukan dengan menggunakan organoid tumor, yang menghasilkan struktur yang sebagian besar terdiri dari sel epitel dan fibroblas. [ 67 – 70 ] Tumoroid ini tidak menyusun kembali lingkungan mikro sel tumor yang lengkap dan tidak memiliki komponen penting seperti pembuluh darah yang diperfusi dan kompartemen sel imun. Pendekatan yang lebih baru melibatkan mikrofluida tetesan untuk menyusun kembali tumoroid yang berasal dari pasien yang terdiri dari sel tumor paru, CAF, dan sel imun [ 71 ] tetapi tidak menyusun kembali lingkungan vaskularisasi 3D dari tumor. Upaya sebelumnya untuk menyusun kembali tumor paru-paru pada chip yang diatur dalam pengaturan 3D menggunakan mikrofabrikasi sebagian besar menggunakan garis sel yang mapan. [ 72 , 73 ] Baru-baru ini, model 3D vaskularisasi dari tumor paru-paru pada chip juga dikembangkan, menggunakan spheroid tumor yang disusun kembali, [ 74 ] sel pada perancah membran nanofiber, [ 75 ] atau model 3D yang lebih elegan yang menyusun kembali antarmuka udara-epitel. [ 15 ] Namun, semua pendekatan yang menyusun kembali arsitektur 3D ini menggunakan garis sel yang mapan atau primer yang tidak berasal dari pasien kanker paru-paru.

Selain itu, kami menyediakan bukti konsep pembuatan vToC autolog penuh di sini yang merupakan langkah penting menuju model tumor-on-chip dengan relevansi klinis yang nyata. Secara khusus, sifat autolog sel T imun mutlak diperlukan untuk menghindari reaksi alogenik apa pun, karena sel EC mampu menyajikan antigen melalui molekul MHC kelas II. [ 76 ] Ko-kultur heterolog sel TME, tanpa sel imun atau hanya dengan sel imun bawaan, akan tetap berguna untuk jenis investigasi tertentu, tetapi hanya ToC autolog yang sesuai untuk mempelajari interaksi kanker-imun dan respons imunoterapi.

Dalam karya ini kami mengeksploitasi model vToC untuk menjawab pertanyaan tentang dampak komponen sel TME pada ekspresi gen imunomodulatori oleh endotelium. Kami menemukan bahwa sel kanker dan CAF menurunkan ekspresi protein adhesi leukosit VCAM-1 oleh sel EC, yang sangat penting untuk infiltrasi imun. Selain itu, ketika sel EC berada dalam kultur bersama dengan sel kanker dan CAF, kami mengamati penurunan regulasi global dalam sel EC pada lebih dari setengah gen imunomodulatori dalam panel kami, termasuk CCL2. Hasil ini sejalan dengan konsep saat ini bahwa faktor TME mendorong endotelium menuju fenotipe imunosupresif dan mendukung anergi sel endotel pembuluh darah. Memang, penghambatan VCAM-1 endotel merupakan ciri khas anergi endotel dan diusulkan untuk didorong secara in vivo oleh sekresi faktor pro-angiogenik dalam TME. [ 77 , 78 ] Pada model tikus, kepadatan endotel VCAM-1 ditemukan berkorelasi dengan infiltrasi imun dan respons terhadap imunoterapi. [ 79 ] Baru-baru ini, Kim et al [ 80 ] menjelaskan dalam ECs regulasi epigenetik represif dari VCAM-1, CXCL9, dan CXCL10, yang bergantung pada faktor proangiogenik FGF2. Status non permisif dari pembuluh darah ini dapat dibalikkan dengan penghambatan metiltransferase DNA endotel 1, yang mendorong perekrutan limfosit T CD8+ dan meningkatkan kemanjuran penghambat titik pemeriksaan imun pada model tikus kanker payudara. [ 80 ]

Keterbatasan yang signifikan harus ditunjukkan. Meskipun model vToC secara efektif mengintegrasikan beberapa jenis sel dan merangkum perilaku kompleks tertentu dari ekosistem tumor, model ini masih sangat jauh dari menangkap kompleksitas penuh TME. Misalnya, seperti yang disebutkan sebelumnya, setelah kultur ex vivo, baik sel EC maupun sel CAF kehilangan heterogenitas selulernya, karena hanya subtipe sel tertentu yang mampu bertahan hidup dan berkembang biak di luar tubuh manusia. Selain itu, meskipun sel TIL CD8+ telah dimasukkan ke dalam chip, TME mencakup susunan sel imun yang jauh lebih luas, dengan makrofag sebagai yang paling melimpah. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk meningkatkan kompleksitas seluler model tumor-on-chip sambil memastikan bahwa sel-sel tersebut tetap dapat dikontrol.

Sebagai kesimpulan, temuan penelitian ini menunjukkan bahwa vToC yang berasal dari pasien merupakan platform eks vivo yang tangguh. Bila dikombinasikan dengan analisis transkriptomik tingkat lanjut, vToC memberikan wawasan berharga tentang karakteristik dan fungsi endotelium yang berasal dari pasien dalam konteks ekosistem tumor yang direkonstitusi. vToC dapat berfungsi sebagai alat penelitian yang ampuh untuk menyelidiki mekanisme molekuler yang bergantung pada TME dan untuk menilai efek pengobatan antikanker, termasuk obat antiangiogenik dan imunoterapi. Terakhir, vToC dapat dipersonalisasi dengan sel autolog primer untuk mempelajari fitur khusus pasien dan untuk mempersiapkan aplikasi masa depan dalam pengobatan yang dipersonalisasi.

4 Bagian Eksperimen
Pengumpulan Jaringan Paru-Paru
Jaringan paru-paru tumor dan sehat (yaitu, lobus yang sama) diperoleh dari reseksi paru-paru pasien NSCLC yang dirawat di Rumah Sakit Bichat–Claude Bernard (AP-HP.Nord) di Paris. Persetujuan etis diperoleh oleh Comité d’Evaluation des Protocoles de Recherche Observationnelle (nomor 2020–051) dari French Speaking Respiratory Medicine Society. Semua pasien diberi tahu saat masuk bahwa sampel jaringan atau organ yang diperoleh selama prosedur diagnostik atau perawatan juga dapat digunakan untuk tujuan penelitian. Melalui formulir informasi kelembagaan yang sesuai, mereka dapat menolak penggunaan sampel mereka dan/atau data terkait yang dideidentifikasi secara klinis. Spesimen yang dikumpulkan (0,5–5 g) ditempatkan dalam medium RPMI-1640 dingin (Gibco, 21875-034) yang dilengkapi dengan 10% serum fetal bovine (FBS) (Biosera, S002T2000O) dan larutan penisilin/streptomisin 1% (Sigma-Aldrich, 11074440001) untuk transportasi dan diproses sesegera mungkin pada hari yang sama.

Isolasi dan Kultur Sel
Jaringan difragmentasi menjadi potongan-potongan kecil (2 mm 3 ) dengan pisau bedah dan dicerna secara enzimatis dengan kit disosiasi tumor (Miltenyi Biotec, 130-095-929), sesuai dengan petunjuk pabrik. Sel-sel EC diisolasi secara positif dari jaringan paru-paru sehat pasien kanker paru-paru dengan MACS menggunakan kit CD31 MicroBead (Miltenyi Biotec, 130-091-935). Sel-sel yang terikat kemudian dielusi dan dilewatkan melalui kolom pemisahan kedua untuk mencapai kemurnian yang lebih tinggi. Sel-sel CD31+ ditanam pada cawan pra-pelapis gelatin sapi 1,5% b/v (Sigma-Aldrich, G1393) dengan kepadatan sel antara 1 dan 3,10 5 sel per cm 2 dan diinkubasi semalam dalam medium EGM2-MV (Lonza, CC-3156 dan CC-4147) pada 37 °C dengan 5% CO 2 . Sel yang tidak menempel dicuci dengan hati-hati, dan sel EC yang menempel disimpan dalam kultur hingga mencapai titik pertemuan, mengganti medium setiap 2 atau 3 hari. Sel EC mikrovaskular primer manusia komersial dari paru-paru (HMVEC-L) dibeli dari Lonza (CC-2527). Sel EC secara rutin dilewatkan pada pengenceran 1:3 dan digunakan untuk pembentukan pembuluh mikro pada lintasan rendah (maks 5).

Sel kanker paru-paru primer, sel T CD8+, dan CAF diisolasi dari jaringan paru-paru tumor dengan MACS seperti yang dilaporkan. [ 63 ] Sel kanker paru primer dikultur hingga 2–3 bulan sebagai spheroid ke dalam pelat sumur perlekatan ultra-rendah (Corning, 3471) atau labu (Corning, 3814), dalam DMEM-F12 (Gibco, 11330-032) yang disuplemen dengan larutan penisilin/streptomisin 1% (Thermo-Fisher Scientific, 15140122), suplemen B27 0,1× bebas serum (Thermo-Fisher Scientific, 17504044), heparin 4 µg mL −1 (Sigma-Aldrich, H3149-10KU), insulin manusia 5 ng mL −1 (Sigma-Aldrich, I9278-5ML), hidrokortison 1 µg mL −1 (Sigma-Aldrich, H0888-1G), 20 ng mL −1 EGF (Thermo-Fisher Scientific, PHG0311), 20 ng mL −1 FGF-dasar (Thermo-Fisher Scientific, 13256-029). Sel T CD8+ yang menginfiltrasi tumor primer dikultur selama 1–2 minggu ke dalam pelat 96-sumur V-bottom (Greiner, 651261) dalam RPMI-1640 (Cytiva, SH30027.01) yang dilengkapi dengan 10% serum manusia (Institut Jacques Boy, Reims, Prancis, 201021334), larutan penisilin/streptomisin 0,1%, natrium piruvat 1% (Thermo-Fisher Scientific, 11-360-070), 30 ng mL −1 rIL-2 (Gibco, #PHC0021). CAF paru primer dikulturkan ke dalam cawan kultur standar DMEM/glukosa tinggi (Cytiva, SH30243.01) yang dilengkapi dengan 10% FBS (Biosera, FB-1001/500) dan larutan penisilin/streptomisin 1%. CAF primer manusia tambahan dari adenokarsinoma paru dibeli dari Neuromics (CAF07A) dan dikulturkan dalam MSC-GRO VitroPlus III, medium lengkap serum rendah (Vitro Biopharma, PC00B1).

Sel adenokarsinoma paru manusia A549 (ATCC, CCL-185) dikultur dalam DMEM/glukosa tinggi yang disuplemen dengan 10% FBS dan larutan penisilin/streptomisin 1%. Sel karsinoma sel besar IGR-Heu [ 57 ] diperoleh dari laboratorium Fathia Mami-Chouaib dan dikultur dalam DMEM-F12 yang disuplemen dengan 10% FBS, 1% penisilin/streptomisin, 1% natrium piruvat, dan 1% Ultroser G (Pall). Sel T Jurkat ditumbuhkan dalam Medium RPMI-1640 (Gibco, 21875-034) yang disuplemen dengan 10% FBS dan 1% penisilin/streptomisin. Lini sel komersial diautentikasi dengan profil pengulangan tandem pendek. Semua jenis sel secara rutin diuji untuk kontaminasi mikoplasma dengan metode PCR (Eurofins).

Desain dan Fabrikasi Perangkat Mikrofluida
Desain perangkat mikrofluidik terdiri dari ruang tengah (panjang 3,75 mm × lebar 5 mm × tinggi 0,6 mm) yang berisi gel kolagen I dan dua kompartemen media lateral (kubus 5 mm dengan setengah silinder radius 2,5 mm di satu sisi). Pemandu jarum melintasi perangkat sepenuhnya untuk membuat saluran tengah dengan diameter 200 µm. Ruang tengah dipisahkan dari dua ruang lateral oleh dinding geser (panjang 20 mm × lebar 0,48 mm × tinggi 0,63 mm) yang dapat ditarik kembali setelah kolagen terpolimerisasi. [ 23 ] Cetakan perangkat mikrofluidik dan dinding geser dibuat dengan stereolitografi (DWS 028J+, DWS Systems) menggunakan photoresist DS3000 (DWS Systems). Cetakan dan dinding selanjutnya diolah dengan plasma oksigen (Diener Electronic PICO-PCCE, 30 detik, 0,40 mbar, 100%) dan diekspos ke silanisasi fase uap menggunakan trikloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (Sigma-Aldrich, 448931) untuk memudahkan pelepasan serpihan mikrofluida dari cetakan dan menghindari kebocoran cairan dari ruang lateral. Cetakan dan dinding dicuci secara ekstensif dengan etanol 70% sebelum digunakan untuk mencegah efek sitotoksik dari sisa silana. Langkah silanisasi ini tidak wajib untuk dinding. Chip dibuat dengan cara pengecoran PDMS (Sylgard 184, Farnell, 101697) pada rasio elastomer terhadap bahan pengawet 10:1 w/w pada cetakan yang dilengkapi dengan jarum mikro Ø 200 µm (Serin, No. 3 [Ø 0,20] × tipe J 30 mm). Gelembung dihilangkan dengan desikator sebelum mengeringkan PDMS pada suhu 75 °C selama 3 jam hingga semalaman. Setelah mengelupas dari cetakan dan jarum dilepaskan, lubang masuk dan keluar berdiameter 0,75 mm dibuat dengan pelubang 0,75 mm (World precision instrument, 15453532). Perangkat dibersihkan dengan etanol 70% dan dikeringkan dengan udara bertekanan. Partikel yang tersisa dihilangkan dari permukaan PDMS menggunakan pita perekat transparan (Scotch Tape, 3M). Keripik diikat pada kaca penutup setebal 0,17 atau 1,7 mm setelah perawatan dengan plasma oksigen. Dinding geser segera ditempatkan pada posisinya dan keripik ditempatkan dalam oven 72 °C selama 10 menit untuk meningkatkan ikatan. Aktivasi permukaan PDMS untuk imobilisasi kovalen kolagen dicapai dengan dua teknik alternatif: polidopamin [ 81 ] atau (3-aminopropil)trietoksisilana (APTES)/glutaraldehid. [ 82 ] Untuk teknik aktivasi pertama, setelah putaran perawatan plasma oksigen lainnya, 30 µL 10 mg mL −1dopamin hidroklorida (Thermo Scientific Chemicals, A11136.06), yang baru disiapkan dalam buffer Tris/HCl 10 mM pH = 8,5, ditambahkan per keping dan diinkubasi pada suhu ruangan (RT) dalam gelap selama satu jam; keping dicuci dengan air deionisasi (DIW, Millipore). Untuk teknik aktivasi kedua, larutan 2% v/v APTES dalam DIW ditambahkan ke dalam ruang tengah selama 30 menit pada suhu RT; setelah pembilasan dengan DIW, larutan 0,1% v/v glutaraldehida (Sigma-Aldrich, 340855) dalam DIW ditambahkan dan didiamkan selama 15 menit pada suhu RT; setelah pembilasan ekstensif dengan DIW, perangkat dicuci selama 48 jam untuk menghilangkan kelebihan APTES atau glutaraldehida yang tidak terikat. Perangkat kemudian dikeringkan dengan udara bertekanan, disterilkan dengan UV, dan disimpan di dalam ruang yang dilembabkan pada suhu 4 °C sebelum penyisipan kolagen.

Pembentukan Pembuluh Mikro dalam Gel Kolagen
Jarum mikro Ø 200 µm (Serin, No. 3 [Ø 0,20] × 30 mm tipe J) dilapisi dengan 1% b/v bovine serum albumin (BSA, Sigma-Aldrich, A7906) dalam PBS selama 40 menit pada suhu kamar, sebelum dimasukkan kembali, untuk mencegah kolagen menempel pada jarum. Gel kolagen tipe I (konsentrasi tinggi, ekor tikus, Corning, 354249) dicampur dengan DIW, 10× PBS (Gibco, 70011–044), dan 1 n NaOH (Sigma-Aldrich, S2770) hingga mencapai konsentrasi akhir 6,5 mg mL −1 pada pH 7,1–7,4. Larutan kolagen (14 µL) kemudian ditambahkan untuk mengisi ruang tengah dan dibiarkan berpolimerisasi di ruang lembap selama 10 menit pada suhu 25 °C dan kemudian 20 menit pada suhu 37 °C. Kondisi ini memungkinkan pembentukan serat kolagen yang lebih tebal, sehingga mendorong pembentukan pembuluh yang lebih stabil. [ 20 ] Setelah polimerisasi gel, ruang lateral diisi dengan PBS dan dinding geser terbuka. Kemudian, jarum dilepas dengan hati-hati, meninggalkan lubang tubular di dalam gel berukuran 200 µm Ø. Tabung yang dihasilkan diisi dengan 4 µL 10 µg mL −1 fibronectin manusia (Sigma-Aldrich, F0895) dalam PBS dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 °C. Fibronectin yang tidak terikat dihilangkan dengan pencucian dengan medium endotel lengkap (EGM2-MV, Lonza, CC-3156 dan CC-4147). PBS dari ruang lateral juga diganti dengan medium dan dibiarkan hingga seimbang semalaman dalam kondisi kultur sel biasa. Lubang yang tersisa setelah jarum dilepas ditutup dengan setetes PDMS semi-polimer atau lem silikon (Mastic Henkel Loctite Si 5398, Merah).

Sel EC dipanen dari cawan dan disuspensikan kembali dalam medium lengkap yang mengandung 4% b/v dekstran-70 kDa (Sigma-Aldrich, 31390) pada 1 × 107 sel yang hidup per mL. 2 µL suspensi sel disuntikkan perlahan ke dalam saluran kultur sel sentral. Chip diinkubasi terbalik (yaitu, dibalik pada 180°) selama 20–30 menit di dalam inkubator untuk memungkinkan sel menempel pada permukaan atas saluran. Chip kemudian dibalik dan diinkubasi tambahan selama 20–30 menit untuk meningkatkan adhesi sel ke permukaan bawah. Sel yang tidak menempel dihilangkan dengan mencuci perlahan menggunakan medium. Medium diganti 4 jam kemudian dan lapisan tunggal konfluen dibiarkan terbentuk semalaman dalam kondisi statis (tanpa aliran). Viabilitas pembuluh darah mikro pada berbagai titik waktu dievaluasi menggunakan LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570, Invitrogen, R37601).

Untuk percobaan dengan aliran mikrofluida, laju aliran dikontrol oleh pompa tekanan (MFCS-EZ, unit aliran M, Fluigent) yang dihubungkan ke saluran masuk ruang endotelium melalui pipa PTFE (pipa PTFE Cole Palmer, 06417-11), pipa silikon (Saint-Gobain, Masterlex 06411–60), dan diameter luar 0,9 mm (Metcal, TE720050PK). Untuk mencapai tegangan geser dinding fisiologis venula/arteriol sebesar 0,1 Pa pada endotelium, [ 83 ] laju aliran ditetapkan pada 6,7 ​​µL min −1 , menurut persamaan,

di mana η berhubungan dengan viskositas medium pada suhu 37 °C, Q adalah laju aliran, dan r adalah jari-jari pembuluh.

Untuk percobaan dengan integrasi tipe sel TME lainnya, sel kanker, CAF, dan sel T CD8+ ditanamkan ke dalam larutan kolagen pada konsentrasi akhir yang ditargetkan sebesar 1000–2700, 500–1000, dan 3000 sel per µL, masing-masing, berdasarkan optimasi kepadatan sel pada chip sebelumnya. [ 63 ] Untuk percobaan vToC autolog sepenuhnya, rasio sel terhadap sel yang ditargetkan adalah 3:1 sel kanker terhadap sel imun dan 1:1 sel kanker terhadap CAF. Media yang digunakan untuk percobaan kokultur adalah media EGM2-MV (Lonza, CC-3156 dan CC-4147) yang disuplemen dengan 30 ng mL −1 rIL-2.

Imunofluoresensi dalam Mikropembuluh Darah
Untuk imunofluoresensi pada pembuluh mikro 3D VE-kadherin dan ZO-1, larutan dibuat dalam DPBS dengan Ca ++ /Mg ++ (DPBS++, Gibco, 14040–133). EC dicuci dengan DPBS++ dingin dan difiksasi dengan 4% v/v paraformaldehida (ThermoFisher, 28906, diencerkan 1:4) selama 20 menit pada suhu kamar dan dipermeabilisasi dengan 0,1–0,3% v/v Triton X-100 (Sigma-Aldrich, X100) selama 30 menit pada suhu kamar. Bahasa Indonesia: Setelah langkah pencucian dengan 4% b/v BSA (Sigma-Aldrich, A7906), sel diinkubasi dengan larutan pemblokiran (DPBS ++, 0,1% v/v Tween 20 [Sigma-Aldrich, P9416], 4% b/v BSA) selama 2 jam pada RT dan diinkubasi dengan anti-VE-kadherin manusia (Rabbit pAb, Abcam ab33168, 1:100 dalam larutan pemblokiran) dan anti-ZO-1 manusia (Mouse mAb, Invitrogen ZO1-1A12, 1:100 dalam larutan pemblokiran) selama 1 jam pada RT. Setelah tiga kali pencucian selama 10 menit dengan larutan pemblokiran, Alexa 594-conjugated goat anti-rabbit IgG (Invitrogen, A11012, 1:1000 dalam larutan pemblokiran) dan Alexa 488-conjugated goat anti-mouse IgG (Invitrogen, A11001, 1:1000 dalam larutan pemblokiran) ditambahkan selama 1 jam pada suhu kamar. Nukleus diwarnai dengan 10 µм Hoechst 33342 (Invitrogen, H1399) selama 30 menit pada suhu kamar. Pencitraan konfokal pembuluh darah mikro dilakukan menggunakan mikroskop pemindai laser (LSM780, Carl Zeiss) yang dilengkapi dengan objektif perendaman air 40x (Plan-Apochromat 40x/1,0 NA W) atau objektif 10x (EC Plan-Neofluar 10x/0,3 NA). Sekitar 250 bagian serial berurutan (masing-masing setebal 2 µm) direkam untuk setiap pembuluh mikro, dari mana gambar proyeksi 3D dihasilkan menggunakan perangkat lunak IMARIS (v9.0.2, Bitplane, AS) atau FIJI. [ 84 ]

Untuk imunofluoresensi pada pembuluh mikro 3D VCAM-1, protokol sedikit dimodifikasi sebagai berikut. Larutan dibuat dalam DPBS tanpa Ca ++ /Mg ++ (Euromedex, EU1-9400-100). Pemblokiran dilakukan dalam 4% b/v BSA dalam DPBS. Inkubasi dengan anti-VCAM-1 manusia (Mouse mAb 1.4C3, Invitrogen, MA5-11447, 1:25) dilakukan semalam pada suhu 4 °C dalam buffer pemblokiran. Setelah tiga kali pencucian selama 10 menit dengan DPBS, 0,1% v/v Tween 20, 4% b/v BSA, chip diinkubasi dengan Alexa 594 goat anti-mouse IgG (Invitrogen, A11005) dan diwarnai ulang dengan 10 µм Hoechst 33342 selama 1 jam pada suhu RT. Chip tersebut kemudian dicuci dengan PBS. Pencitraan Biphoton Confocal dilakukan dengan Inverted Leica TCS SP8 MP menggunakan lensa objektif HC IRAPO L 25×/1.0 W motCORR (Leica cat. 11507704) dan laser biphoton Chameleon Vision II (Coherent) 680 hingga 1080 nm. Kuantifikasi sinyal VCAM-1 dilakukan menggunakan perangkat lunak FIJI. [ 84 ] Untuk setiap sel, sinyal fluoresensi VCAM-1 (nilai abu-abu piksel rata-rata) di dalam area ellipsoid (area rata-rata = 432 ± 101 µm 2 ) yang berpusat pada nukleus diukur. Tiga hingga empat gambar diperoleh per chip. 10 sel per gambar diukur. Untuk gambar ilustrasi, hanya di saluran Hoechst, filter rata-rata (jumlah piksel = 3) telah digunakan (perangkat lunak FIJI).

Pencitraan Sel Hidup
Chip diposisikan pada panggung bermotor dari mikroskop video fluoresensi bidang lebar terbalik (Eclipse Ti2-E, Nikon), tertutup dalam ruang inkubasi Okolab untuk menyediakan atmosfer lembap dengan 5% CO2 pada 37 °C, dilengkapi dengan kamera sCMOS sensitivitas tinggi Photometrics Prime BSI Express dan sumber cahaya CoolLED Pe4000, dan diujicobakan oleh perangkat lunak MetaMorph. Tujuan 10x dan 20x digunakan. Video kontras fase diperoleh pada satu hingga empat posisi per chip. Untuk menangkap dinamika sel imun, interval waktu satu bingkai setiap 1 hingga 5 menit selama 30 menit hingga 24 jam dipilih, dan mode akuisisi tumpukan z digunakan (tujuh bidang setiap 3 µm). Proyeksi z diperoleh dengan menggunakan opsi proyeksi jumlah atau rata-rata dalam perangkat lunak FIJI. Sel dilacak secara manual menggunakan plugin pelacakan manual 2.0.1.jar dalam perangkat lunak FIJI.

Kuantifikasi Permeabilitas Vaskular
Permeabilitas pembuluh darah mikro dinilai dengan fluorescein isothiocyanate–dekstran 70 kDa (FITC-Dextran 70, Sigma-Aldrich, 90719). Chip diposisikan pada panggung mikroskop video fluoresensi bidang lebar terbalik (DMi8, Leica) yang tertutup dalam ruang inkubasi untuk menyediakan atmosfer lembap dengan 5% CO 2 pada 37 °C. Pembuluh darah mikro diperfusi dengan larutan 10 µg mL −1 FITC-Dextran 70 kDa dalam medium sel endotel lengkap pada tegangan geser dinding 0,1 Pa (laju aliran 6,7 µL min −1 ). Gambar fluoresensi diambil setiap 10 detik selama 60 menit dengan objektif perbesaran 5x (N-plan 5x/NA 0,12 PH 0). Untuk mengukur difusi Dextran melintasi pembuluh mikro ke dalam gel kolagen di sekitarnya, permeabilitas nyata ( Papp ) dalam cm s −1 dihitung seperti yang dijelaskan sebelumnya [ 85 , 86 ] berdasarkan persamaan berikut:

di mana Δ I sesuai dengan intensitas fluoresensi rata-rata di dalam tabung endotel,

sesuai dengan tingkat awal peningkatan intensitas fluoresensi dalam gel dan r adalah radius pembuluh. Nilai untuk

diukur dengan memplot intensitas gel rata-rata versus waktu dan menemukan kemiringan selama 5 menit pertama, setelah penyesuaian linier.

Uji Adhesi Leukosit-Endotelium
Sel-T Jurkat diwarnai secara hidup dengan 5 µм CellTrace Yellow (Life Technologies, C34573) selama 20 menit pada suhu 37 °C, disuspensikan kembali pada konsentrasi sel 1 × 106 sel per mL dalam medium EGM2-MV dan dialirkan melalui pembuluh endotel pada tegangan geser dinding 0,1 Pa (laju aliran 6,7 µl menit −1 ) selama 10 menit menggunakan pompa tekanan (MFCS-EZ, unit aliran M, Fluigent). Sel-T Jurkat yang tidak melekat pada endotelium kemudian dicuci dengan mengoleskan medium sel saja selama 20 menit. Dua bidang pandang acak divisualisasikan dengan mikroskop fluoresensi bidang lebar terbalik (DMi8, Leica, pembesaran 5x) untuk mengukur jumlah sel-T Jurkat yang melekat per area.

RT-qPCR
EC dari pembuluh mikro dipisahkan dengan TryPLE Express (Gibco, 12605010) untuk memperoleh RNA utuh berkualitas tinggi, [ 87 ] dikumpulkan dengan pipet dan dihomogenkan dalam 500 µL TRIzol Reagent (Invitrogen, 15596026). Total RNA diekstraksi melalui ekstraksi fenol/kloroform ganda dan presipitasi isopropanol, disuspensikan kembali dalam DEPC-air dan dikuantifikasi menggunakan NanodropOne (Thermo Fisher Scientific). Hasilnya sekitar 150 ng RNA per pembuluh mikro. Sintesis cDNA dilakukan dengan menggunakan kit transkripsi balik cDNA berkapasitas tinggi dengan inhibitor RNase (Applied Biosystems, 4374966), seperti yang dijelaskan sebelumnya. [ 25 ] Rangkaian multi-gen dilakukan dengan menggunakan kartu Rangkaian TaqMan yang dirancang khusus (ThermoFisher, 4342253). Probe Taqman yang digunakan ditunjukkan pada Gambar S1 (Informasi Pendukung). Gen housekeeping B2M (pengkodean untuk β-2-microglobulin) digunakan untuk normalisasi atau kandungan RNA. Untuk gen tunggal RT-qPCR, reaksi dilakukan dalam dupleks menggunakan probe Taqman yang diberi label dengan FAM untuk gen target dan dengan VIC untuk referensi gen housekeeping B2M . Probe Taqman yang digunakan untuk kuantifikasi qPCR dupleks VCAM-1 dan B2M masing-masing adalah Hs01003372_m1 dan Hs99999907_m1. Hasilnya dinormalisasi ke B2M dan tingkat ekspresi relatif mRNA dihitung menggunakan metode 2 −ΔΔ C t , [ 88 ] adalah Δ C T = C T, Target − C T, Referensi diukur dalam sumur reaksi yang sama, dan ΔΔ C T = Δ C T, Sampel eksperimen − Δ C T, Sampel kontrol . Nilai 2 −ΔΔ C t sesuai dengan ekspresi relatif mRNA gen target. Hasil dinyatakan dalam nilai rata-rata atau dalam log 2 dari ekspresi relatif mRNA (2 −ΔΔ C t ) menurut eksperimen. Nilai rata-rata sesuai dengan rata-rata pembuluh independen untuk kondisi yang sama.

Analisis RNA-Seq
EC dari pembuluh mikro (3D) atau dari cawan plastik 96 sumur berlapis gelatin (2D) dipisahkan dengan TryPLE Express (Gibco, 12605010) [ 87 ] dan langsung dibekukan dalam nitrogen cair. Isolasi RNA total diproses menggunakan kit mikro RNeasy (Qiagen, 74004) termasuk Langkah DNAse. Kontrol kualitas RNA total dinilai menggunakan Nanodrop (Thermofisher scientific) untuk kontrol konsentrasi dan kemurnian, serta sistem Bioanalyzer 2100 (Agilent) menggunakan kit RNA Total Pico RNA 6000 (Agilent, 5067-1513) yang memungkinkan untuk menilai integritas RNA (RIN). 37 hingga 100 ng RNA total dengan RIN ≥9 dikirim ke pengurutan. Sampel diurutkan menggunakan sistem Novaseq 6000 (S1—PE100) dan data mentah diproses menggunakan alur kerja rawqc Nextflow ( https://doi.org/10.5281/zenodo.8340106 ). Pembacaan yang diproses kemudian diselaraskan dengan genom hg38 menggunakan alur kerja RNA-Seq ( https://zenodo.org/records/13744441 ). Tabel hitungan transkrip per juta (TPM) dibuat dengan Salmon 1.10.2. [ 89 ] Sebagai kontrol positif, pseudo-bulk dibuat dari data atlas RNA-Seq sel tunggal endotel paru in vivo [ 9 ] dengan menjumlahkan hitungan fitur semua sel menjadi satu sampel semu. Penanganan data dilakukan menggunakan python 3.12.7, semua tabel hitungan diimpor dengan pandas 2.2.3 dan digabungkan dalam satu kerangka data. Fitur dengan jumlah TPM total <0,1 untuk semua sampel dibuang, menghasilkan kerangka data yang dijelaskan oleh 24.383 fitur. Tanda tangan dinilai menggunakan algoritma ssGSEA. [ 90 ] Tanda tangan berikut digunakan: 13 tanda tangan endotel [ 9 ] dan delapan tanda tangan fibroblas dan fibroblas terkait kanker. [ 61 , 62 ] Semua tanda tangan dikumpulkan dalam file GMT dan dinilai menggunakan implementasi python ssGSEA. [ 91 ] Matriks skor ekspresi ternormalisasi yang dihasilkan kemudian diplot dalam peta panas menggunakan seaborn 0.13.2.

Untuk pengelompokan hierarkis, gen dengan jumlah total kurang dari sepuluh dibuang dan tabel yang dihasilkan dinormalisasi menggunakan implementasi python dari Deseq2. [ 92 ] 2000 gen paling bervariasi dari sampel ini dipilih menggunakan metode pemilihan gen yang sangat bervariasi yang diterapkan dalam Scanpy yang dijelaskan oleh Stuart [ 93 ] pada tabel jumlah mentah, sebelum dinormalisasi dengan Deseq2. Pengelompokan sampel dilakukan menggunakan fungsi AgglomerativeClustering dari sklearn 1.5.2.

Analisis Statistik
Analisis statistik dilakukan menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism (v.9.4) (San Diego California, AS). Normalitas data dianalisis dengan uji Shapiro–Wilk dan signifikansi statistik ditentukan menggunakan uji parametrik (uji T atau uji ANOVA satu arah Tukey) atau uji non-parametrik (Mann Whitney atau Kruskal Wallis) jika sesuai. Tanda bintang digunakan untuk menunjukkan perbedaan signifikan dibandingkan dengan kontrol *** p  < 0,001, *** p < 0,01, * p  < 0,05, ns: p > 0,05.