Profil UPLC-ESI-QTOF-MS/MS, Potensi Antioksidan, dan Sitotoksisitas Ekstrak Marrubium vulgare L.: Analisis Eksperimental dan Validasi Komputasional

ABSTRAK
Ekstrak tanaman muncul sebagai pilihan yang berharga untuk bahan tambahan makanan dan perawatan terapeutik. Studi ini mengevaluasi profil fitokimia, aktivitas antioksidan, dan sitotoksisitas bagian udara ekstrak kasar Marrubium vulgare L. (MVCE) dan subfraksinya. MVCE (80% etanol) mengandung steroid, senyawa fenolik, flavonoid, terpena, dan glikosida jantung, dengan total kandungan fenolik (TPC) dan total kandungan flavonoid (TFC) masing-masing sebesar 14,96 ± 0,12 mg GAE/g DW dan 12,27 ± 0,63 mg RE/g DW. Semua ekstrak MV menunjukkan aktivitas antioksidan yang kuat terhadap DPPH • (0,106–1,864 mg/mL) dan ABTS +• (0,298–17,084 mg/mL). Fraksi air residu MV (MVRF) menunjukkan sitotoksisitas signifikan terhadap lini sel kanker manusia, termasuk MCF7 (IC 50 = 5,47 ± 1,32 µg/mL), HT29 (IC 50 = 17,48 ± 1,47 µg/mL), dan SW480 (IC 50 = 7,51 ± 0,36 µg/mL). Kromatografi cair kinerja ultra-spektrometri massa mengidentifikasi 26 senyawa bioaktif, dengan asam malat, asam kafeat, asam klorogenat, kaempferol-3-glukuronida, dan l -triptofan sebagai senyawa utama. Docking molekuler mengungkapkan afinitas pengikatan yang kuat dari senyawa-senyawa di atas terhadap protein kanker payudara (PDB ID: 6CHZ) dan kanker kolorektal (PDB ID: 1HVY). Studi farmakokinetik dan toksikologi mengonfirmasi keamanan dan kemanjurannya, yang mendukung MVRF sebagai agen terapeutik yang potensial. Temuan ini menyoroti MV sebagai kandidat yang menjanjikan untuk penelitian antikanker di masa mendatang.

Abstrak Grafis

1 Pendahuluan
Kanker merupakan masalah kesehatan masyarakat yang signifikan di tingkat global, yang diidentifikasi sebagai beban yang tidak menular dan multifaktorial [ 1 , 2 ]. Seperti yang ditunjukkan oleh basis data Global Cancer Observatory (GCO), kanker merupakan salah satu penyebab utama kematian di negara-negara Gulf Cooperation Council (GCC) [ 3 ]. Pada tahun 2022, Arab Saudi memiliki jumlah kasus baru (28.113) dan jumlah kematian tertinggi (13.399) akibat kanker di dunia. Estimasi kasus prevalen 5 tahun adalah 46.288 pada pria dan 48.663 pada wanita [ 4 ]. Kanker payudara (KP) dan kanker kolorektal (KKR) adalah keganasan yang paling umum terjadi dan penyebab utama kematian akibat kanker untuk kedua jenis kelamin di Arab Saudi, masing-masing mencakup 3.777 (13,4%)/1.046 dan 3.750 (13,3%)/1.883 kasus baru/kematian dari semua kejadian kanker [ 5 ]. Pembentukan spesies oksigen reaktif (ROS) yang berlebihan dan abnormal di atas ambang toleransi seluler, diikuti dengan melemahnya sistem pertahanan imun, dapat mengganggu patologi kanker [ 6 – 8 ].

Penghapusan sel-sel ini melalui peningkatan kemampuan pemulungan merupakan strategi yang menjanjikan untuk terapi kanker [ 6 – 8 ]. Terapi kanker konvensional meliputi prosedur pembedahan, radiasi, terapi hormonal dan terapi bertarget, dan kemoterapi, yang sering mengakibatkan efek samping yang signifikan [ 9 , 10 ]. Doksorubisin (DOX) adalah obat kemoterapi yang efektif yang secara luas diakui sebagai salah satu obat paling populer yang digunakan untuk mengobati BC manusia metastasis [ 11 , 12 ]. Sebaliknya, farmakope tradisional kontemporer yang berasal dari biomolekul yang berasal dari tanaman telah muncul sebagai strategi yang menjanjikan untuk tujuan terapeutik yang lebih aman dan lebih efektif, dengan tujuan mencegah atau menyembuhkan kanker melalui penemuan obat antikanker yang potensial [ 13 – 16 ].

Marrubium vulgare L. (MV), anggota famili Lamiaceae, adalah tanaman asli tahunan yang dikenal dengan sebutan white horehound. Tanaman ini memiliki distribusi alami di Afrika Utara, Eropa, dan Asia Tengah [ 17 ]. Tanaman ini secara tradisional dilaporkan memiliki berbagai efek terapeutik, termasuk pengobatan peradangan, infeksi paru-paru, artritis reumatoid, rabun senja, dan gangguan perut [ 18 – 20 ]. Analisis fitokimia mengungkapkan banyaknya diterpen (labdan), terutama marrubenol dan marrubiin [ 18 – 22 ]. Ekstrak dari tanaman ini menyediakan sumber molekul bioaktif yang berharga yang dapat digunakan dalam pengembangan obat baru.

Tanaman genus Marrubium telah terbukti memiliki kandungan fenolik yang tinggi, meliputi sebagian besar kelas, termasuk asam fenilpropanoid dan fenolik, ester, flavonoid, turunan flavon (aglikon flavon dan glikosida flavon), dan tanin [ 23 , 24 ]. Selain itu, keberadaan senyawa yang mengandung nitrogen, polisakarida, fitosterol, asam amino, asam organik, alkaloid, dan mineral, khususnya garam kalium dalam MV telah didokumentasikan [ 25 – 27 ]. Efisiensi tinggi fitokimia ini untuk berbagai tujuan dan atribut farmakologis bermanfaat yang diketahui telah menyebabkan tanaman ini ditetapkan sebagai “obat tanaman” untuk digunakan dalam terapi kanker dan kesehatan umum. Penelitian biologi telah mengkonfirmasi efek analgesik, antioksidan, diuretik, hipoglikemik, hipolipidemik, antihipertensi, antidiabetik, diaforetik, antinosiseptif, antispasmodik, gastroprotektif, antiinflamasi, antimikroba, vasodilatasi, dan antiproliferatif dari tanaman ini [ 22 , 28 , 29 ]. Sebagai minuman herbal, tanaman ini sering dimasukkan ke dalam teh, sirup, dan olahan lainnya. Tanaman ini juga digunakan sebagai obat pahit dan koleretik, serta untuk keluhan dispepsia ovoid dan dalam aplikasi makanan [ 30 ].

Penelitian ini dirancang untuk menjelaskan fitokonstituen dan profil metabolit ekstrak MV melalui penggunaan pendekatan metabolomik tak bertarget, menggunakan kromatografi cair kinerja sangat tinggi dengan waktu tempuh kuadrupol dan spektrometri massa (UHPLC-QTOF-MS/MS). Efek antioksidan dan sitotoksik ekstrak dievaluasi, sementara docking molekuler dan analisis farmakokinetik fitokomponen utama terpilih dari fraksi air residu MV (MVRF), yang menggarisbawahi sifat antikanker yang kuat, dilakukan.

2 Hasil dan Pembahasan
2.1 Skrining Fitokimia, Total Kandungan Fenolik, dan Total Kandungan Flavonoid
Skrining fitokimia kualitatif dari ekstrak kasar MV (MVCE) mengungkapkan keberadaan steroid, senyawa fenolik, flavonoid, terpena, dan glikosida jantung, tetapi tidak adanya alkaloid dan saponin (hasil tidak ditampilkan). Total kandungan fenolik (TPC) dan total kandungan flavonoid (TFC) dalam MVCE ditemukan masing-masing sebesar 14,96 ± 0,12 mg GAE/g berat kering (DW) dan 12,27 ± 0,63 mg RE/g DW. Beberapa penelitian terbaru telah difokuskan pada TPC dan TFC spesies ini. Michalak et al. menunjukkan TPC sebesar 55,72 mg GAE/mL dan TFC sebesar 11,01 mg ekuivalen katekin/mL dalam ekstrak 50/50 etanol/air (v/v) dari bagian udara MV yang dikumpulkan dari Polandia menggunakan ultrasonikasi [ 31 ]. Bahasa Indonesia: menentukan TPC dengan spektrofotometri dan memperoleh 240,46 ± 12,19 mg GAE/g DW kandungan fenolik dalam ekstrak etanol 70% dari bagian atas tanah yang dimaserasi yang berasal dari Mesir selama 3 minggu [ 32 ]. Infus panas bagian udara MV dari Tunisia menunjukkan kekayaan kandungan fenolik (73,619 mg GAE/g ekstrak) [ 33 ]. Gavarić et al. melaporkan bahwa TPC dan TFC dalam ekstrak MV dipengaruhi oleh metode ekstraksi dalam urutan menurun berikut: ekstraksi gelombang mikro > ekstraksi berbantuan ultrasonik > ekstraksi padat-cair konvensional. TPC berkisar antara 63,77 hingga 117,58 mg GAE/g DW, sedangkan TFC berkisar antara 42,51 hingga 65,80 mg ekuivalen katekin/g DW [ 34 ]. Di sisi lain, Khouchlaa et al. dilaporkan bahwa TPC dan TFC ekstrak metanol bagian udara MV dari Maroko tidak melebihi 0,0430 mg GAE/g DW dan 1,644 mg quercetin/g DW, masing-masing, selama tiga tahap perkembangan [ 35 ]. Sementara itu, ekstrak metanol daun MV yang dikumpulkan dari Provinsi Al-Taif (KSA) menunjukkan TPC sebesar 36,8 mg GAE/g DW [ 36 ].

Secara keseluruhan hasil diatas menunjukkan bahwa kandungan metabolit sekunder dipengaruhi oleh faktor genetik, faktor geografis dan lingkungan, kondisi iklim regional, jenis ekstraksi padat/cair (umum/hijau), jenis ekstrak (organik/air), dan indeks polaritas pelarut [ 34 , 37 – 39 ].

2.2 Aktivitas Antioksidan
MVCE dan subfraksinya menunjukkan aktivitas penangkal radikal DPPH • dan ABTS +• yang bergantung pada konsentrasi yang dinyatakan sebagai nilai IC 50 (mg/mL) yang dirangkum dalam Tabel 1. Temuan kami menunjukkan bahwa semua ekstrak secara signifikan mengurangi radikal DPPH • pada berbagai tingkatan ( p < 0,05). MVPF (1,864 ± 0,069 mg/mL) adalah yang paling tidak efektif, diikuti oleh MVCF dan MVRF, tanpa perbedaan signifikan yang dapat diamati, diikuti oleh MVCE, yang secara signifikan kurang efektif daripada MVEF. Fraksi yang terakhir menunjukkan potensi pemadaman radikal tertinggi di antara semua ekstrak, tetapi sebanding dengan kontrol positif (Trolox, 0,012 ± 0,000 mg/mL) dengan nilai 0,106 ± 0,008 mg/mL karena perbedaan nilai IC 50 tidak signifikan ( p = 0,161). Efek MVCE dan subfraksi pada radikal ABTS +• juga dipelajari. Semua ekstrak mampu memadamkan radikal kationik ABTS +• kecuali MVPF (17,084 ± 1,101 mg/mL). Efektivitas ekstrak kasar dan subfraksi yang sesuai sebagai pemadam ABTS +• diperingkat dalam urutan peningkatan berikut: MVCF (3,375 ± 0,120 mg/mL) < MVRF (1,727 ± 0,018 mg/mL), MVCE (1,473 ± 0,075) ( p = 0,980) ≤ MVEF (0,298 ± 0,027), Trolox (0,055 ± 0,000 mg/mL) ( p = 0,984).

TABEL 1. DPPH (IC 50 , mg/mL) dan ABTS +• (IC 50 , mg/mL) ekstrak kasar dan subfraksi bagian atas Marrubium vulgare L.

Catatan : Nilai merupakan rata-rata dari tiga replikasi ± simpangan baku ( n = 3). Huruf yang berbeda dalam kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang signifikan menurut uji Tukey pada p < 0,05. Secara keseluruhan, kita dapat menyimpulkan bahwa hanya MVCE, MVEF, dan MVRF yang bekerja dengan sangat baik terhadap DPPH • dan ABTS +• untuk mengurangi radikal stabil di antara semua ekstrak yang dipelajari. Urutan menurun potensi penangkalan radikal adalah sebagai berikut: MVEF > MVCE > MVRF, tetapi mereka masih kurang efektif dibandingkan kontrol positif. Hal ini dapat dijelaskan oleh banyaknya fitokimia dalam ekstrak ini yang berfungsi sebagai donor hidrogen potensial yang menginduksi pengurangan radikal bebas [ 40 ]. Pengujian DPPH • dan ABTS +• keduanya merupakan proses transfer atom hidrogen yang bekerja pada mekanisme yang identik [ 41 ]. Oleh karena itu, jelas bahwa mereka mengungkapkan hasil yang konsisten.

Baru-baru ini, Duc et al. menghubungkan efektivitas senyawa fenolik sebagai inhibitor oksidasi dengan struktur kimianya [ 42 ]. Keberadaan dan lokasi gugus hidroksil pada cincin aromatik penting, karena mereka berkontribusi pada energi disosiasi ikatan rendah dan kekuatan pada asam fenolik dan flavonoid. Lebih jauh, efektivitas flavonoid dalam menetralkan radikal bebas terkait dengan keberadaan ikatan rangkap antara C-2 dan C-3 dalam konjugasi dengan gugus karbonil pada C-4 dan tidak adanya unit gula pada C-3. Penelitian sebelumnya melaporkan kapasitas MV untuk memadamkan radikal DPPH • dan ABTS + • karena adanya beberapa antioksidan kuat seperti glikosida feniletanoid, tanin, flavonoid, dan asam fenolik [ 43 ].

2.2.1 Korelasi Antara Senyawa Fenolik dan Aktivitas Antioksidan
Dalam studi ini, analisis korelasi Pearson dilakukan untuk mengeksplorasi hubungan antara TPC dan TFC dan aktivitas antioksidan (DPPH • dan ABTS +• ) dari MVCE. Tujuan dari analisis ini adalah untuk memastikan cara di mana perubahan dalam konsentrasi fenolik dan flavonoid dikaitkan dengan kemampuan antioksidan tanaman, dengan demikian menawarkan wawasan tentang kontribusi senyawa-senyawa ini terhadap efek bermanfaat tanaman secara keseluruhan. Seperti yang diilustrasikan dalam Tabel 2 , ada korelasi yang kuat antara TPC dan TFC ( r = 0,887). Koefisien korelasi antara DPPH • dan (TPC dan TFC) adalah r = −0,852 ( p > 0,05) dan −0,998 ( p < 0,05), masing-masing, yang menunjukkan korelasi negatif yang signifikan antara asam fenolik dan flavonoid dan penghambatan DPPH • . Selanjutnya, korelasi positif sedang diidentifikasi antara ABTS +• dan TPC ( r = 0,439, p > 0,05), sementara korelasi positif kuat diamati antara ABTS +• dan TFC ( r = 0,805, p > 0,05).

TABEL 2. Uji korelasi Pearson ( nilai r ) antara TPC, TFC, dan kapasitas antioksidan (uji DPPH • dan ABTS +• ) untuk MVCE.

* Korelasi signifikan pada p ≤ 0,05.
Perilaku antioksidan yang kontras ini dapat dijelaskan oleh faktor-faktor seperti stabilitas radikal, mekanisme reaksi, dan sifat struktural polifenol, termasuk struktur dasar, jumlah dan posisi gugus hidroksil, dan kriteria Bors [ 44 , 45 ]. Penting juga untuk mempertimbangkan faktor-faktor lain, seperti pH, pelarut, karbohidrat, dan kandungan protein, karena ini dapat memengaruhi aktivitas ekstrak alami yang dilaporkan [ 46 ]. Sebagai kesimpulan, TPC dan TFC menunjukkan korelasi yang kuat dengan uji DPPH • dibandingkan dengan uji ABTS + • . Hal ini menggarisbawahi peran penting fenolik dan flavonoid dalam kapasitas antioksidan, terutama dalam hal aktivitas penangkal radikal DPPH • .

2.3 Sitotoksisitas pada Sel Normal dan Sel Kanker
Sitotoksisitas ekstrak kasar MV dan subfraksinya dievaluasi setelah 72 jam inkubasi pada tiga lini sel kanker (MCF7, HT29, dan SW480) dan satu lini sel MRC5 non-kanker. Nilai IC50 ( µg/mL) ditentukan melalui penggunaan uji MTT. Semua ekstrak menunjukkan aktivitas sitotoksik bergantung dosis terhadap tiga lini sel kanker yang diuji. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 3 , ekstrak kasar dan lima subfraksinya menunjukkan sitotoksisitas yang nyata terhadap lini sel yang disebutkan di atas, dengan nilai p kurang dari 0,05. Hasilnya menunjukkan perbedaan yang nyata di antara lini sel dan ekstrak, dengan beberapa menunjukkan aktivitas yang relatif berkurang relatif terhadap DOX.

TABEL 3. Aktivitas sitotoksik ekstrak kasar Marrubium vulgare dan subfraksinya terhadap tiga lini sel dan fibroblas normal (MTT 72 jam, IC 50 “µg/mL” ± SD, n = 3).

Catatan : Rata-rata sitotoksisitas (IC 50 ) setiap ekstrak terhadap tiga sel kanker. Nilai adalah rata-rata dari tiga replikasi ± simpangan baku ( n = 3). Huruf yang berbeda dalam kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang signifikan menurut uji Tukey ( p < 0,05).
Nilai IC 50 berkisar dari 5,47 ± 1,32 hingga 24,68 ± 1,40 µg/mL terhadap MCF7. Urutan efek sitotoksik ekstrak adalah sebagai berikut: MVEF < MVCF < MVPF < MVCE < MVRF. Mengenai HT29, nilai IC 50 menunjukkan kisaran 15,85 ± 0,46–44,78 ± 2,70 µg/mL. Hasilnya menunjukkan bahwa MVCE kurang poten dibandingkan MVCF dan MVEF (p = 0,756), yang pada gilirannya kurang poten dibandingkan MVPF dan MVRF ( p = 0,866). Terhadap SW480, nilai IC 50 berkisar dari 7,51 ± 0,36 hingga 35,35 ± 1,15 µg/mL. Urutan efek sitotoksik ekstrak adalah sebagai berikut: Urutan efek sitotoksik ekstrak adalah sebagai berikut: MVCF < MVPF < MVEF < MVCE, MVRF ( p = 0,191). Sebaliknya, ekstrak kasar dan subfraksinya menunjukkan dampak sedang hingga lemah pada lini sel MRC5 yang sehat, dengan nilai IC 50 berkisar dari 13,29 ± 0,92 hingga 45,27 ± 1,90 µg/mL. Efek yang diamati ditemukan berkurang dalam urutan menurun berikut: MVCE, MVPF, dan MVCF ( p = 0,849) menunjukkan potensi yang lebih besar daripada MVRF dan MVEF. Seperti yang dapat diamati, MRC5 menunjukkan sensitivitas yang berkurang terhadap aksi ekstrak MV, yang merupakan hasil yang diantisipasi mengingat sel-sel normal ini tidak bertransformasi dan bersifat sel jaringan ikat yang sehat [ 47 ]. Secara umum, lini sel payudara dan kolorektal manusia menunjukkan sensitivitas yang lebih besar terhadap fraksi polar daripada fraksi yang kurang polar. MVRF menunjukkan kemanjuran terbesar terhadap semua lini sel kanker. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa proses fraksinasi yang diadopsi menghasilkan produksi fraksi dengan aktivitas yang lebih besar daripada ekstrak mentah. Hasil ini dapat dikaitkan dengan perbedaan dalam komposisi fitokimia, bergantung pada polaritas fraksi dalam kaitannya dengan jenis ekstraksi pelarut dan indeks polaritas.

2.4 Karakterisasi UPLC-ESI-QTOF-MS/MS Fraksi Air Residu MV
Konstituen fitokimia dari MVRF diidentifikasi sementara dengan menggunakan UHPLC-QTOF-MS/MS. Selain itu, basis data HMDB ( http://www.hmdb.ca/ ) dan Mass Bank ( https://massbank.eu/MassBank/ ) dikonsultasikan untuk tujuan identifikasi, dengan memanfaatkan massa molekul yang dimaksud secara tepat. Secara total, 26 puncak diidentifikasi, dengan 11 dalam mode ESI negatif, 12 dalam mode ESI positif, dan 3 senyawa diidentifikasi dalam kedua mode. Hasilnya disajikan dalam Tabel 4 , dan kromatogram ion total (TIC) untuk mode ESI − dan ESI + ditampilkan dalam materi tambahan Gambar S1a,b , masing-masing. Metabolit sekunder yang diidentifikasi termasuk dalam berbagai kelas produk alami, termasuk tiga asam organik, dua asam fenolik, enam glikosida flavonoid, dan senyawa lain, seperti yang dirinci dalam Tabel 4 . Spektrum MS/MS dan struktur beberapa senyawa yang teridentifikasi disajikan masing-masing pada Gambar S2 dan S3 .

TABEL 4. Analisis metabolik UPLC-ESI-QTOF-MS/MS dari MVRF.

2.4.1 Identifikasi Asam Organik dan Turunannya
Asam suksinat (1,008 min) diidentifikasi berdasarkan ion [M─H] − pada m / z 117,0199 yang sesuai dengan rumus molekul C4H6O4 dan fragmen ion yang dihasilkan pada m / z 55,0201 [M─CO2─H2O ] − , 73,0301 [M─CO2 ] − dan 99,0081 [ M─H2O ] − . Temuan ini konsisten dengan data yang dilaporkan dalam literatur [ 48 , 49 ] . Sejauh pengetahuan kami, ini adalah pertama kalinya asam suksinat dilaporkan dalam genus Marrubium .

Asam malat (1,046 min) diidentifikasi berdasarkan ion [M−H] − pada m / z 133,0128 yang sesuai dengan C4H6O5 Bursal et al . serta ion produk yang dihasilkan pada m / z 115,0024, 89,0231, dan 71,0134 yang sesuai dengan [M─H─H2O ] − , [M─H─CO2 ] − dan [M─H─H2O─CO2 ] − , masing – masing [ 90 ]. Ini sangat sesuai dengan laporan sebelumnya [ 50 , 52 ]. Asam malat ditemukan kaya akan Marrubium astracanicum subsp. macrodon [ 90 ]. Asam sitrakonat (RT = 1,474 menit ) diidentifikasi berdasarkan prekursor terdeprotonasinya [M−H] − pada m / z 128,96 yang sesuai dengan C5H6O4 dan puncak basa pada m / z 84,98897 yang sesuai dengan [M─H─CO2 ] − . Pola fragmentasi cocok dengan deskripsi asam sitrakonat sebagaimana didokumentasikan dalam basis data MassBank.

2.4.2 Identifikasi Asam Fenolik
Dalam penelitian ini, hanya dua asam fenolik yang diidentifikasi dalam fraksi air residu yang diklasifikasikan sebagai asam hidroksisinamat. Asam kafeat, juga dikenal sebagai asam 3,4-dihidroksisinamat (RT = 1,087 menit), dikarakterisasi dalam mode negatif berdasarkan [M─H] − pada m / z 179,0575 yang sesuai dengan C 9 H 8 O 4 [ 49 , 55 , 57 ]. Hal ini juga dikonfirmasi dengan spektrum MS/MS yang menunjukkan ion-ion fragmen karakteristik yang dihasilkan dari kehilangan air, CO, dan CO2 secara terus-menerus pada m / z 161,0459 [ M─H2O ] − , 143,0354 [M─H─2H2O ] −, 135 [M─H─CO2 ] − , 99,0069 [ M─H─2H2O─CO2 ] − , dan 89,0326 [M─H─CO2─CO─H2O ] − . Pola fragmentasi ini selaras dengan penelitian sebelumnya [ 53 , 54 , 56 , 91 ]. Fragmen lain pada m / z 71.0128 berhubungan dengan ion [M─H─C6H4O2 ] – . Asam kafeat sebelumnya telah diidentifikasi dalam MV [ 31 , 43 , 92 , 93 ] dan spesies Marrubium lainnya seperti Marrubium trachyticum Boiss [ 94 ] , Marrubium peregrinum L., dan Marrubium friwaldskyanum Boiss [ 95 ].

Asam klorogenat, juga dikenal sebagai asam 5-caffeoylquinic (RT = 6,087 menit ) diidentifikasi dalam mode positif berdasarkan ion molekuler terprotonasi [M+H] + pada m/z 355,1042 dan sesuai dengan C9H8O4 [58, 59, 61 ] . Puncak karakteristik lainnya terdeteksi pada m / z 163,0403 , 145,0298 , 135,0466 , dan 117,0314 [ 58 , 59 ] . Ion fragmen pada m / z 163,0387 mungkin disebabkan oleh hilangnya gugus C7H11O6 yang diakibatkan oleh pembelahan ikatan caffeoyl yang diikuti oleh hilangnya molekul air secara netral [ 59 , 60 ] . Ion-ion fragmen pada 145,0298 dan 135,0466 diperoleh dari kehilangan netral H2O dan CO dari ion pada m / z 163,0387, berturut-turut. Kedua ion menghasilkan fragmen pada m / z 117,0314 melalui kehilangan netral H2O atau CO, seperti yang disarankan oleh Willems et al. Asam klorogenat diidentifikasi dalam MV [ 20 , 96 ] dan spesies Marrubium lainnya [ 97 ] Marrubium lutescens dan M. trachyticum Boiss [ 94 , 98 ]. Asam kafeat dan asam klorogenat adalah turunan hidroksi umum dari asam sinamat [ 99 ] . Kedua asam tersebut dikenal karena potensi terapeutiknya yang tinggi karena sifat antioksidan, antikanker, antimikroba, dan banyak sifat lainnya [ 85 , 100-103 ] .

2.4.3 Identifikasi Flavonoid
Dalam penelitian terkini, tiga subkelas flavonoid dalam fraksi air residu telah diidentifikasi. Subkelas ini meliputi tiga flavonol, dua flavon, dan satu flavanon, yang semuanya merupakan glikosida O dan C.

Senyawa yang dielusi pada menit 1,309 menunjukkan ion induk [M−H] − pada m / z 447.1173. Senyawa ini diidentifikasi sementara sebagai quercitrin (quercetin 3-rhamnoside) yang cocok dengan C21H20O11 [ 62 ] . Puncak pada m / z 149 dan 151 diperoleh dari retro-Diels Alder dari aglikon quercetin dan masing -masing berhubungan dengan ion 1,3 B− dan 1,3 A− . Banyak quercetin O-glikosida diidentifikasi dalam beberapa spesies Marrubium seperti quercitrin-O-gallate, quercetin-7- O- galloyl-glucoside, dan quercetin-diglucuronide dalam Marrubium anisodon serta quercetin-3- O -glucoside-6″-acetate, quercetin-3- O- pentosyl-pentoside, quercetin-3- O- glucuronide dan quercetin-3- O -glucoside6″-acetate dalam Marrubium crassidens [ 104 ]. [ 105 ] meninjau bahwa quercetin 3- O -β- d -rutinoside, quercetin 3- O -β- d -glucoside, quercetin 3- O -α-1-rhamnosyl-glucoside, dan aglikon quercetin diidentifikasi dalam MV tetapi tampaknya quercitrin diidentifikasi untuk pertama kalinya dalam spesies ini. Chen et al. meninjau spektrum luas aktivitas farmakologis yang ditunjukkan oleh quercitrin, yang meliputi pengurangan stres oksidatif dan peradangan serta penghambatan mikroorganisme [ 106 ]. Selain itu, quercitrin telah terbukti melindungi organ vital dan menunjukkan potensi terapeutik untuk berbagai penyakit seperti tukak lambung, penyakit imun, dan kanker.

Kaempferol-3-glukuronida (RT = 6,251 menit ) diidentifikasi karena ion induknya [M−H] − pada m / z 461,0727 yang sesuai dengan C21H18O12 [ 62 , 64 ] , yang menghasilkan ion anak dominan pada m / z 285,0406 yang menunjukkan hilangnya residu asam glukuronat (176 Da) [ 65 ]. Puncak lain pada m / z 175 diamati dan dijelaskan oleh hilangnya bagian aglikon [ 63 ]. Dalam mode positif, senyawa ini dielusi pada 9,756 menit dan menunjukkan ion induk [M+H] + pada m / z 463,0873 , yang menghasilkan ion anak yang kuat pada m / z 287,0552 relatif terhadap ion [M+H−176] + [ 66 ]. Kaempferol-3-glucuronide diidentifikasi di M. crassidens [ 104 ]. Dilaporkan bahwa kaempferol-3-glucuronide telah menunjukkan aktivitas pemulungan yang tinggi dan efektivitas dalam mengobati berbagai jenis kanker [ 51 , 107 ].

Isorhamnetin-3- O -rutinoside (RT = 7,484 min) diidentifikasi karena menghasilkan prekursor negatif m / z = 623,1998 [M−H] − yang sesuai dengan rumus molekul C 28 H 32 O 16 [ 72 ], yang dikonfirmasi oleh deteksi ion fragmen pada nilai m / z 461,1672 [M−H−162] − dan 315,1061 [M−H−162−146] − yang sesuai dengan bagian aglikon (isorhamnetin). Kehilangan total 308 Da merupakan karakteristik dari bagian disakarida (rutinosa) [ 65 , 67 ]. Senyawa ini diidentifikasi dalam Marrubium globosum [ 105 ] dan M. friwaldskyanum [ 95 ]. Sebagaimana dilaporkan dalam makalah penelitian sebelumnya, ditemukan bahwa isorhamnetin-3- O -rutinoside menunjukkan efek pemulungan dan antiproliferatif yang tinggi [ 108 , 109 ].

Senyawa yang dielusi pada menit ke-5,785 menghasilkan ion [M−H] − pada m / z 593,1507 dalam mode negatif, dan dalam mode positif, senyawa tersebut dielusi pada menit ke-6,117 dan menghasilkan ion [M+H] + pada m / z 595,1673 yang menunjukkan rumus molekul C27H30O15 , diidentifikasi sebagai vicenin-2 yang juga dikenal sebagai apigenin 6,8-di-C-glukosa. Pola fragmentasi selaras dengan deskripsi vicenin-2 [ 70 , 73 , 74 , 110 ]. Di sisi lain, pola fragmentasi ion vicenin-2 terprotonasi [M+H] + bersifat kompleks. Kehilangan air yang melimpah pada ion pada m / z 577 ([M+H−H2O ] + ) , m / z 559 [M+H−2H2O ] + , dan m / z 529 ([M+H− CH2O − 2H2O ] + ) telah diamati [ 76 , 111 ]. Selain itu, puncak-puncak lain yang berasal dari hilangnya 120 dan/atau 150 Da dari molekul terprotonasi, seperti m / z 295 0,1 X + 1 0,1 X + 2 [M+H−150−150] + ; m / z 325 0,1 X + 1 0,2 X + 2 [M+H−120−150] + , m / z 337 0,2 X + 1 0,2 X + 2 −H 2 O [M+H−120−120−18] + ; m / z 379 0,2 X + 1 0,4 X + 2 −2H 2 O [M + H−120−96] + dan m / z 457 0,2 X + 1 −H 2 O [M + H−120−18] + . Pola fragmentasi ini konsisten dengan penelitian sebelumnya [ 69 , 75 , 76 , 112 ]. Situs fragmentasi ditampilkan dalam informasi pendukung Gambar S4Apigenin dan beberapa turunannya telah diidentifikasi dalam MV sebagai O-glikosida, O-glukuronida, dan C-glikosida [ 113 , 114 ]. Vicenin-2 telah diketahui menunjukkan beberapa sifat farmakologis, termasuk efek antioksidan pelindung hati, antiinflamasi, dan antikanker [ 115 ].

Baicalein-7- O -glukuronida, juga dikenal sebagai baicalin (RT = 6,732 min) diidentifikasi sementara berdasarkan ion molekuler [M−H] − pada m / z = 445,0794 yang sesuai dengan C21H18O11 bersama dengan ion fragmen dominan pada nilai m / z 269,0476 [M−H−176] − yang sesuai dengan hilangnya asam glukuronat [ 65 , 72 ] . Puncak lain pada m / z 175,0254 diamati dan dijelaskan oleh hilangnya bagian aglikon [ 77 ]. Senyawa ini sebelumnya ditemukan dalam genus Marrubium dan baru-baru ini ditunjukkan dalam MV. Dalam tinjauan baru-baru ini, Bao et al. menekankan manfaat kesehatan baicalin, seperti sifat anti-inflamasinya, kemampuan mengurangi stres oksidatif, menghambat berbagai virus, dan berpotensi menekan pertumbuhan berbagai sel tumor [ 116 ].

Naringenin-7- O glukosida, juga dikenal sebagai prunin (RT = 8,845 min) diidentifikasi berdasarkan ion molekuler terprotonasinya [M+H] + pada m / z 435,1280 yang sesuai dengan C21H22O10 [ 78 ]. Puncak yang terdeteksi pada 273,0377 disebabkan oleh hilangnya bagian glikosida (162 Da), yang merupakan indikator residu aglikon (naringenin). Baru-baru ini, naringenin 7- O – glukosaida diidentifikasi dalam Marrubium alysson L. dan M. globosum [ 88 , 105 ]. Dalam penelitian terbaru, naringenin-7- O -glukosaida diuji secara in vitro terhadap panel lini sel kanker. Telah ditunjukkan bahwa glikosida flavon ini berpotensi menjadi agen terapeutik yang ditargetkan [ 117 ].

2.5 Implikasi Senyawa Utama pada Aktivitas Biologis
Di antara 26 senyawa yang diidentifikasi dalam MVRF menggunakan UPLC-ESI-QTOF-MS/MS, lima senyawa utama dipilih: asam malat, asam kafeat, asam klorogenat, kaempferol-3-glukuronida, dan l -triptofan. Senyawa-senyawa ini dikenal karena aktivitas antioksidan dan efek sitotoksiknya.

Potensi antioksidan dari asam malat [ 118 , 119 ], asam kafeat [ 102 , 120 , 121 ], asam klorogenat [ 121 , 122 ], kaempferol-3-glukuronida (kaempferol yang dihubungkan ke gugus asam glukuronat melalui ikatan glikosidik pada posisi ke-3 flavonoid) [ 123 ], dan l -triptofan [ 124 ] telah dilaporkan. Selain itu, potensi asam malat untuk menginduksi kerusakan antikarsinogenik dan genotoksis pada sel fibroblas manusia (HDFa) dan lini sel glioblastoma (U87-MG) telah dibuktikan [ 125 ]. Tindakan antitumor asam kafeat, termasuk efek penghambatannya pada migrasi sel dan pengurangan metastasis pada sel tumor, telah diselidiki [ 126 , 127 ]. Selain itu, potensi antikanker asam kafeat pada beberapa kanker manusia telah terdokumentasikan dengan baik [ 128 – 130 ]. Asam klorogenat telah diketahui perannya dalam pencegahan dan terapi kanker [ 131 ], dengan bukti yang menunjukkan kemampuannya untuk menginduksi apoptosis dan penghentian siklus sel [ 132 ]. Efek biologis kaempferol-3-glukuronida, mirip dengan kaempferol, telah diamati pada beberapa lini sel kanker. Selain itu, peran kaempferol dalam menghambat invasi karsinoma payudara manusia telah dieksplorasi [ 133 ].

Berdasarkan data literatur di atas, asam malat, asam kafeat, asam klorogenat, kaempferol-3-glukuronida, dan l -triptofan dipilih sebagai senyawa kunci untuk perhitungan docking molekuler dan profil farmakokinetik selanjutnya.

2.6 Analisis Docking Molekuler
Reseptor estrogen alfa (ERα) adalah reseptor hormon nuklir yang diaktifkan oleh hormon estrogen. Ia memainkan peran penting dalam mengatur pertumbuhan dan perkembangan jaringan, khususnya pada payudara dan organ reproduksi. ERα terlibat secara signifikan dalam patogenesis kanker yang digerakkan oleh hormon, khususnya BC, di mana ekspresinya yang berlebihan mendorong pertumbuhan dan kelangsungan hidup tumor [ 134 , 135 ]. Sebaliknya, human thymidylate synthase (TS) adalah enzim penting dalam jalur folat, yang bertanggung jawab untuk mengkatalisis konversi deoxyuridylate (dUMP) menjadi thymidylate (dTMP), suatu nukleotida yang penting untuk sintesis dan perbaikan DNA. Aktivitas TS sangat penting untuk sel-sel yang membelah dengan cepat, seperti sel-sel kanker, yang memiliki peningkatan permintaan untuk replikasi DNA [ 136 ]. Hasil docking untuk fitokompon terhadap ERα (PDB ID: 6CHZ) dan TS (PDB ID: 1HVY) dirangkum dalam Tabel 5 , dengan skor docking menunjukkan afinitas pengikatan setiap senyawa. Dalam protein 6CHZ, asam malat menunjukkan afinitas pengikatan sebesar -6,254 kkal/mol, berinteraksi dengan situs aktif reseptor 6CHZ melalui interaksi utama (Gambar 1A ). Ikatan hidrogen diamati dengan residu Glu353 dan Arg394, yang menunjukkan stabilisasi melalui interaksi elektrostatik. Selain itu, Arg394 terlibat dalam interaksi ionik, yang dapat meningkatkan kekuatan pengikatan dan berkontribusi pada stabilitas kompleks secara keseluruhan. Dengan afinitas pengikatan sebesar -6,992 kkal/mol, asam kafeat menunjukkan interaksi yang lebih kuat, terutama melalui ikatan hidrogen. Arg394 dan Glu353 merupakan residu utama yang membentuk ikatan hidrogen, yang menunjukkan mode pengikatan yang kuat dan berpotensi selektif (Gambar 1B ). Interaksi ini dapat memfasilitasi posisi senyawa yang tepat di kantong pengikat, sehingga meningkatkan potensi aktivitas biologisnya.

TABEL 5. Skor docking (dalam kkal/mol) dari fitokomponen di situs aktif reseptor estrogen alfa (PDB ID: 6CHZ) dan timidilat sintase manusia (PDB ID: 1HVY).


GAMBAR 1
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Diagram interaksi pengikatan 3D dari senyawa fito (A) asam malat, (B) asam kafeat, (C) asam klorogenat, (D) kaempferol-3-glukuronida, (E) l -triptofan ke dalam situs aktif reseptor estrogen alfa (PDB ID: 6CHZ).
Asam klorogenat menunjukkan afinitas pengikatan sedang sebesar -6,164 kkal/mol, yang membentuk interaksi kritis dengan Asp351 (Gambar 2C ). Interaksi tunggal ini mungkin menunjukkan pengikatan yang kurang kuat dibandingkan dengan senyawa lain, tetapi afinitasnya masih dapat berkontribusi pada aktivitas biologis yang signifikan, tergantung pada dinamika keseluruhan lingkungan tempat pengikatan. Kaempferol-3-glukuronida muncul sebagai yang paling kuat di antara senyawa-senyawa tersebut, dengan afinitas pengikatan sebesar -8,715 kkal/mol. Senyawa tersebut menunjukkan beberapa interaksi dengan residu utama, termasuk Leu387, Glu353, Asp351, dan Leu346 (Gambar 1D ). Banyaknya interaksi ini menunjukkan pengikatan yang kuat dan stabil, kemungkinan karena komplementaritas antara molekul dan kantong reseptor. Keterlibatan ikatan hidrogen dan kontak hidrofobik dapat menjelaskan afinitas pengikatan tinggi yang diamati. l -Triptofan menunjukkan afinitas pengikatan sebesar -7,652 kkal/mol dan menonjol karena interaksi π–π yang unik dengan Phe404, yang menunjukkan peran kunci penumpukan aromatik dalam menstabilkan senyawa di dalam situs pengikatan (Gambar 1E ). Selain itu, interaksi ionik dengan Arg394 dan Glu353 semakin menstabilkan kompleks, memperkuat fleksibilitas l -triptofan dalam terlibat dengan berbagai jenis interaksi di dalam situs pengikatan. Ligand yang diko-kristalisasi (H3B-9224) dalam protein ini menunjukkan interaksi ikatan hidrogen yang penting dengan Glu353 dan Arg394, yang merupakan residu kunci di dalam situs aktif [ 137 ]. Interaksi ini memainkan peran penting dalam menstabilkan ligan dan memfasilitasi orientasi optimalnya untuk pengikatan yang efektif. Pola pengikatan yang serupa diamati dengan fitokimia yang diidentifikasi, termasuk ikatan hidrogen dengan residu penting ini. Kesamaan ini menunjukkan bahwa fitokimia meniru mekanisme pengikatan ligan yang dikristalkan bersama. Interaksi yang diamati menyoroti kompatibilitas struktural dan kimia fitokimia dengan situs pengikatan, memperkuat potensinya sebagai penghambat protein 6CHZ yang efektif.

GAMBAR 2
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Diagram interaksi pengikatan 3D dari senyawa fito (A) asam malat, (B) asam kafeat, (C) asam klorogenat, (D) kaempferol-3-glukuronida, (E) l -triptofan ke dalam situs aktif timidilat sintase manusia (PDB ID: 1HVY).
Studi docking molekuler dari fitokompon terpilih terhadap target protein (PDB ID: 1HVY) mengungkapkan berbagai afinitas pengikatan dan interaksi dengan residu kunci. Di antara senyawa yang diuji, asam malat menunjukkan afinitas pengikatan tertinggi dengan skor docking -6,848 kkal/mol. Senyawa ini menunjukkan berbagai interaksi, termasuk ikatan hidrogen dengan Tyr258, Ser216, dan Arg50, dan interaksi ionik dengan Arg176, Arg215, dan Arg50, yang menunjukkan pengikatan yang kuat dan stabil pada situs aktif (Gambar 2A ). Asam kafeat, dengan skor docking -6,228 kkal/mol, menunjukkan ikatan hidrogen dengan Asp218, Asn226, dan Arg215, serta interaksi ionik dengan Arg50, Arg175, dan Arg176. Selain itu, interaksi π–π diamati dengan Ala414, yang selanjutnya menstabilkan ikatannya dalam situs aktif (Gambar 2B ). Asam klorogenat memiliki afinitas ikatan yang lebih rendah (−5,228 kkal/mol), yang membentuk ikatan hidrogen tunggal dengan Lys107 (Gambar 2C ). Kaempferol-3-glukuronida, dengan skor docking sebesar −5,66 kkal/mol, berinteraksi melalui ikatan hidrogen dengan Lys107 dan Met309, yang menunjukkan kekuatan ikatan sedang (Gambar 2D ). l -Triptofan, yang menunjukkan afinitas ikatan terendah (−4,157 kkal/mol), membentuk ikatan hidrogen dengan Met309 dan interaksi ionik dengan Lys308 (Gambar 2E ). Meskipun kekuatan ikatannya relatif lebih lemah, interaksi ini menunjukkan potensinya untuk stabilisasi dalam situs aktif. Ligand raltitrexed yang dikristalkan bersama, inhibitor yang terkenal, berfungsi sebagai tolok ukur untuk mengevaluasi interaksi pengikatan fitokimia yang diuji. Raltitrexed menunjukkan interaksi kritis dalam situs aktif protein target, termasuk interaksi ionik dengan Lys308, yang memainkan peran penting dalam menstabilkan konformasi pengikatannya [ 138 ]. Lebih jauh lagi, ia membentuk ikatan hidrogen dengan Lys77, yang berkontribusi pada penjangkarannya dalam kantong pengikatan dan meningkatkan spesifisitasnya terhadap target. Selain itu, interaksi jembatan garam dengan Lys308 diamati, memperkuat stabilitas keseluruhan ligan dan kekuatan interaksi. Secara keseluruhan, hasil menunjukkan bahwa asam malat dan asam kafeat memiliki interaksi pengikatan terkuat dengan protein target, terutama melalui ikatan hidrogen dan interaksi ionik dengan residu kritis, menjadikannya kandidat yang menjanjikan untuk penyelidikan lebih lanjut.

2.7 Farmakokinetik dan Sifat Mirip Obat
Sebagai langkah awal dalam penelitian penemuan obat dan untuk memperkirakan wawasan tentang potensi penggunaannya sebagai agen terapeutik, fitokonstituen terpilih (Tabel 6 ) dalam MVRF diuji untuk sifat farmakokinetiknya berdasarkan profil penyerapan, distribusi, metabolisme, ekskresi, dan toksisitas (ADMET) [ 139-143 ]. Nilai prediksi permeabilitas Caco-2 menunjukkan penyerapan sedang hingga rendah. Diprediksi bahwa senyawa 2 , 3 , dan 5 akan menunjukkan penyerapan usus yang baik (pada manusia), dengan nilai melebihi 30%. Mengenai permeabilitas fitokonstituen terpilih melintasi kulit, semuanya menunjukkan permeabilitas rendah. Fraksi tak terikat, yang menggambarkan bagian ekstravasat obat bebas dalam plasma, berada dalam kisaran 0,28 dan 0,568, yang menunjukkan bahwa obat tersebut menunjukkan profil distribusi yang baik dalam plasma dan terutama berinteraksi dengan target farmakologis.

TABEL 6. Penilaian profil farmakokinetik fitokonstituen utama MVRF.

Volume distribusi (VDss) adalah ukuran luas distribusi obat. Nilai senyawa 3 dan 4 menunjukkan bahwa mereka akan didistribusikan dalam jaringan, sedangkan senyawa 1 dan 2 menunjukkan bahwa mereka akan didistribusikan dalam plasma. Mengenai permeabilitas membran sawar darah-otak (BBB), senyawa 3 dan 4 menunjukkan nilai logBB kurang dari -1, yang menunjukkan bahwa mereka diprediksi mengalami kesulitan melewati BBB. Sebaliknya, senyawa 1 , 2 , dan 5 menunjukkan kemampuan untuk melewati BBB hingga tingkat sedang. Dipostulatkan pula bahwa senyawa 2 dan 5 akan menembus sistem saraf pusat (SSP) dengan mudah. ​​Profil metabolik obat diprediksi menggunakan sitokrom P450, dengan dua subtipe utama yaitu enzim CYP2D6 dan CYP3A4. Nilai yang dihasilkan menunjukkan bahwa tidak ada fitokonstituen yang dipilih yang menunjukkan efek penghambatan pada isoform P450 mana pun. Kapasitas tubuh untuk menghilangkan obat ditentukan oleh klirens total, yang meliputi proses hepatik dan renal. Seperti yang diilustrasikan dalam Tabel 6 , temuan kami menunjukkan bahwa hanya senyawa 6 yang menunjukkan eliminasi efektif. Penilaian toksisitas juga dilakukan untuk fitokonstituen terpilih. Hasil toksisitas ditemukan menjanjikan, dengan tidak ada senyawa terpilih yang menunjukkan AMES, hepatotoksisitas, atau sensitisasi kulit.

2.8 Prediksi Target
Target molekuler potensial untuk fitokimia utama (asam klorogenat, asam kafeat, asam malat, l -triptofan, dan kaempferol-3-glukuronida) diprediksi dan hasilnya mengungkapkan bahwa mereka dikategorikan ke dalam beberapa kelas. Seperti yang diilustrasikan dalam Gambar 3 , kelas target dominan untuk asam malat adalah enzim (26,7%), untuk asam kafeat adalah liase (66,7%), untuk asam klorogenat adalah protease (33,3%), untuk kaempferol-3-glukuronida adalah enzim (26,7%) dan reseptor protein-coupled keluarga AG (26,7%), dan untuk l -triptofan adalah reseptor protein-coupled keluarga AG (80%).

GAMBAR 3
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Jenis target biologis yang kemungkinan dipengaruhi oleh fitokimia utama dalam MVRF.

3 Kesimpulan
Ekstrak yang dievaluasi menunjukkan potensi yang menjanjikan sebagai sumber senyawa antioksidan dan antikanker. Aktivitas antioksidan, seperti yang ditunjukkan oleh uji penangkal radikal DPPH • dan ABTS +• , menunjukkan toksisitas seluler yang signifikan terhadap lini sel MCF7 (payudara), HT29 (usus besar), dan SW480 (kolorektal). Pengamatan ini menunjukkan korelasi langsung antara efek biologis yang diamati dan keberadaan senyawa fenolik. Analisis UPLC-QTOF-MS/MS mengidentifikasi berbagai metabolit bioaktif, termasuk tiga asam organik, dua asam fenolik, tiga flavonol, dua flavon, satu flavanon, lima asam amino, satu asam empedu, dan satu saponin triterpena. Selain itu, senyawa lain juga diidentifikasi dan dianggap sebagai koadjuvan dalam aktivitas biologis yang diamati. Analisis in silico menguatkan temuan in vitro, dengan demikian memperkuat potensi terapeutik MVRF. Akan tetapi, agar hasil ini dapat diterapkan secara aman dalam klinis, penelitian in vivo dan uji klinis tambahan diperlukan untuk mengidentifikasi senyawa bioaktif yang bertanggung jawab atas efek yang diamati dan memvalidasi kemanjuran dan keamanannya pada manusia.

4 Bagian Eksperimen
4.1 Bahan Kimia dan Reagen
Pelet metanol, asam format (≥ 98%) dan natrium hidroksida anhidrat dengan kadar HPLC diperoleh dari Fisher Scientific (Inggris). Amonium format (dengan kadar spektrometer massa, 98% atau lebih) dan asetonitril dengan kadar HPLC diperoleh dari Sigma-Aldrich (Jerman). Air ultramurni untuk keperluan kromatografi disiapkan menggunakan sistem pemurnian (Millipore Milli-Q, AS). Bahan kimia dan reagen yang tersisa memiliki kadar analitis.

4.2 Pengumpulan dan Persiapan Ekstrak Tumbuhan
4.2.1 Koleksi Tanaman
Pada bulan April 2022, bagian udara MV dikumpulkan (Gambar 4 ). Tanaman dipanen dari Buljurashi (Provinsi Al-Baha) di Arab Saudi bagian selatan (koordinat 41,58′ LU dan 19,86′ BT, ketinggian 2450 m) pada tahap pembungaan. Bahan tanaman diautentikasi oleh ahli taksonomi, Dr. Haidar A. Mohamed dari Departemen Biologi, Fakultas Sains, Universitas Al-Baha. Basis data yang tersedia dikonsultasikan untuk tujuan memverifikasi nomenklatur [ 144 , 145 ]. Tanaman diarsipkan dengan herbarium spesimen voucher nomor BUH-112 di Departemen Farmakognosi, Fakultas Farmasi Klinik, Universitas Al-Baha, KSA.

GAMBAR 4
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Ilustrasi bagian udara Marrubium vulgare L.
4.2.2 Persiapan Ekstrak
Bagian udara MV (500 g) dikeringkan di lingkungan yang teduh, digiling, lalu diekstraksi berturut-turut pada suhu kamar dengan etanol dan air (8:2, 3 × 1,5 L), menghasilkan 14% MVCE. Residu mengalami fraksinasi, menghasilkan isolasi lima fraksi berbeda: petroleum eter (MVPF, 4,1 g), kloroform (MVCF, 12,9 g), etil asetat (MVEF, 1,3 g), dan fraksi residu berair (MVRF, 10,9 g).

4.3 Skrining Fitokimia, TPC, dan TFC
Skrining fitokimia kualitatif awal dilakukan untuk mengidentifikasi konstituen fitokimia dari ekstrak kasar bagian udara MV menggunakan protokol standar [ 146 ]. Fitokimia berikut menjadi sasaran analisis: triterpen, alkaloid, saponin, glikosida jantung, steroid, flavonoid, tanin, dan senyawa fenolik.

TPC ekstrak kasar (MVCE) diukur sesuai dengan metodologi yang ditetapkan oleh Pourmorad et al. [ 147 ] dan dinyatakan dalam mg GAE/g DW.

TFC juga ditentukan berdasarkan metode yang dijelaskan oleh Pourmorad et al. [ 147 ], dengan beberapa modifikasi, dan dinyatakan dalam mg RE/g DW.

4.4 Aktivitas Antioksidan
4.4.1 Aktivitas Penangkal Radikal DPPH • dan ABTS +•
Metode untuk menentukan aktivitas antioksidan berdasarkan radikal bebas DPPH • (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) dilakukan menurut prosedur yang sebelumnya dijelaskan oleh [ 148 ]. Teknik ini melibatkan reduksi radikal DPPH • dalam larutan metanol dengan adanya senyawa antioksidan, yang ditunjukkan dengan penurunan absorbansi pada 517 nm. Secara singkat, larutan DPPH • (2 mL, 0,1 mM) disiapkan dalam metanol dan dicampur dengan 1 mL berbagai konsentrasi ekstrak MV atau senyawa standar antioksidan (Trolox). Campuran diinkubasi pada suhu kamar, dalam gelap, selama 1 jam. Setelah periode ini, absorbansi diukur dalam spektrofotometer. Persentase penghambatan radikal DPPH • dihitung menggunakan Persamaan berikut ( 1 ).

Hasilnya dinyatakan dalam IC50 ( konsentrasi yang dibutuhkan untuk menghambat 50% DPPH • ), dihitung dengan penyesuaian linier dari konsentrasi yang diuji.

Metode untuk menentukan aktivitas antioksidan berdasarkan uji perubahan warna kation radikal ABTS •+ dilakukan menurut metode yang dijelaskan dalam literatur [ 149 ]. Secara singkat, radikal kation ABTS •+ dihasilkan dari reaksi larutan berair ABTS (7 mM) dengan kalium persulfat (2,45 mM) dan campuran tersebut disimpan dalam gelap pada suhu kamar selama 12–16 jam sebelum digunakan. Kation radikal ABTS •+ yang terbentuk diencerkan dalam etanol hingga absorbansi 0,700 ± 0,020 pada 734 nm. Aktivitas antioksidan dinilai dengan menambahkan 10 µL sampel atau standar antioksidan ke dalam 1 mL larutan ABTS •+ . Pengukuran absorbansi kemudian dilakukan setelah 30 menit pada suhu 30°C. Pelarut yang sesuai digunakan sebagai kontrol dalam setiap pengujian. Semua penentuan dilakukan dalam rangkap tiga. Persentase penghambatan radikal ABTS •+ dihitung menggunakan Persamaan ( 1 ) berikut. Hasilnya dinyatakan sebagai aktivitas antioksidan setara Trolox (TEAC), dihitung dalam kaitannya dengan kurva standar yang dibuat dengan berbagai konsentrasi Trolox dan IC50 .

4.5 Sitotoksisitas
4.5.1 Garis Sel
Penelitian ini menggunakan tiga lini sel kanker: MCF7 (adenokarsinoma payudara manusia), HT29, dan SW480 (adenokarsinoma kolorektal manusia). Selanjutnya, sel MRC5 (fibroblast paru janin manusia normal) diperoleh dari ATCC (AS). Ketiga sel kanker tersebut disubkultur dalam media RPMI-1640 sesuai dengan metodologi yang dijelaskan oleh Abdalla et al. [ 150 ].

4.5.2 Penentuan Sitotoksisitas
Sitotoksisitas dari enam ekstrak, bersama dengan DOX, dievaluasi menggunakan uji MTT, seperti yang dijelaskan sebelumnya [ 151 ].

4.6 Profil Fitokimia dengan Analisis UPLC-ESI-QTOF-MS/MS
Analisis UPLC-ESI-QTOF-MS/MS dilakukan menurut Mohammed et al. [ 72 ].

4.6.1 Persiapan Sampel
Larutan stok ekstrak dibuat menggunakan 50 mg ekstrak etanol air beku-kering, yang dilarutkan dalam 1000 µL campuran pelarut yang terdiri dari air, metanol, dan asetonitril (H 2 O:MeOH:ACN) dengan rasio 2:1:1. Larutan stok dibuat sepenuhnya larut dengan mengocok sampel dan melakukan ultrasonikasi pada 30 kHz selama 10 menit. Alikuot 20 µL larutan stok diencerkan sekali lagi dengan 1000 µL H 2 O:MeOH:ACN (2:1:1) dan disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 5 menit. Larutan yang dihasilkan kemudian disuntikkan untuk analisis pada konsentrasi 1 µg/mL. Demikian pula, analisis LC-MS dilakukan untuk sampel kosong dan sampel kontrol kualitas/standar internal (IS) untuk memastikan keandalan percobaan. Sampel diperkenalkan dalam mode positif dan negatif.

4.6.2 Instrumen dan Metode Akuisisi
Isolasi molekul kecil dilakukan menggunakan sistem ExionLC (AB Sciex, Framingham, MA, AS), yang dihubungkan ke autosampler, pra-kolom cakram filter in-line (0,5 µm × 3,0 mm, Phenomenex, Torrance, CA, AS), dan kolom Xbridge C 18 (3,5 µm, 2,1 × 50 mm) (Waters Corporation, Milford, MA, AS). Kolom dipertahankan pada suhu 40°C dan dioperasikan pada laju alir 300 µL/menit. Fase mobil terdiri dari Larutan A, yang merupakan 5 mM amonium format dalam 1% metanol, dengan pH disesuaikan menjadi 3,0 menggunakan asam format, dan Larutan B, yang merupakan asetonitril (100%) untuk mode positif. Larutan mode negatif (C) terdiri dari 5 mM amonium format dalam 1% metanol, dimodifikasi menjadi pH 8 dengan natrium hidroksida. Elusi gradien dilakukan sesuai dengan jadwal berikut: Fase awal proses elusi dilakukan selama 20 menit pada konsentrasi 10% B, diikuti oleh periode 5 menit pada 90% B. Selanjutnya, konsentrasi dikurangi menjadi 10% B selama 5 menit lagi, setelah itu proses dihentikan, dan kolom dibiarkan menjalani periode penyeimbangan pada 90% B.

Analisis MS dilakukan menggunakan sistem Triple TOF 5600+, yang dilengkapi dengan sumber Duo-Spray yang beroperasi dalam mode ESI (AB SCIEX, Concord, Ontario, Kanada). Tegangan kapiler penyemprot dan potensi declustering ditetapkan pada 4500 dan 80 eV dalam mode positif dan -4500 dan -80 V dalam mode negatif. Suhu sumber ditetapkan pada 600°C, gas tirai pada 25 psi, dan Gas 1 dan Gas 2 pada 40 psi. Energi tumbukan ditetapkan pada 35 V (mode positif) dan -35 V (mode negatif), dengan sebaran CE 20 V dan toleransi ion 10 ppm. TripleTOF 5600+ dioperasikan dengan protokol akuisisi bergantung informasi (IDA). Batch untuk pengumpulan data MS dan MS/MS dibuat dengan menggunakan Analyst-TF 1.7.1. Teknik IDA digunakan untuk mengumpulkan data MS dan MS/MS pemindaian penuh secara bersamaan. Metodologi ini memerlukan akuisisi spektrum survei resolusi tinggi yang mencakup rentang massa 50–1100 m / z , dengan spektrometer massa digunakan dalam konfigurasi yang disebutkan di atas [ 152 ].

4.6.3 Pengolahan Data LC-MS
Perangkat lunak sumber terbuka MS-DIAL 3.70 [ 153 ] digunakan untuk analisis komprehensif molekul kecil tanpa adanya pengambilan sampel yang ditargetkan. Basis data positif ReSpect (2737 rekaman) dan basis data negatif ReSpect (1573 rekaman) dipilih sebagai basis data referensi berdasarkan metode akuisisi. Pengaturan pencarian ditetapkan dengan toleransi massa MS1 dan MS2 pada 0,01 dan 0,05 Da untuk akuisisi data, dengan tinggi puncak minimum 100 amplitudo, lebar irisan massa 0,05 Da, tingkat penghalusan dua pemindaian, dan lebar puncak minimum enam pemindaian. Untuk identifikasi, toleransi MS1 dan MS2 ditetapkan sebagai berikut: Toleransi penyelarasan ditetapkan pada 0,2 Da, sedangkan toleransi waktu retensi adalah 0,05 menit, dan toleransi MS1 ditetapkan pada 0,25 Da. Hasil MS-DIAL digunakan untuk memproses ulang data dalam PeakView 2.2 dengan paket MasterView 1.1 (AB SCIEX) untuk tujuan mengonfirmasi fitur (puncak) dari TIC sesuai dengan kriteria berikut: fitur selaras dengan rasio sinyal terhadap derau melebihi 5 dan intensitas sampel relatif terhadap blanko melebihi 5.

4.7 Docking Molekuler In Silico
Struktur fitokompon diperoleh dari PubChem dan diproses menggunakan Schrödinger’s LigPrep, yang mengoptimalkan geometri ligan dan menghasilkan struktur 3D berenergi rendah dengan kiralitas yang akurat. Docking molekuler [ 154 ] dari fitokompon dilakukan menggunakan Schrödinger’s Glide ke situs aktif ERα (PDB ID: 6CHZ) dan human TS (PDB ID: 1HVY). Struktur kristal protein diproses terlebih dahulu sebagai berikut [ 155 , 156 ]. Akhirnya, docking dilakukan di Glide menggunakan metode presisi standar (SP) [ 157 ].

4.8 Studi Farmakokinetik
Studi molekuler in silico dari fitokonstituen terpilih diselidiki untuk memprediksi karakteristik farmakokinetik ( https://biosig.lab.uq.edu.au/pkcsm/ ) dan prediksi target ( http://www.swisstargetprediction.ch/ ).

4.9 Analisis Statistik
Semua pengujian dilakukan dalam rangkap tiga, dan data dinyatakan sebagai rata-rata ± simpangan baku (SD). Perbedaan antar data dianalisis menggunakan analisis varians satu arah Tukey (ANOVA) dengan perangkat lunak SPSS (versi 22.0).