Rekayasa Assembloids untuk Meniru Interaksi Otot Rangka Cangkok-Inang

Abstrak
Rekayasa jaringan otot rangka (SkM) bertujuan untuk menghasilkan produk 3D in vitro yang dapat ditanamkan pada pasien untuk mengganti atau memperbaiki otot yang rusak. Memiliki model in vitro yang dimanusiakan yang mampu meniru interaksi antara penerima yang dipersarafi dan SkM yang direkayasa pada tingkat fungsional akan sangat membantu dalam evaluasi potensi cangkok. Di sini, model in vitro 3D dikembangkan yang memungkinkan untuk menyelidiki fungsi, stabilitas, dan kemampuan beradaptasi sistem neuromuskular (NM) manusia sebagai respons terhadap konstruksi SkM yang direkayasa. Untuk mencapai hal ini, konstruksi berbasis SkM yang dideselularisasi (dSkM) digunakan sebagai SkM yang direkayasa dan organoid neuromuskular manusia (NMO) sebagai sistem NM seperti penerima untuk membuat assembloid SkM graft-host. Kami mengamati migrasi sel miogenik dan invasi akson saraf dari NMO ke konstruksi SkM yang direkayasa dalam assembloid, dengan pembentukan sambungan neuromuskular (NMJ) fungsional. Terakhir, assembloid mampu beregenerasi setelah kerusakan akut, dengan regenerasi SkM dan pemulihan fungsional. Meskipun dibatasi oleh tidak adanya sel imunokompeten dan pembuluh darah, data menunjukkan bahwa assembloid merupakan alat yang berguna untuk mengevaluasi respons SkM yang dipersarafi manusia secara in vitro terhadap potensi cangkok SkM rekayasa jaringan.

1 Pendahuluan
Salah satu tujuan utama rekayasa jaringan adalah untuk menghasilkan organ dan jaringan in vitro yang dapat ditanamkan in vivo untuk menggantikan atau memperbaiki yang sakit dan rusak. [ 1 ] Sampai saat ini, upaya luar biasa telah dilakukan di bidang ini dengan pembuatan konstruksi 3D yang mampu memperluas pengetahuan tentang perkembangan organ dan jaringan dan digunakan untuk aplikasi translasi. [ 2 , 3 ] Sementara presisi dan kontrol atas pembuatan konstruksi 3D in vitro semakin dioptimalkan berkat teknologi yang semakin maju, terdapat kekurangan informasi dan metode investigasi untuk memprediksi respons sel manusia terhadap konstruksi rekayasa dan interaksi selanjutnya antara implan dan jaringan inang. Ini berlaku untuk semua jenis jaringan, termasuk otot rangka (SkM).

Dalam dekade terakhir, beberapa penelitian telah dilakukan untuk penggantian in vivo sebagian besar SkM. [ 4 – 8 ] Pilihan rekonstruksi saat ini untuk kerusakan luas pada jaringan SkM atau malformasi SkM kongenital meliputi cangkok otot autologus dan injeksi intramuskular sel progenitor. [ 9 ] Namun, pendekatan terapeutik ini dibatasi oleh banyak faktor, seperti terbatasnya ketersediaan jaringan donor (terutama pada pasien anak), kegagalan cangkok, morbiditas situs donor, dan kesulitan dalam mengatur aktivitas sel, yang harus memadai dan diarahkan menuju regenerasi. [ 9 ] Selain itu, cacat dan kerusakan SkM sering disertai dengan cedera pada jaringan saraf yang terhubung langsung ke jaringan otot, yang menyebabkan atrofi dan kecacatan fungsional permanen pada otot yang mengalami denervasi, juga setelah pengobatan. [ 10 ]

Beberapa strategi telah dikembangkan dalam beberapa tahun terakhir untuk mempromosikan miogenesis dan regenerasi sambungan neuromuskular (NMJ) bahkan setelah kehilangan otot dalam jumlah besar. Beberapa pendekatan rekayasa jaringan telah mencakup penggunaan perancah khusus dengan pelepasan molekul neurotropik yang terkontrol, [ 11 , 12 ] juga dikombinasikan dengan latihan, [ 4 , 11 ] untuk mempromosikan migrasi dan/atau invasi sel inang. Diketahui bahwa perancah yang diperoleh melalui deselularisasi SkM (dSkM) memiliki sifat miogenik intrinsik [ 5 , 6 , 13 ] dan neurotropik, [ 14 ] dan ketika ditanamkan secara in vivo sebagai perangkat (yaitu, tanpa penyemaian awal sel otot) dapat berintegrasi dengan jaringan inang pada model hewan dan merangsang pertunasan saraf, sementara secara bersamaan menarik progenitor miogenik di dalam perancah itu sendiri [ 13 ] dengan regenerasi SkM dan NMJ sebagai konsekuensinya. [ 6 ] Yang penting, selain bukti pada model hewan, telah ditunjukkan bahwa implantasi perancah yang dideselularisasi sebagai perangkat (yaitu, tidak ada pra-semai dengan sel miogenik) dapat meningkatkan tingkat pemulihan otot tertentu pada pasien yang terkena kehilangan otot volumetrik. [ 15 ] Namun, penelitian ini dan penelitian lainnya [ 16 , 17 ] menunjukkan bahwa penggunaan perancah yang dideselularisasi sebagai perangkat medis tidak cukup untuk menjamin pemulihan jaringan penuh. Tantangan utama yang menghambat integrasi fungsional lengkap dari perancah yang diimplan adalah pencapaian persarafan yang memadai dan tepat waktu oleh sistem saraf tepi inang. [ 18 ] Penggunaan dSkM yang pra-semai dengan sel otot (yaitu, dSkM yang direselularisasi, di sini didefinisikan sebagai rSkM) telah terbukti menjadi solusi paling efisien untuk memperbaiki cacat hernia diafragma pada model hewan, karena sudah dapat memberikan sitostruktur yang terorganisir dengan baik dan berfungsi [ 19 ]yang dapat mendukung regenerasi SkM yang dipersarafi. Akan tetapi, penggunaan rSkM pada pasien yang terkena kondisi kehilangan otot volumetrik bawaan atau traumatis belum pernah dilaporkan, dan tidak ada metode yang tersedia saat ini untuk memprediksi respons sel manusia terhadap konstruksi reselularisasi dalam hal regenerasi miogenik, integrasi neuronal, dan pembentukan NMJ fungsional. Memang, saat ini, konstruksi rekayasa jaringan yang dihumanisasi ini harus ditanamkan secara in vivo dalam lingkungan xenogenik untuk mengevaluasi sifat integrasinya, sehingga meningkatkan aspek pembatas yang terkait dengan prediksi respons manusia yang tepat. [ 20 , 21 ]

Organoid yang berasal dari sel punca embrionik atau sel punca pluripoten manusia yang diinduksi (hiPSC) baru-baru ini diturunkan untuk memungkinkan produksi model in vitro yang mengandung kompartemen otot dan saraf isogenik yang tersusun menjadi sferoid – yang di sini kami sebut sebagai organoid neuromuskular (NMO). [ 22 – 25 ] Komponen saraf dan otot dalam NMO berkembang secara paralel, mengkompartementalisasi diri, dan berinteraksi untuk membentuk jaringan NM fungsional dengan pembentukan NMJ dan kontraksi miofiber berikutnya. [ 22 , 24 , 26 – 28 ] Oleh karena itu, NMO tersebut telah digunakan untuk memodelkan dan mempelajari sistem NM manusia secara in vitro dalam kesehatan dan penyakit. [ 22 – 25 ] Kami juga baru-baru ini memperoleh NMO rekayasa jaringan melalui penyemaian langsung hiPSC ke dSkM, yang menawarkan lingkungan ekstraseluler 3D
ang mampu meningkatkan kematangan NMO dan meniru fenotipe miogenik Duchenne Muscular Dystrophy in vitro. [ 29 ] Selain itu, Shin dan koleganya baru-baru ini menunjukkan bahwa organoid SkM yang diperoleh dari hiPSC dapat digunakan untuk meniru dan mempelajari miogenesis dan regenerasi SkM manusia in vitro setelah kerusakan akut dengan kardiotoksin. [ 24 ] Khususnya, organoid SkM yang dijelaskan juga memiliki kompartemen neuronal. [ 24 ] Karena laporan baru-baru ini, teknologi NMO sekarang dianggap sebagai alat yang berharga untuk mempelajari dan memprediksi respons sistem NM manusia terhadap kerusakan dan/atau pengobatan.

Di sini kami bertujuan untuk mempelajari secara in vitro respons sistem NM manusia terhadap konstruksi SkM yang direkayasa yang dapat diaplikasikan dalam pengobatan regeneratif. Untuk melakukannya, kami menggabungkan teknologi NMO dengan pendekatan rekayasa jaringan SkM, untuk mengembangkan model assembloid SkM graft-host di mana interaksi konstruksi yang direkayasa dan sistem NM manusia dan responsnya terhadap kerusakan akut dapat dipelajari. Secara khusus, assembloid adalah model in vitro yang menggabungkan dua atau lebih organoid, spheroid, atau tipe sel yang dikultur untuk merangkum sifat struktural dan fungsional suatu organ atau sistem. [ 30 ] Kami menggunakan produk berbasis dSkM sebagai cangkokan donor rekayasa jaringan SkM dan NMO sebagai kompartemen penerima untuk mendapatkan assembloid yang direkayasa. Kami menemukan bahwa progenitor otot manusia pra-penyemaian (hMPC) dalam perancah (SkM yang direselularisasi, rSkM) mendorong invasi sel inang NMO ke konstruksi yang direkayasa, jika dibandingkan dengan perancah yang disediakan sebagai perangkat (dSkM dianggap tanpa hMPC pra-penyemaian), dengan integrasi fungsional dan pembentukan NMJ. Lebih jauh, kami memaparkan assembloid NMO-rSkM pada kerusakan akut melalui pengobatan kardiotoksin dan kami menemukan bahwa assembloid tersebut mampu beregenerasi, menyelamatkan fungsi SkM dan sebagian NMJ.

Implikasi dari penelitian kami signifikan dan dapat berkontribusi pada kemajuan dalam rekayasa jaringan dan pengobatan regeneratif sistem NM manusia, membuka perspektif baru untuk penerapan cangkokan SkM yang direkayasa kepada pasien. Selain itu, kemungkinan menganalisis interaksi antara sistem NM manusia dan SkM yang direkayasa dan sebaliknya secara saksama merupakan aspek biologis menarik yang dapat meningkatkan pengetahuan kita tentang regenerasi sistem NM manusia.

2 Hasil
2.1 Assembloids dapat diperoleh dengan menggabungkan dSkM Scaffolds atau rSkM Tissue-Engineered Constructs dan NMOs
Dengan tujuan untuk menyelidiki integrasi antara sistem NM asal manusia dan konstruksi otot yang direkayasa, kami awalnya membudidayakan NMO yang berasal dari sel punca pluripoten terinduksi manusia (hiPSC) [ 29 ] dengan biomaterial perancah dSkM (dinamakan assembloids NMO-dSkM) atau dengan konstruksi rSkM 7-hari [ 31 ] (dinamakan assembloids NMO-rSkM; Gambar 1a ). Sepanjang keseluruhan penelitian, kami secara bergantian menggunakan hiPSC tipe liar dan hiPSC yang secara konstitutif mengekspresikan protein fluoresensi hijau (GFP) di bawah kendali promotor 3-fosfogliserat kinase untuk memperoleh NMO (Gambar S1 , Informasi Pendukung). Kami menggunakan GFP-NMO untuk dengan mudah mengikuti lokalisasi sel yang berasal dari NMO dalam konstruksi SkM rekayasa kami, sementara NMO tipe liar digunakan untuk analisis pencitraan khusus di mana sinyal GFP dapat mengganggu – termasuk pencitraan langsung Fluo-4 dan analisis imunofluoresensi. Setelah pemilihan dan penyortiran GFP-hiPSC bila diperlukan (Gambar S1a,b , Informasi Pendukung), sel dikarakterisasi untuk penanda terkait pluripotensi (Gambar S1c–e , Informasi Pendukung) dan digunakan untuk menghasilkan NMO sferoidal yang dirakit sendiri (Gambar S2 , Informasi Pendukung). NMO diturunkan menggunakan protokol diferensiasi berbasis molekul kecil dengan adanya tetesan Matrigel hingga hari ke-22 (D22) dari awal periode diferensiasi [ 29 ] (Gambar S2a , Informasi Pendukung). Awalnya, kami mengonfirmasi bahwa ekspresi GFP masih ada pada tahap diferensiasi NMO ini (Gambar S2b , Informasi Pendukung). Kami menemukan bahwa NMO D22 menunjukkan kompartementalisasi otot dan saraf, dengan jaringan saraf yang mencapai sel-sel yang mengekspresikan desmin (DES) memanjang (Gambar S2c,d , Informasi Pendukung). Seperti yang ditunjukkan oleh analisis imunofluoresensi, NMO D22 juga memiliki sel induk yang mengekspresikan paired box protein 7 (PAX7) dan sel progenitor positif myogenic committed myogenin (MYOG), yang dikaitkan dengan miofiber yang mengekspresikan rantai berat miosin embrionik (eMHC) yang bersentuhan dengan laminin (LAM) yang disimpan dalam matriks ekstraseluler (Gambar S2e–h , Informasi Pendukung).

Gambar 1
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
NMO terintegrasi dalam dSkM dan rSkM untuk membentuk assembloid SkM graft-host. a) Ilustrasi skema yang menunjukkan strategi yang digunakan untuk mengkultur bersama NMO dan dSkM (NMO-dSkM, oranye) atau rSkM (NMO-rSkM, biru muda). NMO berasal dari hiPSC setelah 22 hari (D22 NMO) diferensiasi NM. rSkM dihasilkan setelah injeksi hMPC dalam dSkM 7 hari (D7 rSkM) sebelum penyemaian NMO. Daftar akronim: dSkM: otot rangka yang dideselularisasi; hMPC: sel progenitor otot manusia; hiPSC: sel punca pluripoten yang diinduksi manusia; D22 NMO: organoid neuromuskular hari ke-22; D7 rSkM: konstruksi otot rangka yang direselularisasi hari ke-7; NMO-dSkM: konstruksi yang diperoleh dari NMO yang dikombinasikan dengan dSkM; NMO-rSKM: konstruksi yang diperoleh dari NMO yang dikombinasikan dengan rSkM. b) Gambar mikroskop stereo fluoresensi dan medan terang (BF) representatif yang menunjukkan perkembangan GFP-NMO pada hari ke-1 (D1), hari ke-5 (D5) dan hari ke-10 (D10) setelah penyemaian pada dSkM (NMO-dSkM, panel atas) atau pada rSkM (NMO-rSkM, panel bawah). Skala batang, 1 mm. c) Panel kiri atas dan tengah, gambar imunofluoresensi konfokal tumpukan-Z representatif dari seluruh NMO-dSkM setelah 10 hari kultur bersama (D10 NMO-dSkM) yang diwarnai untuk DESMIN (hijau) dan TUJ1 (merah). Panel kanan atas, gambaran imunofluoresensi konfokal tumpukan-Z representatif dari seluruh NMO-dSkM setelah 10 hari kultur bersama (D10 NMO-dSkM) diwarnai untuk sel-sel positif DESMIN (hijau) yang menyerang dSkM. Nukleus diwarnai tandingan dengan Hoechst (biru). Batang skala, 200 µm. Panel bawah, gambaran imunofluoresensi konfokal tumpukan-Z representatif dari seluruh NMO-rSkM setelah 10 hari kultur bersama (D10 NMO-rSkM) diwarnai untuk DESMIN (hijau) dan TUJ1 (merah). Panel kanan, nukleus diwarnai tandingan dengan Hoechst (biru). Batang skala, 500 µm (kiri), 50 µm (tengah), 100 µm (kanan). d) Gambar mikroskop stereo fluoresensi dan medan terang representatif (BF) yang menunjukkan perluasan GFP-NMO setelah 1 hari (D1) dan 35 hari (D35) sejak penyemaian pada dSkM (NMO-dSKM) atau rSkM (NMO-rSKM). Garis merah muda digunakan untuk melacak perubahan morfologi bentuk konstruksi keseluruhan pada dua titik waktu kultur bersama. Skala batang, 1 mm. e) Variasi area NMO (µm 2 ) selama waktu kultur (hari), dinyatakan sebagai perbedaan antara area GFP + pada hari ke-n dan area GFP + pada hari ke-1 kultur bersama. Data ditampilkan sebagai mean ± SEM dari n > 9 replikasi independen. Signifikansi statistik ditentukan menggunakan uji Mann-Whitney U; *** p = 0,0008 pada hari ke 35 (0,99 × 10 7 ± 0,09 × 10 7 µm 2 versus 0,53 × 10 7 ± 0,06 × 10 7 µm 2 ). f) Variasi luas perancah (µm 2) selama waktu kultur (hari), dinyatakan sebagai perbedaan antara luas perancah pada hari ke-n dan luas perancah pada hari ke-1 kultur bersama. Data ditampilkan sebagai mean ± SEM dari n>9 replikasi independen. Signifikansi statistik ditentukan menggunakan uji Mann-Whitney U; **** p < 0,0001 pada hari ke-35 (−0,91 × 10 7 ± 0,07 × 10 7 µm 2 vs −0,25 × 10 7 ± 0,06 × 10 7 µm 2 ). g) Rasio antara luas NMO dan luas perancah, dinyatakan dalam persentase. Data ditampilkan sebagai mean ± SEM dari n > 9 replikasi independen. Signifikansi statistik ditentukan menggunakan uji Mann-Whitney U; **** p < 0,0001 pada hari ke 35 (84,02 ± 3,52% vs 34,04 ± 3,92%).
Untuk menghasilkan konstruksi SkM manusia yang direkayasa jaringan, kami menggunakan protokol deselularisasi yang telah dikarakterisasi dengan baik untuk memperoleh dSkM dari diafragma tikus, [ 32 , 33 ] yang digunakan per se (dSkM) atau direselularisasi (rSkM) dengan hMPC yang diisolasi dari biopsi otot yang sehat. [ 34 ] Kami telah menunjukkan bahwa dSKM menopang pencangkokan, proliferasi, dan diferensiasi hMPC, menghasilkan konstruksi rekayasa jaringan rSkM 3D yang cocok untuk implantasi in vivo. [ 19 ] Namun, sebelum digunakan untuk menghasilkan rSkM, kami memperluas dan mengkarakterisasi hMPC dalam kultur (Gambar S3a , Informasi Pendukung) yang mengonfirmasi bahwa mereka memiliki tingkat sel yang tinggi dari sel yang mengekspresikan CD56 (94,18% ± 2,22%) dan MYOD (99,22% ± 0,17%) dan tingkat sel positif MYOG yang rendah (3,86% ± 0,61%) (Gambar S3b–d , Informasi Pendukung). Sesuai dengan penelitian sebelumnya, [ 31 , 34 ] sebagian kecil fibroblas TE7 + (0,93% ± 0,15%) juga diidentifikasi dalam kultur hMPC primer (Gambar S3e , Informasi Pendukung). Akhirnya, untuk mengonfirmasi kemampuan miogenik hMPC, kami mengevaluasi dan mengukur tingkat proliferasi dan kemampuan untuk membentuk miotube secara in vitro (Gambar S3f,g , Informasi Pendukung).

Untuk memahami kelayakan assembloids rekayasa NMO/SkM, pertama-tama kami melakukan percobaan jangka pendek dengan menyemai D22 GFP-NMO ke dSkM atau rSkM, dan dengan mengkulturkan assembloids selama 10 hari (Gambar 1b ). Dalam kedua kasus (assembloids NMO-dSkM dan NMO-rSkM), sel-sel yang berasal dari NMO terintegrasi dalam produk rekayasa jaringan, seperti yang ditunjukkan oleh perkecambahan komponen saraf dan otot yang diamati dalam sampel mount utuh yang diimunostain untuk proyeksi neuronal TUJ1 + dan sel-sel miogenik DES + , masing-masing (Gambar 1c ). Selama waktu kultur dan pada titik waktu yang lebih lama (35 hari), kami mengamati invasi sel-sel yang mengekspresikan GFP dalam perancah dan penampilan kasar diferensial dari assembloids NMO-dSkM dan NMO-rSkM (Gambar 1b,d ; Gambar S4a,b , Informasi Pendukung). Secara khusus, kami menemukan bahwa baik bentuk SkM rekayasa jaringan maupun bentuk GFP-NMO secara nyata diremodelasi dalam NMO-rSkM setelah 35 hari co-culture jika dibandingkan dengan assembloids NMO-dSkM pada titik waktu yang setara (Gambar 1d ). Untuk mengukur pengamatan tersebut, kami memantau kultur NMO-rSkM dan NMO-dSkM, dan kami mengukur dari waktu ke waktu (dari hari ke-0 hingga hari ke-35) area yang ditempati oleh sel GFP + (Gambar 1e ), variasi area scaffold (Gambar 1f ), dan rasionya (Gambar 1g ). Kami mengonfirmasi bahwa NMO menunjukkan peningkatan kemampuan untuk menyebar, merombak, dan menginvasi scaffold saat bersentuhan dengan konstruksi hMPC yang telah disemai sebelumnya – , yaitu, assembloids NMO-rSkM (Gambar 1d–g ). Menariknya, kami juga menemukan bahwa hMPC memiliki kemampuan untuk merombak dSkM selama masa kultur – yaitu, sampel rSkM (Gambar S4c ,d , Informasi Pendukung). Secara keseluruhan data ini menunjukkan bahwa dSkM dan rSkM dapat diinvasi oleh sistem NM manusia yang berasal dari NMO secara in vitro, menghasilkan assembloid SkM graft-host.

2.2 Pra-Penyemaian hMPC ke dalam dSkM Meningkatkan Miogenesis dan Fungsionalitas Otot pada Assembloids NMO-rSkM
Masih menjadi bahan diskusi di lapangan apakah pra-penyemaian konstruksi rekayasa jaringan dengan sel dapat meningkatkan integrasi cangkokan dengan sel penerima. Untuk tujuan ini, kami membandingkan assembloid NMO-dSkM dan NMO-rSkM setelah 35 hari kultur untuk memahami apakah pra-penyemaian hMPC ke dalam dSkM dapat meningkatkan integrasi NMO dan keseluruhan miogenesis serta fungsionalitas otot dari model assembloid in vitro kami. Sebagai kontrol, rSkM disertakan dalam analisis untuk memantau perilaku sampel tanpa adanya kontribusi NMO. Pertama, kami melakukan analisis morfometrik untuk mengevaluasi keberadaan, lokalisasi, dan organisasi sel miogenik terdiferensiasi dalam sampel. Kami mengonfirmasi invasi perancah oleh sel yang disemai di semua sampel, seperti yang ditunjukkan oleh analisis imunofluoresensi inti dan laminin (Gambar S4e , Informasi Pendukung). Walaupun semua sampel menunjukkan sel-sel DES + miogenik yang memanjang, kami menemukan bahwa sel-sel tersebut terlokalisasi secara luas dalam assembloids NMO-rSkM, diidentifikasi sebagai kumpulan diskret dalam assembloids NMO-dSkM, dan sebagai sel yang lebih sedikit dalam sampel rSkM ( Gambar 2a,b ; Gambar S4f , Informasi Pendukung). Dengan demikian, dengan tahap perkembangan yang diharapkan dari miotube (yaitu, dari hMPC dewasa atau NMO fetal/neonatal), kami juga menemukan bahwa rSkM menampilkan miotube tebal yang secara statistik signifikan (15,53 ± 0,63 µm) jika dibandingkan dengan NMO-dSkM dan NMO-rSkM assembloids, dengan keberadaan banyak namun miotube tipis pada yang pertama (7,71 ± 0,21 µm), dan banyak dan miotube yang secara signifikan lebih tebal pada yang terakhir (10,32 ± 0,26 µm; Gambar 2a,c ).

Gambar 2
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Miogenesis dan fungsi otot ditingkatkan dalam assembloids NMO-rSkM. a) Gambar imunofluoresensi konfokal tumpukan-Z representatif dari seluruh dudukan rSkM (panel kiri), NMO-dSkM (panel tengah) atau NMO-rSkM (panel kanan) setelah 35 hari (D35) kultur bersama, diwarnai untuk DESMIN (hijau). Batang skala, 100 µm. b) Kuantifikasi intensitas fluoresensi total yang dikoreksi yang dinormalisasi untuk sinyal latar belakang yang dilakukan pada pewarnaan imunofluoresensi DESMIN. Data ditampilkan sebagai mean ± SEM dari 36 ROI per kondisi (tiga gambar per kondisi, untuk setiap gambar 12 ROI dipilih dan dikuantifikasi). Signifikansi statistik ditentukan menggunakan uji Mann-Whitney U; **** p < 0,0001. Hasil statistik dilaporkan dalam Tabel S1 (Informasi Pendukung). c) Kuantifikasi penampang melintang miotube DESMIN+ (ketebalan) yang dilakukan pada gambar imunofluoresensi seluruh dudukan rSkM, NMO-dSkM, dan NMO-rSkM setelah 35 hari (D35) kultur. Data ditampilkan sebagai rerata ± SEM dari >100 penampang melintang miotube, diukur pada 3 sampel independen per kondisi; signifikansi statistik ditentukan menggunakan uji Mann-Whitney U; **** p < 0,0001. Hasil statistik dilaporkan dalam Tabel S2 (Informasi Pendukung). d) Gambar imunofluoresensi konfokal representatif dari penampang melintang rSkM, NMO-dSkM, dan NMO-rSkM, diwarnai untuk PAX7 (merah) dan MYOG (hijau). Nukleus diwarnai tandingan dengan Hoechst (biru). Skala batang, 50 µm. e) Ekspresi gen PAX7 dalam rSkM, NMO-dSkM, dan NMO-rSkM. Data dinormalkan ke housekeeping ekspresi gen B2-microglobulin dan ditampilkan sebagai perubahan lipat atas NMO. Data ditampilkan sebagai mean ± sd dari tiga replikasi biologis independen untuk rSkM dan NMO-dSkM dan dari enam replikasi biologis independen untuk NMO-rSkM. Hasil statistik dilaporkan dalam Tabel S3 (Informasi Pendukung). f) Ekspresi gen MYOG dalam rSkM, NMO-dSkM, dan NMO-rSkM. Data dinormalkan ke housekeeping ekspresi gen B2-microglobulin dan ditampilkan sebagai perubahan lipat atas NMO. Data ditampilkan sebagai mean ± sd dari tiga replikasi biologis independen untuk rSkM dan NMO-dSkM dan dari 6 replikasi biologis independen untuk NMO-rSkM. Hasil statistik dilaporkan dalam Tabel S4 (Informasi Pendukung). g) Gambaran imunofluoresensi konfokal tumpukan-Z representatif, penampang lintang NMO-rSkM pada hari ke-35 dari kultur bersama yang diwarnai untuk MYOG (merah) dan PAX7 (hijau). Inti diwarnai dengan Hoechst (abu-abu). Batang skala, 50 µm (a). h) Kuantifikasi sel PAX7 + dan PAX7 − pada total sel dalam sampel yang tidak diobati dan dinyatakan dalam persentase. Data ditampilkan sebagai rata-rata ± sd dari n>10 gambar, diambil pada tiga replikasi biologis independen. Signifikansi statistik ditentukan menggunakan uji Mann-Whitney U; *** p = 0,0005. i) Gambaran imunofluoresensi konfokal tumpukan-Z representatif dari penampang lintang NMO-rSkM pada hari ke-35 kultur bersama yang diwarnai untuk PAX7 (merah) dan Ki67 (hijau). Inti diwarnai tandingan dengan Hoechst (biru). Batang skala, 50 µm. j) Kuantifikasi sel PAX7 + Ki67 + dan PAX7 + Ki67 − pada total sel PAX7 + dalam sampel yang tidak diobati dan dinyatakan dalam persentase. Data ditampilkan sebagai rerata ± SEM dari n > 10 gambar, diambil pada 2 replikasi biologis independen. k) Gambaran imunofluoresensi konfokal representatif penampang lintang NMO-rSkM pada hari ke-35 kultur bersama yang menunjukkan lokalisasi PAX7 yang berbeda (merah) di luar (panel kiri) atau di bawah (panel kanan) lamina basal (LAM, hijau). Batang skala, 10 µm. Saluran tunggal dan pewarnaan nuklei dilaporkan dalam Gambar S5i (Informasi Pendukung). l) Kuantifikasi PAX7+ yang terlokalisasi di luar atau di bawah lamina basal pada total sel PAX7 + dalam sampel yang tidak diobati dan dinyatakan dalam persentase. Data ditampilkan sebagai mean ± sd dari n > 10 gambar, diambil pada tiga replikasi biologis independen. Signifikansi statistik ditentukan menggunakan uji Mann-Whitney U; **** p < 0,0001. m) Ilustrasi skema yang menunjukkan strategi yang digunakan untuk menilai fungsionalitas kompartemen otot sebagai respons terhadap pemberian ACh eksogen. n) Kuantifikasi representatif dari variasi intensitas fluoresensi mean yang dinormalisasi yang terdaftar selama analisis pencitraan langsung dari D35 rSkM, NMO-dSkMs dan NMO-rSkMs, yang distimulasi dengan ACh. Data ditampilkan sebagai mean dari 9 ROI, 3 ROI dipilih dari masing-masing 3 replikasi independen; pengukuran dengan batang galat dilaporkan dalam Gambar S6a–c (Informasi Pendukung). Garis putus-putus sesuai dengan garis dasar yang sama dengan 0. o) Kuantifikasi kontraksi rSkM, NMO-dSkM atau NMO-rSkM pada D35 setelah pemberian ACh eksogen dinyatakan sebagai puncak maksimum fluoresensi yang terungkap melalui analisis pencitraan langsung. Kuantifikasi dilakukan pada 3 replikasi biologis independen, yang diidentifikasi dengan bentuk simbol yang berbeda dalam grafik. Setiap sampel independen dibagi menjadi 5 ROI dan setiap titik mewakili ROI tunggal. Signifikansi statistik ditentukan menggunakan uji Mann-Whitney U; ns, tidak signifikan secara statistik, ** p = 0,0066, *** p = 0,0001. Hasil statistik dilaporkan dalam Tabel S5 (Informasi Pendukung). p) Ekspresi gen MYHC 2A dalam NMO-dSkMs dan NMO-rSkMs. Data dinormalisasi ke ekspresi gen MYHC dan ditampilkan sebagai perubahan lipat pada NMO-dSkMs. Data ditampilkan sebagai mean ± sd dari tiga replikasi biologis independen. Signifikansi statistik ditentukan menggunakan uji-t tidak berpasangan; **** p < 0,0001.
Selain sel-sel miogenik yang berdiferensiasi terminal, kami juga mengevaluasi apakah rSKM, NMO-dSkM, dan NMO-rSkM dapat memiliki sel punca otot (sel yang mengekspresikan PAX7) dan sel-sel berkomitmen miogenik (yang mengekspresikan MYOG) setelah 35 hari kultur. Analisis imunofluoresensi menunjukkan bahwa baik assembloids NMO-dSkM maupun NMO-rSkM memiliki sel-sel miogenik yang berkomitmen dan punca (Gambar 2d ; Gambar S5 , Informasi Pendukung). Tidak adanya sel-sel yang mengekspresikan PAX7 dan sejumlah kecil sel-sel yang mengekspresikan MYOG dalam rSkM, secara kuat menunjukkan bahwa NMO adalah kontributor utama bagi populasi sel-sel miogenik yang berkomitmen dan punca yang terungkap dalam NMO-dSkM dan NMO-rSkM (Gambar 2d–f ; Gambar S5a–e , Informasi Pendukung). Dengan demikian, dengan tahap diferensiasi miogenik yang diamati, kami juga mengidentifikasi sel-sel yang mengekspresikan MYOD menggunakan analisis imunofluoresensi (Gambar S5f , Informasi Pendukung). Karena setelah 35 hari kultur, assembloid NMO-rSkM menyajikan persentase sel PAX7 + yang relevan (40% ± 2,2%, Gambar 2g,h ), kami mengkarakterisasinya lebih lanjut. Lebih dari 90% sel PAX7 + tidak berproliferasi secara aktif, dan hanya 6,28% ± 1,66% yang mengekspresikan penanda proliferasi Ki67 (Gambar 2i,j ). Menariknya, sel-sel PAX7 + ditemukan dalam posisi anatomi yang terdefinisi dengan baik, dengan ≈12% sel PAX7 + terletak di bawah lamina basal serat otot (Gambar 2k,l ; Gambar S5g–i , Informasi Pendukung), yang mendefinisikan posisi anatomi spesifik sel-sel satelit. [ 35 , 36 ] Setelah mengonfirmasi keberadaan sel SkM di semua sampel, kami kemudian mengevaluasi kemampuan model ini untuk berkontraksi saat distimulasi dengan asetilkolin (ACh) dengan mengukur variasi intensitas fluoresensi yang terkait dengan kontraksi otot selama analisis pencitraan langsung (Gambar 2m ). Sampel SkM yang direselularisasi, terutama terdiri dari miotube matang yang jarang di dalam matriks ekstraseluler perancah (Gambar S4f , Informasi Pendukung), mampu merespons pemberian ACh eksogen dengan variasi intensitas kontraksi yang sebanding dengan assembloid NMO-dSkM (273,65 ± 43,79 AU versus 366,56 ± 121,45 AU), yang sebaliknya memiliki miotube yang lebih banyak tetapi lebih kecil (Gambar 2n,o ; Gambar S6a,b (Informasi Pendukung) Video S1 , Video Tambahan 1). Sebaliknya, NMO-rSkMs merespons dengan kontraksi yang jauh lebih tinggi terhadap pemberian ACh jika dibandingkan dengan sampel lainnya (823,65 ± 138,28 AU; Gambar 2n,o ; Gambar 2n,o ).S6a–c (Informasi Pendukung) dan Video Tambahan S1 , Video Tambahan 1). Hal ini sejalan dengan adanya kontribusi miotube dari MPC dewasa dan NMO. Dengan demikian, ekspresi gen rantai berat miosin 2A ( MYHC 2A ) [ 37 ] meningkat secara signifikan pada NMO-rSkM, jika dibandingkan dengan NMO-dSkM (Gambar 2p ).

Hasil-hasil ini mengonfirmasi integrasi otot NMO dalam konstruksi rekayasa jaringan untuk membentuk assembloid SkM graft-host dan menunjukkan bahwa pra-penyemaian hMPC dalam dSkM meningkatkan miogenesis dan fungsionalitas otot dalam NMO-rSkM.

2.3 Assembloids NMO-rSkM Memiliki NMJ Fungsional setelah 35 Hari Ko-Kultur
Berdasarkan hasil di atas, kami memfokuskan penelitian kami berikutnya pada NMO-rSkM ( Gambar 3a ). Salah satu aspek yang paling membatasi dalam aplikasi implan otot in vivo adalah pencapaian persarafan yang memadai dan tepat waktu oleh sistem saraf tepi inang. [ 18 ] Atas alasan ini, kami menganalisis keberadaan NMJ fungsional dalam assembloids NMO-rSkM. Dari sudut pandang umum, assembloids NMO-rSkM hari ke-35 menampilkan akson positif neurofilamen (NF) yang kuat dan lebar yang menyebar dari badan pusat NMO ke bagian distal sel yang mengekspresikan aktin sarkomerik alfa (αSA) (Gambar 3b ). Assembloids NMO-rSkM tampak terintegrasi dengan baik seperti yang ditunjukkan oleh mikroskop elektron pemindaian dan pewarnaan histologis (Gambar S6d–f , Informasi Pendukung). Selain itu, bersama dengan ekspresi faktor transkripsi kunci miogenik (Gambar S5 dan S7a , Informasi Pendukung), kami menemukan keberadaan sel otot pendukung seperti fibroblas TE7 + (Gambar 3c ), deposisi lamina basal (Gambar 3d ) dan keberadaan sel otot yang mengekspresikan protein yang penting untuk kontraksi mereka, seperti MHC lambat dan cepat dan TITIN sarkomerik (Gambar 3e,f ). Berdasarkan keberadaan kompartemen neuronal yang meluas ke arah otot (Gambar S7b , Informasi Pendukung), kami lebih lanjut mengkarakterisasinya dengan menggabungkan analisis imunofluoresensi dan ekspresi gen. Secara khusus, kami menemukan keberadaan progenitor saraf yang mengekspresikan faktor nuklir Box 6 berpasangan (PAX6) dan faktor transkripsi SRY-box 2 (SOX2), [ 38 ] sementara ekspresi faktor transkripsi LIM/keluarga homeodomain faktor transkripsi ISLET1, gen homeobox penentu neuron motorik (MN) MNX1 (yaitu, HB9), dan kolin asetiltransferase (CHAT), [ 39 ] sangat menyarankan keberadaan MN (Gambar 3g ; Gambar S7c–e , Informasi Pendukung).

Gambar 3
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Assembloid NMO-rSkM memiliki NMJ fungsional setelah 35 hari kultur bersama. a) Ilustrasi skema yang menunjukkan representasi pengaturan kultur bersama NMO-rSkM. b) Gambar imunofluoresensi konfokal tumpukan-Z representatif dari seluruh NMO-rSkM yang diwarnai untuk NEUROFILAMENT (NF, merah) dan alpha-SARCOMERIC ACTININ (αSA, hijau). Nukleus diwarnai tandingan dengan Hoechst (biru). Skala batang, 1 mm. c) Gambar imunofluoresensi konfokal tumpukan-Z representatif dari penampang melintang NMO-rSkM yang diwarnai untuk TE7 (merah) dan LAMININ (hijau). Nukleus diwarnai tandingan dengan Hoechst (biru). Skala batang, 50 µm. d) Gambar imunofluoresensi konfokal tumpukan-Z representatif dari penampang melintang NMO-rSkM yang diwarnai untuk F-actin (merah) dan LAMININ (hijau). Nukleus diwarnai tandingan dengan Hoechst (biru). Skala batang, 20 µm. e) Gambar imunofluoresensi konfokal tumpukan-Z representatif dari penampang lintang NMO-rSkM yang diwarnai untuk MYOSIN HEAVY CHAIN ​​(MHC, merah) yang lambat dan MHC yang cepat (hijau). Nukleus diwarnai tandingan dengan Hoechst (biru). Skala batang, 50 µm. f) Gambar imunofluoresensi konfokal tumpukan-Z representatif dari penampang lintang NMO-rSkM yang diwarnai untuk TITIN (hijau). Nukleus diwarnai tandingan dengan Hoechst (biru). Skala batang, 20 µm. Sisipan menunjukkan perbesaran yang lebih tinggi, yang menunjukkan organisasi sarkomerik dari sitoskeleton miofiber yang disorot oleh kepala panah. g) Ekspresi gen ISL1 dalam rSkM dan dalam NMO-rSkM. Data dinormalisasi ke ekspresi gen B2-microglobulin housekeeping dan ditampilkan sebagai perubahan lipat pada rSkM. Data ditampilkan sebagai mean ± sd dari tiga replikasi biologis independen untuk rSkM dan enam replikasi biologis independen untuk NMO-rSkM. Uji Mann-Whitney U; ns, tidak signifikan secara statistik; * p = 0,0238. h. Gambar imunofluoresensi konfokal tumpukan-Z representatif dari penampang lintang NMO-rSkM yang diwarnai untuk daerah TUJ1 (merah), DESMIN (cyan) dan α-bungarotoxin + (BTX) (hijau). Nukleus diwarnai tandingan dengan Hoechst (biru). Pembesaran yang lebih tinggi pada Gambar 3g . ditampilkan dalam h) Panah putih menunjukkan dugaan NMJ di mana sinyal terlokalisasi bersama. Batang skala, 50 µm (g) dan 10 µm (h). i) Gambar imunofluoresensi konfokal tumpukan-Z representatif dari potongan melintang NMO-rSkM yang diwarnai untuk TUJ1 (merah), BTX (hijau) dan S100β (sian). Inti diwarnai dengan Hoechst (abu-abu). Batang skala, 20 µm (panel atas) dan 10 µm (panel bawah). Panah putih menunjukkan dugaan NMJ tempat sinyal terlokalisasi bersama. j. Ekspresi gen ACHRɣ dalam rSkM dan dalam NMO-rSkM. Data dinormalisasi ke ekspresi gen B2-mikroglobulin dan ditampilkan sebagai perubahan lipat atas rSkM. Data ditampilkan sebagai rata-rata ± sd dari tiga replikasi biologis independen untuk rSkM dan enam replikasi biologis independen untuk NMO-rSkM. Uji Mann-Whitney U; * p = 0,0476. k) Ekspresi gen ACHRε dalam rSkM dan dalam NMO-rSkM. Data dinormalisasi ke tata grahaEkspresi gen B2-mikroglobulin dan ditunjukkan sebagai perubahan lipat pada rSkM. Data ditunjukkan sebagai rata-rata ± sd dari tiga replikasi biologis independen untuk rSkM dan enam replikasi biologis independen untuk NMO-rSkM. Uji Mann-Whitney U; * p = 0,0238. l, m) Kuantifikasi representatif dari variasi intensitas fluoresensi rata-rata yang dinormalkan yang tercatat selama analisis pencitraan langsung NMO-rSkM atau NMO-rSkM yang diobati selama 12 jam dengan BTX dan distimulasi dengan Glu (l) atau ACh (n). Data ditunjukkan sebagai rata-rata ± SEM dari 15 ROI (5 ROI per sampel, dari tiga replikasi biologis independen) untuk NMO-rSkM yang tidak diobati (garis biru muda). Data ditunjukkan sebagai rata-rata ± SEM dari 10 ROI (5 ROI per sampel, dari dua replikasi biologis independen) untuk NMO-rSkM yang diobati semalam dengan BTX (garis merah tua). Garis putus-putus sesuai dengan garis dasar yang sama dengan 0. Hasil statistik dilaporkan dalam Tabel S6 (Informasi Pendukung). n, o) Kuantifikasi amplitudo puncak kalsium (ΔF/F0) yang dideteksi dengan analisis pencitraan langsung Fluo-4 dari rSkM ( n = 2), NMO-rSkM ( n = 4) atau NMO-rSkM setelah pengobatan BTX ( n = 2) setelah pemberian Glu (m) atau ACh (o). Puncak intensitas fluoresensi (F) selama stimulasi diukur dan dinormalisasi ke intensitas fluoresensi dasar yang tercatat sebelum stimulasi neurotransmitter (F0). Uji Mann-Whitney U; ns, tidak signifikan secara statistik; **** p < 0,0001. Hasil statistik dilaporkan dalam Tabel S7 (Informasi Pendukung).
Dengan demikian, kami juga mengidentifikasi elemen pra- dan pasca-sinaptik yang berdampingan dari NMJ pada posisi yang diharapkan secara anatomis (Gambar 3h ; Gambar S7f , Informasi Pendukung). Selain itu, dalam kontak dekat antara tonjolan neuron TUJ1 + dan sinyal alfa-bungarotoxin (BTX + ), kami mengidentifikasi keberadaan sel S100B + (Gambar 3i ; Gambar S7g , Informasi Pendukung), yang menunjukkan keberadaan sel Schwann terminal. [ 22 ] Semua data ini juga didukung oleh ekspresi isoform reseptor ACh yang berbeda ( ACHRγ dan ACHRε ), yang diketahui terkait dengan pematangan NMJ , [ 40 ] yang secara statistik diekspresikan secara berlebihan dalam NMO-rSkMs jika dibandingkan dengan rSkMs (Gambar 3j,k ).

Untuk menguji apakah NMJ yang teridentifikasi juga fungsional, kami menstimulasi NMO-rSkM dengan glutamat (Glu) dan mengevaluasi kontraksi otot. In vivo, Glu menstimulasi MN untuk melepaskan ACh di NMJ, yang menginduksi kontraksi otot. [ 40 ] Sesuai dengan itu, kami menemukan bahwa stimulasi yang dimediasi Glu menghasilkan kontraksi assembloid NMO-rSkM dan peningkatan signifikan lonjakan kalsium di kompartemen otot, sehingga mengindikasikan keberadaan NMJ fungsional (Gambar 3l,m ; Gambar S7h–j (Informasi Pendukung) dan Video S2 , Video Tambahan 2). Yang penting, transien kalsium tidak terungkap dalam sampel rSkM, yang tidak memiliki kompartemen neuronal dan dengan demikian tidak memiliki NMJ, yang menunjukkan spesifisitas aksi Glu pada tingkat otot melalui stimulasi neuronal (Gambar 3m ). Bahasa Indonesia: Sesuai kesepakatan, kontraksi otot yang dimediasi Glu dan respons kalsium dihapuskan setelah pengobatan dengan BTX, yang diketahui memblokir NMJ pada tingkat postsinaptik [ 40 ] (Gambar 3l,m ; Gambar S7i , Informasi Pendukung). Sebagai kontrol aktivitas fisiologis kompartemen otot dalam sampel kami, kami juga menambahkan ACh untuk mengungkap sinyal yang diperoleh dari simulasi langsung AChR yang terletak pada miofiber. Seperti yang diharapkan, penambahan ACh eksogen mampu menginduksi respons positif dalam hal kontraksi dan transien kalsium dalam semua sampel yang dianalisis, termasuk rSkM (Gambar 3n,o ; Gambar S7j (Informasi Pendukung) dan Video S3 , Video Tambahan 3). Sesuai dengan itu, blokade AChR dengan BTX menyebabkan hilangnya kontraksi NMO-rSkM dan transien kalsium setelah stimulasi dengan ACh, yang menyoroti perilaku fisiologis sistem tersebut (Gambar 3n,o ; Gambar S7j (Informasi Pendukung) dan Video S2 dan S3 , Video Tambahan 2 dan 3).

Jika digabungkan, data ini menunjukkan integrasi sistem NM fungsional antara NMO dan konstruksi otot rekayasa jaringan dalam assembloid NMO-rSkM.

2.4 Assembloids NMO-rSkM Memiliki Sel Punca Otot dan Memodelkan Peristiwa Regenerasi Setelah Kerusakan Akut
Untuk menentukan integrasi antara NMO dan rSkM (yaitu, NMO-rSkM) sebagai fungsional yang pasti dan berpotensi bertahan lama, perlu untuk memverifikasi bahwa assembloid dapat merespons cedera akut dengan regenerasi. Sejumlah penelitian relevan menunjukkan peran penting sel yang mengekspresikan PAX7 untuk regenerasi SkM yang tepat. [ 35 , 36 ] Kami sebelumnya telah menunjukkan bahwa setelah 35 hari kultur, assembloid NMO-rSkM menyajikan proporsi sel satelit yang tinggi, yang sebagian besar tidak mengekspresikan penanda Ki67 (Gambar 2d–l ).

Berdasarkan pengamatan ini, dan untuk memverifikasi kemampuan regeneratif dari assembloid kami, kami melukai NMO-rSkM 35 hari dengan kardiotoksin [ 24 , 41 ] (CTX) untuk merusak serat otot dan mengevaluasi degenerasi dan regenerasi diri setelah 1, 5, dan 20 hari sejak cedera ( Gambar 4a ). Jadi, kami awalnya menggunakan analisis morfometrik dari sampel yang diwarnai imun secara keseluruhan untuk memperkirakan secara kualitatif organisasi kompartemen otot dan saraf sebelum kerusakan, tepat setelah cedera, dan pada titik waktu yang lebih lama. Bahkan setelah 1 hari sejak perawatan CTX, penurunan keberadaan sel DES + yang memanjang terlihat jelas, terutama dalam korespondensi dengan area yang lebih dekat ke perancah (Gambar 4b,c ). Setelah 5 hari sejak cedera CTX, kami mengamati sedikit perbaikan pada kompartemen otot, yang menyajikan sel DES + yang memanjang tipis, dan jaringan akson saraf TUJ1 + yang berbintik dan kurang memanjang (Gambar 4b,c ). Dengan demikian, ekspresi eMHC mengonfirmasi keberadaan miofiber yang baru terbentuk setelah 5 hari sejak cedera akut, yang mengindikasikan dimulainya regenerasi otot (Gambar S8a , Informasi Pendukung). Menariknya, organisasi morfometrik kompartemen neuronal dan otot yang lebih dekat dengan konstruksi yang tidak rusak dicapai 20 hari setelah pemberian CTX (Gambar 4b,c ). Dengan demikian, kami mengukur perubahan morfologi yang diamati saat cedera dan regenerasi dengan memverifikasi bahwa setelah perawatan CTX pada assembloid NMO-rSkM, kompartemen otot rusak jelas setelah 1 dan 5 hari sejak cedera, tetapi dipulihkan ke tingkat pra-CTX setelah 20 hari, seperti yang ditunjukkan oleh kuantifikasi intensitas fluoresensi sel DES + yang dinormalisasi (Gambar 4d,e ). Dengan demikian, parameter utama miotube, seperti panjang dan tebal, mengikuti dinamika yang sama, dengan pengurangan signifikan setelah 1 hari sejak kerusakan dan peningkatan signifikan setelah 5 dan 20 hari setelah cedera (Gambar 4f,g ). Meskipun dengan waktu yang tertunda berkenaan dengan kompartemen otot, kami menemukan bahwa jaringan saraf juga menunjukkan kerusakan dan regenerasi setelah pengobatan CTX, seperti yang ditunjukkan oleh kuantifikasi panjang dan ketebalan tonjolan saraf sel TUJ1 + 1, 5, dan 20 hari setelah CTX (Gambar 4h–j ). Akhirnya, dan sesuai dengan literatur, [ 36 , 41 , 42 ] kami menemukan bahwa fase regeneratif struktural dari assembloids diantisipasi oleh perubahan yang menonjol dalam proporsi proliferasi PAX7 +sel induk, yang meningkat secara signifikan pada hari-hari pertama setelah cedera (24,20% ± 2,70% pada hari ke-1 dan 14,72% ± 2,38% pada hari ke-5) kembali ke tingkat basal pada hari ke-20 (6,28% ± 1,66% pada sampel yang tidak diobati dan 5,46% ± 1,40% pada hari ke-20; Gambar 4k ).

Gambar 4
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Assembloid NMO-rSkM memiliki sel induk otot dan memodelkan peristiwa degenerasi dan regenerasi setelah kerusakan akut. a) Ilustrasi skema yang menunjukkan prosedur dan garis waktu eksperimen yang digunakan untuk menyelidiki kemampuan regeneratif NMO-rSkM. b) Gambaran stereomikroskop representatif yang menunjukkan pewarnaan imunofluoresensi seluruh dudukan untuk TUJ1 (merah) dan DESMIN (hijau) dari NMO-rSkM pada hari ke-35 kultur bersama yang tidak diobati dengan kardiotoksin (tanpa CTX) atau hari ke-1, hari ke-5, dan hari ke-20 setelah pengobatan CTX. Skala batang, 1 mm. c) Gambaran imunofluoresensi konfokal tumpukan-Z representatif untuk TUJ1 (merah) dan DESMIN (hijau), yang menunjukkan perbesaran yang lebih tinggi dari gambar stereomikroskop yang sesuai. Skala batang, 200 µm. d) Gambaran imunofluoresensi konfokal tumpukan-Z representatif dari NMO-rSkM pada D35 dari kultur bersama yang tidak diobati dengan kardiotoksin (tanpa CTX) atau 1 hari, 5 hari, dan 20 hari setelah pengobatan CTX dan diwarnai pada seluruh dudukan untuk DESMIN (hijau). Skala batang, 50 µm. e) Kuantifikasi intensitas fluoresensi total yang dinormalisasi untuk sinyal latar belakang yang dilakukan pada pewarnaan imunofluoresensi DESMIN. Data ditampilkan sebagai mean ± SEM dari 36 ROI per sampel biologis per setiap kondisi ( n = 3). Signifikansi statistik ditentukan menggunakan uji Mann-Whitney U; ns, tidak signifikan secara statistik. Hasil statistik dilaporkan dalam Tabel S8 (Informasi Pendukung). f) Kuantifikasi panjang miofiber dilakukan pada pewarnaan imunofluoresensi DESMIN. Data ditampilkan sebagai mean ± SEM dari >30 miofiber per sampel per setiap kondisi ( n = 3), diukur pada ≥ tiga gambar per kondisi. Signifikansi statistik ditentukan menggunakan uji Mann-Whitney U; **** p < 0,0001. g) Kuantifikasi ketebalan miofiber dilakukan pada pewarnaan imunofluoresensi DESMIN. Data ditampilkan sebagai mean ± SEM dari >30 penampang melintang miofiber per sampel per kondisi ( n = 3), diukur pada ≥ tiga gambar per kondisi. Signifikansi statistik ditentukan menggunakan uji Mann-Whitney U; **** p < 0,0001. Hasil statistik dilaporkan dalam Tabel S10 (Informasi Pendukung). h) Gambar imunofluoresensi konfokal tumpukan-Z representatif dari NMO-rSkMs pada hari ke-35 dari kultur bersama yang tidak diobati dengan kardiotoksin (tanpa CTX) atau 1 hari, 5 hari dan 20 hari setelah pengobatan CTX dan diwarnai dalam seluruh dudukan untuk TUJ1 (merah). Skala batang, 50 µm. i) Kuantifikasi panjang proyeksi akson dilakukan pada pewarnaan imunofluoresensi TUJ1. Data ditampilkan sebagai rerata ± SEM >50 proyeksi akson per sampel per kondisi ( n = 3), diukur pada ≥ tiga gambar per kondisi. Signifikansi statistik ditentukan menggunakan uji Mann-Whitney U; ****P<0,0001. Hasil statistik dilaporkan dalam Tabel S11(Informasi Pendukung). j) Kuantifikasi ketebalan proyeksi akson dilakukan pada pewarnaan imunofluoresensi TUJ1. Data ditampilkan sebagai mean ± SEM dari >30 penampang akson per sampel per kondisi ( n = 3), diukur pada ≥ tiga gambar per kondisi. Signifikansi statistik ditentukan menggunakan uji Mann-Whitney U; **** p < 0,0001. Hasil statistik dilaporkan dalam Tabel S12 (Informasi Pendukung). k) Kuantifikasi sel Ki67 + di antara sel PAX7 + dalam NMO-rSkM pada hari ke-35 dari kultur bersama yang tidak diobati dengan kardiotoksin (tanpa CTX) atau 1 hari, 5 hari dan 20 hari setelah pengobatan CTX, dinyatakan dalam persentase. Data ditampilkan sebagai mean ± SEM dari ≥ 30 gambar, dari dua sampel biologis yang berbeda, per kondisi. Hasil statistik dilaporkan dalam Tabel S13 (Informasi Pendukung).
2,5 Assembloids NMO-rSkM Menunjukkan Regenerasi Otot Fungsional setelah 20 Hari dari Kerusakan Akut
Bahasa Indonesia: Setelah cedera akut, dalam entitas kerusakan tertentu, SkM yang sehat dapat secara spontan meregenerasi dan membangun kembali jaringan fungsional. [ 35 , 36 ] Berdasarkan remodeling jaringan umum dan regenerasi yang diamati dalam NMO-rSKM yang diobati dengan CTX (Gambar 4 ; Gambar S8b , Informasi Pendukung), kami selanjutnya menyelidiki fungsionalitas assembloids sebelum dan setelah 1, 5, dan 20 hari sejak cedera. Untuk melakukannya, kami menggunakan dua metode untuk mengukur kontraksi pada stimulasi ACh dan Glu ( Gambar 5a–i ). Secara khusus, kami menggunakan alat pencitraan velocimetry partikel (PIVlab) untuk memvisualisasikan dan mengukur perpindahan maksimum dan orientasi perpindahan yang dicapai oleh seluruh sampel sebelum dan setelah pengobatan dengan CTX menggunakan analisis pencitraan langsung. Dengan tujuan untuk pertama-tama menyelidiki fungsionalitas kompartemen otot, assembloids kami distimulasi dengan ACh. Seperti yang ditunjukkan oleh peta vektor, dan dikonfirmasi oleh kuantifikasi perpindahan maksimum, kami menemukan bahwa kontraksi otot setelah stimulasi ACh berkurang secara signifikan setelah 1 dan 5 hari dari perawatan CTX, dan membaik setelah 20 hari dari cedera, jika dibandingkan dengan sampel yang tidak diobati (Gambar 5a,b ). Menurut data ini dan parameter morfometri yang diungkapkan di atas (Gambar 4 ), orientasi perpindahan otot maksimum mengikuti arah preferensial dalam sampel yang tidak diobati, sementara direksionalitas ini hampir hilang setelah 1 dan 5 hari dari cedera, dan membaik 20 hari pasca-kerusakan (Gambar 5c ), yang menunjukkan regenerasi bundel miotube yang berorientasi pada titik waktu yang lebih lama. Selain itu, pencitraan langsung juga digunakan untuk menyelidiki kontraksi dan relaksasi sampel, yang sesuai dengan variasi intensitas fluoresensi yang terdaftar setelah pemberian neurotransmitter. Sejalan dengan hasil PIVlab, analisis yang dilakukan pada variasi intensitas fluoresensi selama waktu wilayah minat yang dipilih menunjukkan penurunan yang nyata dalam kapasitas kontraktil assembloids NMO-rSKM setelah 1 dan 5 hari pasca-cedera CTX (107,41 ± 35,95 AU pada hari 1 dan 278,41 ± 57,34 AU pada hari 5), yang diselamatkan pada hari ke-20, jika dibandingkan dengan assembloids yang dianalisis sebelum kerusakan (1049,62 ± 157,87 AU pada hari ke-20 versus 832,65 ± 143,19 AU sebelum kerusakan; Gambar 5d,e dan Gambar S8b (Informasi Pendukung) dan Video S4 , Video Tambahan 4). Akhirnya, sampel distimulasi dengan Glu untuk menilai regenerasi sistem neuromuskular. Menurut dinamika pemulihan neuronal dan otot yang diamati pada assembloids yang rusak (Gambar 4), stimulasi dengan Glu pada assembloid NMO-rSKM menghasilkan perpindahan maksimum yang berkurang dan pemulihan yang tidak lengkap dari fungsionalitas sistem NM setelah 20 hari dari pemberian CTX, jika dibandingkan dengan sampel yang tidak diobati (18,11 ± 6,60 AU pada hari ke-1 versus 66,87 ± 8,36 AU pada hari ke-5 dan 165,66 ± 24,81 AU pada hari ke-20; Gambar 5f–i dan Gambar S8d (Informasi Pendukung) dan Video S5 , Video Tambahan 5). Sesuai dengan itu, kami menemukan penjajaran langka dari elemen pra-dan pasca-sinaptik NMJ 20 hari setelah cedera (Gambar 5j ). Data ini mengonfirmasi bahwa assembloid NMO-rSkM mampu merespons cedera akut dengan regenerasi SkM, dan pemulihan parsial fungsionalitas NMJ, yang menunjukkan integrasi jangka panjang antara NMO dan rSkM.

Gambar 5
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Regenerasi otot fungsional mendahului regenerasi neuronal dan NMJ dalam assembloids NMO-rSkM. a) Peta vektor representatif dari perpindahan yang tercatat selama kontraksi NMO-rSkM pada hari ke-35 dari kultur bersama yang tidak diobati dengan kardiotoksin (tanpa CTX) atau 1 hari, 5 hari dan 20 hari setelah pengobatan CTX ketika distimulasi dengan ACh. b) Plot biola yang menunjukkan perpindahan maksimum NMO-rSkM pada hari ke-35 dari kultur bersama yang tidak diobati dengan kardiotoksin (tanpa CTX) atau 1 hari, 5 hari dan 20 hari setelah pengobatan CTX ketika distimulasi dengan ACh. Setiap biola mewakili rata-rata vektor perpindahan yang diperoleh dari 3 replikasi biologis per kondisi eksperimen (jumlah vektor yang dianalisis ≥ 14951). Signifikansi statistik ditentukan menggunakan ANOVA satu arah dengan uji perbandingan berganda Tukey, ****P<0,0001. Hasil statistik dilaporkan dalam Tabel S14 (Informasi Pendukung). c) Bagan kutub representatif yang menunjukkan kuantifikasi perpindahan maksimum (µm) dan arah perpindahan (sudut, derajat) yang diperoleh dengan analisis PIVlab dari NMO-rSkMs pada hari ke-35 dari kultur bersama yang tidak diobati dengan kardiotoksin (tanpa CTX) atau 1 hari, 5 hari dan 20 hari setelah pengobatan CTX ketika distimulasi dengan ACh dari tiga assemblois berbeda (#) per setiap kondisi eksperimen. d) Kuantifikasi representatif dari variasi intensitas fluoresensi rata-rata yang dinormalisasi yang terdaftar selama kontraksi NMO-rSkMs pada hari ke-35 dari kultur bersama yang tidak diobati dengan kardiotoksin (tanpa CTX) atau 1 hari, 5 hari dan 20 hari setelah pengobatan CTX ketika distimulasi dengan ACh. Untuk setiap kurva, data ditampilkan sebagai rata-rata dari 3 replikasi independen. e) Kuantifikasi kontraksi NMO-rSkM pada D35 yang tidak diobati dengan kardiotoksin (tanpa CTX) atau 1 hari, 5 hari dan 20 hari setelah pengobatan CTX. Kontraksi direkam setelah pemberian ACh eksogen, dan dinyatakan sebagai puncak maksimum fluoresensi yang terungkap melalui analisis pencitraan langsung. Kuantifikasi dilakukan pada tiga replikasi biologis independen per kondisi. Masing-masing dari tiga sampel dibagi menjadi 5 ROI dan setiap titik mewakili satu ROI. Signifikansi statistik ditentukan menggunakan uji Mann-Whitney U; ns, tidak signifikan secara statistik. Hasil statistik dilaporkan dalam Tabel S15 (Informasi Pendukung). f) Peta vektor representatif dari perpindahan yang terdaftar selama kontraksi NMO-rSkMs pada hari ke-35 dari kultur bersama yang tidak diobati dengan kardiotoksin (tanpa CTX) atau 1 hari, 5 hari dan 20 hari setelah pengobatan CTX ketika distimulasi dengan Glu. g) Plot biola yang menunjukkan perpindahan maksimum NMO-rSkMs pada hari ke-35 dari kultur bersama yang tidak diobati dengan kardiotoksin (tanpa CTX) atau 1 hari, 5 hari dan 20 hari setelah pengobatan CTX ketika distimulasi dengan Glu. Setiap biola mewakili rata-rata vektor perpindahan yang diperoleh dari tiga replikasi biologis per kondisi eksperimen (jumlah vektor yang dianalisis ≥ 15227). Signifikansi statistik ditentukan menggunakan ANOVA satu arah dengan uji perbandingan berganda Tukey, **** p < 0,0001. Hasil statistik dilaporkan dalam Tabel S16 (Informasi Pendukung). h) Kuantifikasi representatif dari variasi intensitas fluoresensi rata-rata yang dinormalisasi yang tercatat selama kontraksi NMO-rSkM pada hari ke-35 dari kultur bersama yang tidak diobati dengan kardiotoksin (tanpa CTX) atau 1 hari, 5 hari dan 20 hari setelah pengobatan CTX ketika distimulasi dengan Glu. Untuk setiap kurva, data ditampilkan sebagai rata-rata dari 3 replikasi independen. i) Kuantifikasi kontraksi NMO-rSkM pada D35 tidak diobati dengan kardiotoksin (tanpa CTX) atau 1 hari, 5 hari dan 20 hari setelah pengobatan CTX. Kontraksi direkam setelah pemberian Glu eksogen, dan dinyatakan sebagai puncak maksimum fluoresensi yang terungkap melalui analisis pencitraan langsung. Kuantifikasi dilakukan pada tiga replikasi biologis independen per kondisi. Masing-masing dari tiga sampel dibagi menjadi lima ROI dan setiap titik mewakili satu ROI. Signifikansi statistik ditentukan menggunakan uji Mann-Whitney U, *** p = 0,0002. Hasil statistik dilaporkan dalam Tabel S17 (Informasi Pendukung) j) Gambar imunofluoresensi konfokal tumpukan Z representatif dari penampang lintang NMO-rSkMs 20 hari setelah perawatan CTX, diwarnai untuk daerah TUJ1 (merah), DESMIN (hijau) dan α-BTX + (sian). Batang skala, 50 µm (kiri) dan 20 µm (kanan).

3 Diskusi
Dalam karya ini, kami mengembangkan platform in vitro baru untuk menyelidiki dan mengungkap peristiwa seluler dan biologis kompleks yang terlibat selama integrasi sistem NM manusia dalam konstruksi otot rekayasa jaringan implan dengan menghasilkan model assembloid SkM graft-host secara in vitro.

Konstruksi SkM yang direkayasa menjanjikan untuk menjadi rute terapi untuk defek otot yang besar dan berdampak (peristiwa traumatis tunggal, kondisi kronis, dan cedera akibat latihan) [ 43 , 44 ] atau malformasi kongenital (seperti hernia diafragma dan defek dinding perut). [ 45 , 46 ] Namun, aplikasinya di klinik masih buruk dan masih menjadi masalah bagaimana memprediksi efisiensi konstruksi rekayasa yang dikembangkan dan menetapkan probabilitas keberhasilan pencangkokan dan regenerasi otot fungsional dalam konteks manusiawi. Selain itu, mempertimbangkan aplikasi di bidang pediatrik untuk pengobatan defek dan malformasi kongenital, sangat rumit untuk memprediksi respons jaringan/organ yang tumbuh secara fisiologis terhadap implantasi konstruksi rekayasa. Hingga saat ini, aspek-aspek ini sebagian besar telah diselidiki menggunakan berbagai model hewan. [ 4 , 47 , 48 ] Hewan menawarkan kesempatan berharga untuk mendapatkan wawasan tentang mekanisme regeneratif dan respons sistemik terhadap cangkok; Namun, keterbatasan etika yang dipadukan dengan respon biologis yang tidak dapat diprediksi pada setiap spesies, membatasi penerapannya dalam memprediksi perilaku sel inang manusia dalam kaitannya dengan cangkok. [ 20 , 21 ]

Di sini kami mengembangkan model in vitro yang dimanusiakan di mana kontribusi otot dan saraf terhadap SkM yang direkayasa, dan sebaliknya, dapat dipelajari secara in vitro. Untuk melakukannya, kami menggabungkan teknologi organoid berbasis hiPSC dan pendekatan rekayasa jaringan SkM yang mapan untuk memperoleh assembloid SkM graft-host. Untuk menghasilkan assembloid, pertama-tama kami mengembangkan jaringan rekayasa SkM dan NMO turunan hiPSC secara terpisah, dan kemudian kami merakitnya bersama-sama untuk memperoleh assembloid SkM graft-host. Modulasi yang tepat dalam hal media kultur di setiap bagian proses diperlukan untuk mempertahankan pertumbuhan dan proliferasi populasi sel saraf dan otot selama kultur.

Dalam beberapa tahun terakhir, produksi NMO memungkinkan kultur jangka panjang sistem NM manusia secara in vitro, yang memungkinkan penyelidikan interaksi antara MN dan SkM pada tingkat NMJ dalam kesehatan dan penyakit. [ 22 – 25 , 49 ] Oleh karena itu, NMO secara umum dianggap sebagai pendekatan yang menjanjikan untuk pemodelan biologi NM manusia secara in vitro, penyakit, dan regenerasi otot. [ 22 – 25 ] Berdasarkan hal ini, kami berhipotesis bahwa NMO dapat digunakan sebagai arketipe penerimaan transplantasi atau kegagalan asal manusia untuk menggantikan percobaan hewan, terutama untuk meniru sistem NM janin/neonatal yang dapat mencerminkan kondisi malformasi kongenital. Kami menunjukkan bahwa setelah 22 hari diferensiasi hiPSC, NMO yang diturunkan menyajikan tipe sel sistem NM, dari sel yang mengekspresikan penanda miogenik awal atau akhir hingga keberadaan penonjolan neuronal ke arah kompartemen otot. Salah satu aspek yang paling relevan untuk hasil positif dari cangkok otot rekayasa jaringan adalah untuk memahami apakah konstruksi akan terintegrasi dalam jaringan penerima dan sebaliknya, baik dari sudut pandang struktural maupun fungsional. Secara khusus, dalam kontes SkM, pencapaian persarafan terkoordinasi yang memadai dan tepat waktu oleh sistem saraf tepi inang adalah wajib untuk memungkinkan integrasi cangkok fungsional. [ 18 ] Di sini, kami menunjukkan bahwa produk rekayasa jaringan, seperti dSkM dan dSkM yang direselularisasi dengan hMPC (yaitu, rSkM), dapat diinvasi, diisi ulang, dan dimodel ulang oleh jenis sel otot dan saraf yang berasal dari NMO, menghasilkan assembloid SkM graft-inang. Model-model ini memungkinkan evaluasi in vitro dari interaksi antara sistem NM manusia dan konstruksi SkM rekayasa.

Hingga saat ini, pendekatan rekayasa jaringan yang paling relevan secara klinis untuk penanganan kehilangan SkM volumetrik telah dilakukan dengan menggunakan perancah kandung kemih yang dideselularisasi. [ 15 , 16 ] Meskipun pasien yang dirawat memperoleh kembali volume otot parsial dan tingkat fungsionalitas tertentu, studi Sicari dan rekan-rekannya menyoroti pentingnya integrasi fungsional antara jaringan penerima dan cangkok otot untuk hasil implan yang positif. Kami dan kelompok lain telah menunjukkan pentingnya penggunaan perancah spesifik jaringan untuk memperoleh hasil yang relevan dalam memperbaiki kerusakan otot dan cacat bawaan, karena dSkM secara intrinsik dilengkapi dengan faktor-faktor spesifik otot dan neurotropik. [ 5 , 6 , 14 ] Studi kami mengonfirmasi konsep ini: kami menemukan bahwa keberadaan matriks ekstraseluler spesifik otot memungkinkan sel-sel untuk menetap di posisi anatomi yang lebih dekat dengan yang diamati secara in vivo (misalnya, di bawah lamina basal miofiber untuk sel-sel satelit). Selain itu, transplantasi perancah deselularisasi tunggal untuk cacat otot besar bukanlah jaminan pengobatan yang lengkap dan tahan lama. [ 13 , 15 , 16 ] Dengan demikian, kami menemukan bahwa meskipun dSkM sendiri mampu menarik sel otot dan neuron dari NMO, invasi sel host tidak mencapai semua area perancah di assembloid NMO-dSkM. Sebaliknya, keberadaan hMPC yang telah disemai sebelumnya ke dalam dSkM (yaitu, rSkM) mendorong integrasi komponen seluler dari NMO yang jauh lebih efisien dan kuat di assembloid NMO-rSkM, yang menunjukkan bahwa pra-repopulasi perancah yang dideselularisasi sebelum implantasi dalam konteks defek otot besar atau kehilangan otot volumetrik dapat sangat meningkatkan pencangkokan dan pemulihan fungsional implan. Pengamatan kami diparalelkan oleh peningkatan signifikan kontraksi SkM dari konstruksi rekayasa jaringan yang diinvasi, yang secara kuat menunjukkan bahwa mengisi kembali dSkM dengan sel-sel spesifik jaringan memiliki prediksi positif untuk menghasilkan cangkokan fungsional setelah ditanamkan pada pasien. Peningkatan integrasi dan fungsionalitas yang diamati pada NMO-rSkM, jika dibandingkan dengan NMO-dSkM, mungkin disebabkan oleh pensinyalan parakrin dan molekul kecil yang disekresikan oleh hMPC, yang keduanya menarik sel progenitor otot dan tonjolan akson di dalam perancah dan meningkatkan pematangan NM pada assembloid. Selain itu, pra-penyemaian perancah yang dideselularisasi dengan hMPC memiliki efek pada perombakan perancah, yang dapat bermanfaat untuk pencangkokan NMO. Akhirnya, kemungkinan efek sel pra-penyemaian miogenik pada proliferasi sel turunan NMO dapat menjadi mekanisme potensial lain yang terkait dengan tingkat invasi yang lebih tinggi ketika assembloid diproduksi dengan adanya rSkM.

Menurut ini, kami juga menunjukkan bahwa NMJ fungsional dihasilkan setelah integrasi kompartemen saraf turunan NMO dengan rSkM dalam assembloid NMO-dSkM. NMJ manusia telah terbukti memiliki karakteristik khusus yang membedakannya dari sinapsis sejenis pada spesies mamalia lain (misalnya, tikus dan mencit). [ 50 ] Perbedaan ini mempersulit interpretasi studi hewan untuk penerapannya pada manusia. Dalam sistem 3D in vitro humanisasi kami, keberadaan NMJ manusia yang dibentuk oleh ujung patch berbentuk koin [ 50 ] dan mampu merespons neurotransmiter atau toksin sangat menunjukkan kesamaannya dengan NMJ yang ada secara in vivo.

Pada saat yang sama, keberadaan sel induk dan sel progenitor miogenik, seperti sel PAX7 + yang diidentifikasi dalam posisi anatomi sel satelit, membuka kemungkinan untuk menyelidiki kemampuan jangka panjang dari konstruksi SkM rekayasa jaringan terintegrasi saat terjadi kerusakan. Kita dapat berasumsi bahwa sel PAX7 + berasal dari NMO karena tidak ada sel PAX7 + yang dapat ditemukan di rSkM. Jadi, kami menggunakan CTX, uji in vitro dan in vivo yang mapan untuk menginduksi cedera akut sementara dan dapat direproduksi pada miofiber tanpa secara langsung mempengaruhi saraf. [ 41 ] Assembloid NMO-rSkM kami merespons secara sinkron dan terkoordinasi terhadap CTX, dengan degenerasi dan regenerasi kompartemen otot berikutnya, dan degenerasi tertunda dan regenerasi parsial kompartemen neuronal pada titik waktu yang sebanding. Pengaturan eksperimental ini mengonfirmasi integrasi efektif antara NMO dan rSkM dan bahwa assembloid NMO-rSkM mampu mengalami kerusakan dan merespons dengan regenerasi jaringan, menurut waktu dan cara yang diharapkan. [ 42 ] Yang penting, meskipun fungsionalitas SkM secara signifikan diselamatkan setelah 20 hari dari cedera (yaitu, setelah stimulasi ACh), regenerasi kompartemen saraf dengan NMJ fungsional masih belum sepenuhnya tercapai dalam jangka waktu yang sama (yaitu, setelah stimulasi Glu). Namun, kemampuan regenerasi kompartemen saraf assembloids tersebut juga dapat disebabkan oleh aksi sel progenitor saraf yang diidentifikasi dalam NMO-rSkM. Berdasarkan aspek ini dan seperti yang disebutkan sebelumnya, kami menyarankan bahwa platform yang dikembangkan memiliki relevansi translasi tertentu untuk mempelajari strategi rekayasa jaringan untuk mengobati cacat bawaan, seperti hernia diafragma dan cacat dinding perut. [ 45 , 46 ] Stimulasi eksternal seperti listrik, mekanik, atau gaya fisik lainnya menunjukkan janji dalam mempromosikan regenerasi jaringan saraf in vivo dan in vitro. [ 42 , 51 – 53 ] Setelah stimulasi, jaringan saraf mengalami peningkatan proliferasi, mendukung pertunasan akson dan persarafan. Dengan demikian, mungkin menarik di masa depan untuk menguji apakah stimulasi eksternal dapat mempercepat regenerasi sistem NM di assembloids kami.

Meskipun platform kami menghasilkan hasil yang relevan mengenai eksplorasi interaksi antara sistem NM manusia dan jaringan otot yang direkayasa, penting untuk menggarisbawahi bahwa beberapa pemain biologis utama tidak ada dalam model assembloid yang disajikan. Kemungkinan masa depan untuk mengintegrasikan jenis sel lain ke dalam assembloid NMO-rSkM, seperti sel yang termasuk dalam jaringan vaskular dan sistem imun, tetap menjadi perspektif menarik yang dapat membuka kemungkinan baru untuk membedah sifat regulasi pemain seluler lain selama integrasi dan regenerasi sistem NM manusia.

Dalam konteks ilmiah yang lebih luas di mana para peneliti dan dokter semakin berupaya untuk membuat ulang model in vitro 3D yang mampu meniru sebanyak mungkin lingkungan fisiologis yang kompleks dari jaringan atau organ, assembloid NMO-rSkM kami dapat mewakili tidak hanya uji praklinis untuk memprediksi pencangkokan cangkokan otot tertentu tetapi juga berpotensi menjadi alat yang berguna untuk mempelajari obat-obatan atau molekul terapeutik untuk penyakit yang mempengaruhi sistem NM. Komunitas ilmiah di bidang penelitian SkM dan sistem NM sangat berkomitmen untuk pengembangan model in vitro 3D kompleks yang dapat meniru miopati dan distrofi, atau efek penuaan pada mekanisme fisiologis perbaikan dan regenerasi. [ 54 – 60 ] Dalam model in vitro 3D kami, keberadaan berbagai jenis sel dari sistem NM dapat memfasilitasi pemahaman tentang peristiwa yang terjadi pada penyakit otot dan NM serta regenerasi.

Mengingat kompleksitasnya dalam komposisi seluler, kesetiaan yang tinggi dengan konteks manusia, dan fungsionalitas yang ditunjukkan bahkan setelah kerusakan akut, assembloid kami dapat membuka studi baru tentang mekanisme regenerasi baik dalam konteks sehat maupun sakit, untuk pemahaman yang lebih baik tentang aplikasi translasi dalam strategi pengobatan regeneratif berbasis SkM.

4 Bagian Eksperimen
Derivasi dan Kultur Sel Punca Pluripoten yang Diinduksi Manusia
Semua lini sel iPSC manusia dalam penelitian ini dihasilkan dari lini sel fibroblas kulup (BJ) dengan pemrograman ulang dalam mikrofluida. [ 60 , 61 ] Kami menggunakan lini hiPSC turunan BJ tipe liar atau yang mengekspresikan GFP secara konstitutif yang berasal dari klon hiPSC yang sama.

iPSC manusia dikultur dalam kondisi bebas feeder pada pelat kultur sel berlapis 0,5% Matrigel (MRF, Corning) (6-multiwell, Sarstedt) dalam StemMACS iPS-Brew XF (Miltenyi Biotec) dengan 1% penisilin/streptomisin (P/S; Gibco-Fisher Scientific), pada suhu 37 °C dalam 5% CO 2 dalam inkubator sel. Semua lini sel diuji negatif untuk mikoplasma dan dipertahankan di bawah passage 30 sebelum digunakan untuk diferensiasi. iPSC manusia pada passage 12 ditransduksi dengan vektor lentivirus yang mengkode resistensi GFP dan Puromisin di bawah kendali promotor PGK. Untuk memperkaya populasi iPSC manusia untuk sel-sel GFP-positif, hiPSC yang ditransduksi GFP dipilih melalui pengobatan puromisin (1 µg mL −1 selama 4 hari) dan disortir untuk ekspresi GFP. Untuk penyortiran GFP-hiPSC, sel dipisahkan sebagai sel tunggal menggunakan TryplE Select (Gibco), disuspensikan kembali dalam 1 mL PBS 1X, dan disortir dengan flow cytometry. Sel yang disortir disuspensikan kembali dalam StemMACS iPS-Brew XF (Miltenyi Biotec) dengan 1% penisilin/streptomisin (P/S; Gibco-Fisher Scientific), ditambah dengan 10 µM StemMACS Y27632. Sel kemudian disemai dalam kondisi bebas feeder ke dalam pelat kultur sel berlapis 0,5% Matrigel (MRF, Corning) (6-multiwell, Sarstedt).

Diferensiasi hiPSC untuk derivasi organoid neuromuskular
Untuk derivasi organoid neuromuskular (NMO), 15 µL MRF 100% dituang pada penutup kaca steril (Vetrotecnica) yang membentuk 1 cm 2 tetesan MRF dalam pelat 24-multiwell (Sarstedt). Tetesan MRF diinkubasi pada suhu 37 °C selama 25 menit dalam inkubator sel untuk memungkinkan polimerisasi MRF. Sebelum penyemaian sel (Hari ke-2 protokol diferensiasi), hiPSC dipisahkan secara enzimatik sebagai sel tunggal menggunakan TryplE Select (Gibco), 40.000 hiPSC disuspensikan kembali dalam 50 µL StemMACS iPS-Brew XF (Miltenyi Biotec) yang dilengkapi dengan 10 µM StemMACS Y27632. Sel-sel disemai di atas tetesan Matrigel dan diinkubasi selama 90 menit pada suhu 37 °C dan 5% CO2 untuk memungkinkan adhesi sel sebelum suplementasi media lebih lanjut. Setelah suplementasi media 500 µL, sel-sel dikultur selama 24 jam pada suhu 37 °C dan 5% CO2 dalam inkubator sel. Pada Hari ke-1 protokol diferensiasi, media diganti, dan sel-sel dikultur dalam StemMACS iPS-Brew XF. Protokol diferensiasi dimulai pada hari ke-0 dan diadaptasi dari studi literatur, memanfaatkan molekul kecil dan faktor pertumbuhan untuk mengarahkan diferensiasi neuromuskular. [ 62 ] Singkatnya, dari hari ke-0 sampai hari ke-2 media diganti ke media berbasis Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM F-12, Gibco), ditambah dengan Insulin-Transferrin-Selenium (ITS, Gibco), 1% P/S, 3 µM agonis WNT CHIRON99021 (Miltenyi Biotec) dan 0,5 µM antagonis BMP LDN193189 (Miltenyi Biotec). Dari hari ke-3 sampai ke-5, 20 ng mL −1 fibroblast growth factor-2 (FGF-2; Immunotools) ditambahkan ke dalam media. Dimulai dari hari ke-6, media diganti dengan DMEM F-12, ditambah dengan 15% Knockout Serum Replacement (KSR; Gibco), 10 ng mL −1 faktor pertumbuhan hepatosit (HGF; ImmunoTools), 2 ng mL −1 faktor pertumbuhan mirip insulin 1 (IGF-1, Miltenyi Biotec), 20 ng mL −1 FGF-2 dan 0,5 µM LDN193189. Dari hari ke-8 hingga hari ke-11 diferensiasi, sel dikultur dalam DMEM F-12 yang ditambah dengan 15% KSR dan 2 ng mL −1 IGF-1. Dari hari ke-12, media sebelumnya dimodifikasi dengan memasukkan 10 ng mL −1 HGF dan 2 ng mL −1 IGF-1. Sejak hari ke-22, NMO dikulturkan dalam media diferensiasi sekunder miogenik (SDM) yang terdiri dari DMEM F-12 yang disuplemen dengan 2% KSR, 1X ITS, 1% P/S, 1 µM CHIRON99021, 10 ng mL −1 faktor neurotropik siliaris (CNTF; PeproTech) dan 10 ng ml −1 faktor neurotropik turunan garis sel glia (GDNF; PeproTech) hingga titik akhir percobaan. [ 29 ]

Isolasi dan Ekspansi Sel Progenitor Otot Manusia Dewasa (hMPC)
Mioblas rangka manusia primer diambil dari biopsi SkM donor sehat. Jaringan pasien dikumpulkan setelah persetujuan tertulis sesuai protokol nomor 2682P dan nomor 3030P, yang disetujui oleh Komite Etik Lokal (Comitato etico per la sperimentazione clinica dell’Azienda Ospedaliera di Padova). Dari biopsi otot, sel progenitor otot manusia (hMPC) diisolasi menggunakan protokol yang telah ditetapkan sebelumnya. [ 34 ]

Selama ekspansi sel, hMPC dikultur dalam medium proliferatif (PM), yang terdiri dari DMEM glukosa rendah (1 g L −1 D-glukosa, Gibco-Fisher Scientific), 20% serum sapi janin (FBS; Gibco–Fisher Scientific), 10 −6 M deksametason (Sigma-Aldrich), 10 ng mL −1 bFGF (Sistem R&D), 10 µg mL −1 insulin (Gibco-Fisher Scientific) dan 1% P/S.

Untuk menginduksi diferensiasi miogenik, hMPC konfluen dikultur dalam medium fusi (FM), yang terdiri dari αMEM (Gibco-Fisher Scientific) yang dilengkapi dengan 2% serum kuda (HS; Gibco-Fisher Scientific), 10 µg mL −1 insulin dan 1% P/S.

Analisis Sitometri Aliran
Ekspresi antigen permukaan sel dianalisis dengan flow cytometry untuk karakterisasi hMPC. Sel dipisahkan dengan perlakuan Tripsin-EDTA pada lintasan yang berbeda, hingga lintasan ke-12. Untuk karakterisasi antigen permukaan, ≈1 × 104 sel diinkubasi dengan antibodi PE anti-CD56 (BD Bioscience, Italia) dan 7-aminoaktinomisinD (BD Bioscience, Italia), yang digunakan untuk menilai viabilitas sel.

Pembentukan jaringan otot rangka yang terdeselularisasi (dSkM)
Diafragma tikus diambil dari tikus C57BL/6j berusia 3 hingga 6 bulan (protokol N. 1103/2016 dan 418/2020-PR yang disetujui oleh komite etik lokal Animal Wellness, Organismo per il Benessere Animale OPBA, Universitas Padova dan Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza dan Kementerian Kesehatan Italia). Setelah pengambilan, diafragma dicuci 2 kali dalam larutan garam penyangga fosfat steril 1X (PBS, Gibco-Fisher Scientific) dan kemudian dipindahkan dalam air deionisasi dengan 3% P/S, untuk memulai proses deselularisasi. Diafragma diproses dengan tiga siklus perlakuan deterjen-enzimatik (DET) untuk mencapai penghilangan sel yang lengkap. Setiap siklus DET terdiri dari air deionisasi pada suhu 4 °C selama 24 jam, 4% natrium deoksikolat (Sigma-Aldrich) pada suhu kamar selama 4 jam, dan 2000 Kunitz DNase-I (Sigma-Aldrich) dalam 1 M NaCl (Sigma-Aldrich) pada suhu kamar selama 3 jam. [ 32 ] Setelah deselularisasi, SkM yang dideselularisasi (dSkM) dicuci setidaknya selama 6 hari dalam PBS 1X dan segera digunakan atau diawetkan dalam nitrogen cair.

Protokol Reselularisasi dSkM
Mouse dSkM digunakan untuk protokol reselularisasi dengan hMPC. Setiap diafragma yang dideselularisasi dibagi menjadi empat bagian, masing-masing berukuran ≈30 mm 2 , tidak termasuk tendon dan otot crural. Setiap bagian difiksasi dengan empat pin baja tahan karat pada penyangga polidimetilsiloksan (PDMS 9:1; Sylgard 184, Dow Corning), dan ditempatkan ke dalam sumur pelat 24 sumur. HMPC, yang sebelumnya diekspansi selama 7–12 lintasan, disuspensikan kembali dalam 40 µL 13% Kolagen tipe I (Sigma-Aldrich), 10% Fibronektin (Sigma-Aldrich), 10% IGF-1 (ImmunoTools) dalam PM. Untuk menghasilkan SkM yang direselularisasi (rSkM), campuran tersebut disuntikkan ke dalam dSkM pada kepadatan 1 × 106 sel per 30 mm 2 , dan diinkubasi selama 3 jam pada suhu 37 °C dan 5% CO 2 , sebelum penambahan media lebih lanjut. 3 jam setelah penyuntikan, 500 µL PM ditambahkan ke setiap sumur. PM diganti setiap 48 jam, dan pada hari ke-4 diganti dengan FM. Pada hari ke-5, media diganti lagi, dengan campuran yang terdiri dari 50% FM dan 50% SDM.

Penyemaian NMO pada dSkM atau rSkM dan generasi assembloid
NMO D22 disemai secara bergantian pada dSkM atau pada rSkM (direselularisasi selama 6 hari). Untuk memfasilitasi adhesi NMO pada perancah, media dikeluarkan dari perancah dan NMO D22 dari kultur suspensi ditempatkan dengan hati-hati di atas rSkM, dan ditutup dengan 5 µL MRF 100%. Konstruksi ditempatkan pada suhu 37 °C dalam inkubator sel selama 5 menit untuk memungkinkan polimerisasi MRF. Setelah polimerisasi MRF, 500 µL SDM ditambahkan ke setiap sumur. Sampel dipertahankan dalam SDM hingga titik akhir eksperimen tercapai, media diganti setiap 72 jam.

Pencitraan Langsung dan Analisis Kontraksi
Pada titik waktu akhir yang ditentukan, semua analisis pencitraan langsung dilakukan menggunakan mikroskop stereo Leica M205 FCA yang dilengkapi dengan lensa objektif PLANAP0 1.0×, dengan laju akuisisi 5 hingga 10 bingkai per detik. Jika diindikasikan, sampel distimulasi dengan neurotransmiter glutamat (Glu) atau asetilkolin (ACh). Larutan Glu disiapkan menggunakan bubuk asam L-Glutamat (Sigma-Aldrich) yang dilarutkan dalam air steril untuk memperoleh larutan stok 100 mM. ACh (Sigma-Aldrich) dilarutkan kembali dalam PBS untuk menghasilkan larutan stok 100 mM. Setiap larutan neurotransmiter diberikan ke sampel selama akuisisi pencitraan langsung pada konsentrasi kerja akhir 10 µM. Untuk pengobatan bungarotoxin (BTX), sampel diinkubasi dengan 1 µg mL −1 α-bungarotoxin Alexa FluorTM 555 (Invitrogen, B13422) selama 12 jam pada suhu 37 °C sebelum akuisisi dan analisis pencitraan langsung.

Untuk analisis kontraksi spontan, sampel dipantau dari waktu ke waktu menggunakan pencitraan medan terang atau fluoresensi. Variasi intensitas piksel selama akuisisi pencitraan langsung diukur dengan mempertimbangkan sampel pemasangan keseluruhan atau, jika diindikasikan, dengan mempertimbangkan daerah minat (ROI) tertentu, yang dipilih secara akurat sesuai dengan daerah miogenik. Kuantifikasi dilakukan pada tiga replikasi biologis independen per kondisi, setiap sampel dibagi menjadi lima ROI dan setiap titik mewakili satu ROI. Variasi intensitas piksel dikuantifikasi menggunakan alat Quantify dari perangkat lunak Leica Application Suite X (LAS X) atau ImageJ Plugin Spiky. [ 63 ]

Baik LAS X maupun Spiky digunakan untuk mengekstrak sinyal intensitas dari rekaman langsung, yang diekspor sebagai file .csv dan kemudian digunakan untuk analisis pencitraan lebih lanjut. File csv yang berisi data variasi intensitas mentah ini diproses dengan menerapkan skrip MATLAB 2021 (MathWorks) dengan tujuan mengoreksi photobleaching dan mampu menghilangkan artefak berbasis pemberian neurotransmitter.

Untuk menghapus artifak ini, kode internal MATLAB digunakan. Pada awalnya, kami melanjutkan dengan pemilihan titik awal dan akhir artifak secara manual melalui antarmuka kotak dialog MATLAB. Selanjutnya, kode tersebut menghilangkan segmen sinyal yang tidak diinginkan, untuk kemudian menerapkan teknik interpolasi Hermite kubik sepotong-sepotong Akima yang dimodifikasi, yang tersedia secara default di MATLAB. Interpolasi ini melakukan interpolasi kubik untuk menghasilkan polinomial sepotong-sepotong dengan turunan orde pertama yang kontinu untuk menghindari undulasi lokal yang berlebihan. Perbedaan antara ini dan algoritma Akima standar terletak pada prioritas kemiringannya ketika dua yang berbeda berpotongan; versi yang dimodifikasi lebih menyukai kemiringan yang lebih dekat ke arah horizontal untuk mencegah overshooting. [ 64 , 65 ]

Untuk pembuatan peta vektor dan pengukuran perpindahan, perangkat lunak velocimetry citra partikel berbasis antarmuka pengguna grafis (GUI) (PIVlab) versi 3.07 digunakan menurut literatur. [ 61 – 63 ] Secara singkat, pasangan bingkai terpilih yang diperoleh selama analisis pencitraan langsung dari sampel wholemount dikorelasikan silang untuk menghasilkan peta vektor dan perpindahan lokal. Secara khusus, perpindahan maksimum dikuantifikasi dengan mengkorelasikan silang pasangan bingkai yang diperoleh sebelum kontraksi dan pada perpindahan maksimum sampel. Kuantifikasi perpindahan dan arah vektor diperoleh dengan menggunakan algoritma deformasi jendela Multipass Fast Fourier Transform (FFT) PIV dan disimpan sebagai matriks korelasi dalam file .mat. Bagan kutub yang menunjukkan hubungan antara perpindahan dan arah vektor untuk setiap sampel dibuat dari skrip R (v. 4.3.1) yang dibuat khusus menggunakan paket ggplot2 v. 3.5.1. [ 64 ] Semua algoritma MATLAB yang disebutkan memiliki kode sumber yang tersedia dalam dokumentasi MATLAB. Semua skrip dan kode khusus tersedia atas permintaan penulis.

Analisis Transien Kalsium
Untuk evaluasi kalsium transien, sampel pada titik akhir eksperimen yang ditetapkan diinkubasi dengan Fluo-4-AM (Thermo Fisher Scientific F14201) mengikuti petunjuk pabrik. Untuk menghindari interferensi GFP dengan evaluasi Fluo-4, kami menyertakan hiPSC yang tidak mengekspresikan GFP dalam rangkaian eksperimen ini. Secara singkat, media dihilangkan dan sampel diinkubasi dengan 20 µM Fluo-4-AM, 5 µL mL −1 Pluronic F-127 (Thermo Fisher Scientific), dan 12,5 µL mL −1 sulfinpirazon (Sigma-Aldrich) dalam medium sel bebas serum selama 30 menit pada 37 °C dan 5% CO 2 . Sampel kemudian dicuci secara akurat dengan SDM miogenik tanpa KSR dan dilakukan analisis pencitraan langsung. Pencitraan langsung dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya dalam sampel seluruh gunung.

Untuk analisis kalsium transien, ≥ 10 ROI per sampel dengan diameter 20 µm dipilih untuk mengevaluasi rata-rata variasi intensitas fluoresensi dari kelompok miofiber terbatas, yang diidentifikasi berkat morfologinya. Variasi intensitas fluoresensi ROI dianalisis menggunakan alat Process dari perangkat lunak LAS X atau plugin ImageJ Spiky. Data yang diperoleh diproses dan dinormalisasi dengan kode MATLAB yang sama yang dijelaskan untuk kontraksi guna mengekspresikan variasi kalsium selama waktu akuisisi pencitraan.

Untuk perhitungan kalsium ΔF/F 0 , ROI terpilih yang sama yang digunakan untuk analisis fluks kalsium digunakan untuk mengidentifikasi nilai intensitas fluoresensi dasar (sebelum stimulasi neurotransmitter, F 0 ) dan maksimum (setelah stimulasi neurotransmitter, F puncak ). Perhitungan kalsium ΔF/F 0 otomatis memerlukan, sebagai input, sinyal intensitas .csv yang diekstrak dari rekaman langsung, baik melalui plugin Spiky atau langsung melalui LAS X. Sinyal-sinyal ini harus berada di dekat peristiwa yang diinginkan dan memiliki ukuran vektor minimal 50. Kode MATLAB yang disesuaikan dirancang untuk memproses sinyal-sinyal intensitas ini, secara otomatis menentukan dasar sebagai rata-rata dari 20 titik pertama menggunakan fungsi rata-rata MATLAB, dan F puncak sebagai nilai sinyal maksimum untuk setiap fungsi ROI maks MATLAB. Data yang dihasilkan kemudian dicetak dalam format matriks, agar mudah diekspor untuk analisis lebih lanjut dan perbandingan di Excel.

Semua algoritma MATLAB yang disebutkan memiliki kode sumber yang tersedia dalam dokumentasi MATLAB. Semua plugin ImageJ dilisensikan di bawah lisensi GNU GPL v.3 sumber terbuka.

Cedera Kardiotoksin
Untuk cedera kardiotoksin (CTX, Latoxan, Portes-lés-Valence, Prancis), sampel NMO-rSkM diobati dengan CTX pada konsentrasi akhir 0,2 µM. [ 31 ] 35 hari setelah penyemaian NMO pada rSkM, CTX ditambahkan langsung ke media diferensiasi sekunder dan dipertahankan selama 6 jam. Sampel kemudian dipertahankan dalam kultur tanpa CTX dan dianalisis pada titik waktu yang berbeda.

Histologi
NMO-dSkM dan NMO-rSkM difiksasi selama 1 jam dalam 4% paraformaldehida (PFA, Sigma-Aldrich) pada suhu ruangan. Histologi dievaluasi pada irisan beku (ketebalan 15 µm) yang diwarnai dengan kit hematoksilin dan eosin untuk irisan beku cepat (Bio-Optica, Milan, Italia), mengikuti petunjuk pabrik pembuatnya.

Analisis Imunofluoresensi
NMO-dSkM dan NMO-rSkM difiksasi selama 1 jam pada 4% PFA pada suhu kamar. Sampel kemudian dicuci dalam PBS dan dianalisis dalam seluruh sediaan atau dalam penampang melintang 30 µm. Untuk pewarnaan kriosiseksi, sampel ditanamkan dalam senyawa suhu pemotongan optimum (OCT) (Sakura 4583) dan dipotong menggunakan kriostat CM1950 (Leica). Sampel dicuci dengan PBS selama 5 menit dan diblokir pada suhu kamar dalam 1% BSA, 0,5% Triton X-100 (Sigma) dalam larutan PBS (PBST) selama 2 jam. Antibodi primer (Tabel S18 , Informasi Pendukung) diencerkan dalam larutan PBST 1% BSA dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu 4 °C untuk pewarnaan seluruh sediaan, dan semalaman pada suhu 4 °C untuk kriosiseksi. Sampel kemudian dicuci sedikitnya tiga kali selama 30 menit masing-masing dalam larutan PBST 1X pada pelat agitasi untuk pewarnaan seluruh dudukan, dan sedikitnya tiga kali selama 15 menit masing-masing dalam larutan PBS untuk krioseksi. Sampel kemudian diinkubasi selama 48 jam (seluruh dudukan) pada 4 °C atau 2 jam pada suhu ruangan (krioseksi) dengan larutan antibodi sekunder (Tabel S19 , Informasi Pendukung). Setelah inkubasi dengan antibodi sekunder, sampel dicuci dua kali dengan PBS selama 30 menit masing-masing pada pelat agitasi (seluruh dudukan) atau selama 10 menit (krioseksi). Untuk pewarnaan seluruh dudukan, inti diwarnai tandingan dengan 10 µg mL −1 Hoechst 33 342 (Thermo Fisher). Untuk kriosiseksi, inti sel diwarnai tandingan secara bergantian dengan media pemasangan fluoresen ditambah 100 ng mL −1 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma-Aldrich) atau dengan 10 µg mL −1 Hoechst 33 342 (Thermo Fisher).

Gambar diperoleh menggunakan mikroskop confocal terbalik LSM800 (Zeiss) dan mikroskop stereo fluoresensi Thunder (Leica M205 FCA) yang dilengkapi dengan objektif PLANAP0 1.0X.

Kuantifikasi Imunofluoresensi
Kami menggunakan perangkat lunak Fiji ImageJ [ 66 ] untuk penyesuaian tingkat kecerahan dan kontras, untuk menggabungkan saluran gambar, untuk mendapatkan proyeksi intensitas deviasi standar dan rekonstruksi gambar 3D, dan untuk mengukur luas sampel, miotube, dan panjang serta ketebalan proyeksi saraf. Untuk tujuan kuantifikasi, 6 hingga 10 gambar imunofluoresensi dari tiga replikasi biologis independen untuk setiap sampel diubah menjadi gambar 8-bit dan kemudian dianalisis dengan fungsi pengukuran perangkat lunak ImageJ.

Area diukur pada gambar terkalibrasi menggunakan alat gambar ImageJ untuk menguraikan area sampel dan kemudian menggunakan alat ukur untuk mengukur area secara kuantitatif.

Untuk mengukur jumlah PAX7 +/− , PAX7 + Ki67 +/− dan PAX7 + yang terletak di bawah atau di luar lamina basal, alat Penghitung Sel dari perangkat lunak ImageJ (Fiji, v.2.14.0/1.54f) digunakan. Jumlah sel positif untuk setiap pewarnaan dinormalisasi dengan jumlah total PAX7 + , kecuali untuk sel PAX7 +/− yang dinormalisasi pada jumlah total sel di lapangan, dan dinyatakan sebagai persentase.

Panjang proyeksi akson diukur menggunakan plugin ImageJ NeuronJ. [ 65 ]

Untuk kuantifikasi intensitas fluoresensi, kami mengonversi gambar menjadi 8-bit, dan kemudian, menggunakan alat ukur, kami mengukur kerapatan area terintegrasi dan nilai abu-abu rata-rata. Fluoresensi sel total terkoreksi (CTCF) dinormalisasi untuk latar belakang dengan mengurangi kerapatan terintegrasi setiap ROI yang dipilih dari sinyal latar belakang, menggunakan persamaan berikut: CTCF = Kerapatan Terintegrasi – (Area sel yang dipilih X Rata-rata fluoresensi pembacaan latar belakang). [ 66 ]

ROI dengan ukuran yang sebanding dipilih untuk setiap gambar yang dianalisis. Semua plugin ImageJ yang disebutkan memiliki kode sumber yang tersedia dan dilisensikan di bawah lisensi GNU GPL v.3 sumber terbuka.

Pemurnian RNA dan RT-qPCR
Total RNA sel diisolasi dan dimurnikan menggunakan RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen) sesuai dengan petunjuk pabrik pembuatnya. Sampel-sampel dipecah dan dihomogenkan secara akurat dengan gunting steril sebelum diekstraksi. Semua sampel yang dipanen dan dihomogenkan dilisiskan dengan buffer lisis RNeasy Plus (RLT, Qiagen) dan diproses lebih lanjut sesuai dengan protokol. Kualitas dan konsentrasi RNA yang diekstraksi dinilai menggunakan Nanodrop (Thermo Scientific). DNA komplementer (cDNA) diperoleh dari sampel-sampel menggunakan High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), dalam thermocycler khusus (Mastercycler X50a, Eppendorf).

Ekspresi penanda miogenik dan neural diukur dengan menggunakan 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystem) dan komponen kit Platinum SYBR Green SuperMix (Invitrogen, 11733-038) sesuai dengan petunjuk pabrik pembuatnya. Semua primer yang digunakan tercantum dalam Tabel S20 (Informasi Pendukung).

Nilai Ct target ekspresi gen dinormalisasi dengan nilai Ct GAPDH atau Β2-microglobulin, yang digunakan sebagai gen housekeeping. Data ditampilkan sebagai perubahan lipatan relatif dalam ekspresi gen dengan menerapkan metode 2 −ΔΔCT .

Analisis Statistik
Semua analisis dilakukan dengan GraphPad Prism 9. Data dinyatakan sebagai mean ± SEM atau mean ± sd dari beberapa replikasi biologis (seperti yang ditunjukkan dalam legenda gambar).

Signifikansi statistik ditentukan menggunakan uji Mann-Whitney U. Nilai p di bawah 0,05 dianggap signifikan secara statistik. Data yang mendukung temuan penelitian ini tersedia dari penulis terkait atas permintaan yang wajar.