Prediksi Toksisitas Perkembangan dengan Bantuan Morfometri Menggunakan Model Embrio Berbasis Sel Punca dalam Sumur Mikro

Abstrak
Kelainan bawaan menyebabkan ≈3% dari cacat janin dan kematian dini di Eropa, sering kali karena paparan racun pada ibu. Untuk mengurangi tantangan etika dan logistik dari penelitian hewan, model berbasis sel punca sedang dieksplorasi yang menawarkan pembacaan yang dapat diskalakan pada berbagai tahap embriogenesis. Namun, sebagian besar model in vitro saat ini terbatas dalam hal kompleksitas, throughput, kompatibilitas otomatisasi, atau pembacaan spasiotemporal waktu nyata. Dalam penelitian ini, platform otomatis yang dapat diskalakan yang mampu mencitrakan dan mengukur fitur morfologi seperti bentuk, ukuran, tekstur, dan intensitas penanda disajikan. Menggunakan platform penyaringan mikrowell, XEn/EpiCs, model embrio tahap peri-implantasi yang meniru pengembangan bersama eXtraembryonic Endoderm dan Epiblast, dibuat dengan kuat dan digunakan untuk menyaring pustaka yang berisi 38 senyawa yang dilaporkan. Tidak seperti uji sitotoksisitas konvensional, pendekatan ini juga mengevaluasi perubahan morfologi yang mengganggu perkembangan, yang disebut “morfotoksisitas”, sehingga menawarkan wawasan pelengkap yang dapat meningkatkan prediksi toksisitas perkembangan di seluruh jenis sel. Studi percontohan ini menunjukkan bahwa dosis tinggi senyawa seperti asam retinoat, kafein, ampiron, dan deksametason, secara signifikan mengganggu perkembangan XEn/EpiC, yang menyebabkan efek morfotoksik dengan atau tanpa memengaruhi kelangsungan hidup sel. Bersama-sama, studi ini menyoroti pentingnya melengkapi penilaian sitotoksisitas dengan pembacaan morfotoksisitas, yang menekankan potensinya untuk meningkatkan evaluasi risiko teratogenik dalam uji toksisitas.

1 Pendahuluan
Toksisitas perkembangan dan reproduksi (DART) mengacu pada induksi cacat fisik atau fungsional pada embrio atau janin, yang memengaruhi perkembangan mereka atau menyebabkan infertilitas karena paparan teratogen. [ 1 ] Teratogen dapat berupa bahan kimia dan biologi sintetis atau alami, yang setelah terpapar pada ibu, menyebabkan malformasi serius pada embrio atau janin. [ 2 ] Hal ini biasanya dimanifestasikan oleh keterlambatan perkembangan, kelainan struktural, atau kematian yang disebabkan oleh konsumsi langsung atau paparan tidak langsung terhadap senyawa beracun melalui lingkungan. [ 3 ] Teratogen yang paling umum diketahui termasuk alkohol, obat-obatan rekreasional, dan pengobatan, serta pengganggu endokrin, seperti bisphenol-A (BPA), yang ditemukan di sebagian besar plastik. [ 4 ] Penting untuk dicatat bahwa zat apa pun dapat bersifat teratogenik tergantung pada konsentrasi, waktu, dan durasi paparan zat beracun tersebut pada embrio yang sedang berkembang. [ 5 ] Pemahaman mengenai implikasi zat kimia yang melewati penghalang plasenta dan mencapai embrio atau janin telah mendorong penelitian menuju pemahaman yang lebih baik mengenai dampaknya terhadap kesehatan reproduksi dan perkembangan secara keseluruhan. [ 6 ]

Obat-obatan farmasi yang ditujukan untuk digunakan pada wanita hamil harus disaring untuk mengetahui teratogenisitasnya sebelum dipasarkan guna memastikan keamanan janin yang sedang berkembang. Hingga saat ini, penyaringan ini dilakukan pada model hewan, paling umum pada model hewan pengerat (tikus dan mencit), yang umumnya mengorbankan ribuan embrio untuk mendapatkan persetujuan klinis terhadap suatu obat, yang menekankan perlunya model alternatif untuk memprediksi efek samping. Baru-baru ini, promosi penggunaan alternatif model hewan untuk pengujian toksisitas dan penggunaan hewan yang etis berdasarkan 3R—Replace, Refine, dan Reduce dalam penilaian DART, telah memberikan fokus tambahan pada sistem mikrofisiologis yang menyediakan strategi potensial untuk mencapai hal ini. [ 7 ]

Calon teratogen diteliti pada hewan untuk mengetahui potensinya menyebabkan kelainan perkembangan. Akan tetapi, skrining yang luas dan tidak bias dilarang karena jumlah hewan yang dibutuhkan sangat banyak. Pengenalan model baru untuk penilaian DART memerlukan validasi menyeluruh terhadap efek spesifik senyawa, dengan fokus pada waktu, dosis, dan durasi paparan yang menyebabkan toksisitas, seperti yang diperkenalkan oleh Daston dan rekan-rekannya. [ 8 ]

Model embrio berbasis sel punca telah muncul sebagai alat yang ampuh untuk mempelajari embriogenesis mamalia awal. [ 9 ] Kemampuannya untuk dihasilkan dalam cara yang dapat diskalakan dan direproduksi memposisikannya sebagai strategi yang efektif untuk digunakan untuk pengujian DART berthroughput tinggi. Model-model ini, yang dihasilkan dari populasi sel pluripoten dalam lingkungan mikro yang terkendali, memiliki kemampuan untuk merangkum beberapa fitur perkembangan embrio alami dengan kuat. Dengan memanfaatkan sifat-sifat ini, telah ada berbagai jenis model embrio berbasis sel punca yang digunakan dalam skrining DART yang berfokus pada berbagai tahap dan fitur model embrio pada sel tikus dan manusia. [ 10 ] Pekerjaan pada model embrio berbasis sel punca tikus sangat berharga untuk membandingkan dan memvalidasi data in vitro dengan penelitian pada hewan pengerat untuk menyederhanakan aplikasi potensial model-model ini. [ 11 ]

Sejumlah besar pembacaan dalam uji DART in vitro umumnya berfokus pada beberapa indikator toksisitas perkembangan dengan menilai kematian sel dan sitotoksisitas menggunakan uji kalorimetri, fluorometri, atau luminesensi. Ada juga jenis pembacaan lain berdasarkan efek diferensiasi atau proliferasi spesifik sel setelah terpapar racun tertentu. [ 12 ] Namun, perkembangan embrio lebih kompleks, dan uji in vitro 2D yang lebih sederhana tidak memperhitungkan semua risiko potensial untuk efek morfogenetik multiseluler. Keterbatasannya ada pada analisis jaringan terintegrasi, yang saat ini dilakukan pada model hewan, sehingga lebih menekankan pada model in vitro untuk juga memberikan informasi tentang efek senyawa pada morfogenesis dan organisasi spasiotemporal berbagai jaringan. Dengan memanfaatkan model embrio berbasis sel punca, kita berada di ambang era baru di mana pembacaan seperti itu menjadi layak tidak hanya dalam model in vivo tetapi juga dalam model in vitro. Namun, kultur in vitro 3D yang lebih kompleks sering kali terbatas dalam throughput-nya, yang pada gilirannya membatasi penerapannya pada penyaringan di ranah klinis. Studi semacam itu akan memerlukan model yang dapat diskalakan dan direproduksi dengan tingkat kompleksitas multijaringan/multiorgan yang dapat memungkinkan pembacaan seluler dan morfologi untuk menguji pustaka senyawa yang besar. Di sini, kami mengatasi kedua masalah tersebut melalui platform baru kami yang dapat mengekstrak informasi morfologi dari gambar model in vitro 3D dengan cara throughput tinggi.

Fenotipe berbasis pembelajaran mesin dari sistem model embrio dapat membantu menjelaskan varians yang terjadi secara alami dan perubahan yang diinduksi dalam perkembangan embrio. [ 13 ] Yang penting, fenotipe otomatis dari perkembangan multi-jaringan memungkinkan peningkatan throughput eksperimental dan dengan demikian memungkinkan pengklasifikasian penggerak molekuler dan genetik berdasarkan cacat fenotipiknya. [ 14 ] Kami baru-baru ini menunjukkan pembentukan model embrio berbasis sel induk in vitro 3D yang merangkum perkembangan bersama epiblast (Epi) dan endoderm ekstraembrionik (XEn), yang dinamai XEn/EpiCs, yang meniru embrio tahap peri-implantasi [ 15 ] yang dapat dihasilkan dalam pengaturan mikrowell throughput tinggi, [ 16 ] memfasilitasi pencitraan in situ, dan mengotomatiskan analisis statistik. Di sini, kami menilai dampak pustaka teratogenik khusus yang terdiri dari teratogen yang diketahui dan potensial (Tabel S1 , Informasi Pendukung) pada morfogenesis XEn/EpiCs pada konsentrasi yang berbeda. Kami mulai dengan menyaring efek teratogenik pada model embrio menggunakan tiga konsentrasi senyawa, merujuk pada sumber yang tersedia dari literatur untuk mengevaluasi kisaran toksisitas yang diberikan senyawa yang berbeda selama perkembangan.

Kuantifikasi fitur berbasis morfologi, atau morfometrik, memberikan wawasan berharga tentang bagaimana gangguan eksternal memengaruhi pertumbuhan terpadu dan terkoordinasi berbagai jenis jaringan. Pendekatan ini sangat penting untuk memprediksi toksisitas perkembangan karena menawarkan pemahaman yang lebih bernuansa tentang efek teratogenik di luar ukuran sitotoksisitas standar. Dalam studi ini, kami menggunakan pendekatan berbasis morfologi untuk mengidentifikasi senyawa yang menginduksi perubahan morfologi yang signifikan pada pembentukan XEn/EpiCs dan memengaruhi perkembangannya, suatu efek yang kami sebut sebagai morfotoksisitas. Kami mengusulkan bahwa melengkapi uji sitotoksisitas tradisional dengan pembacaan morfotoksisitas menyajikan strategi yang lebih komprehensif untuk penilaian toksikogenomik dan toksisitas perkembangan dan reproduksi (DART).

2 Hasil
2.1 Merancang Perpustakaan Teratogen yang Diketahui dan Potensial
Untuk membuat pustaka senyawa penyaringan kami, kami mulai dengan senyawa yang telah diklasifikasikan oleh Badan Pengawas Obat dan Makanan (FDA) sebagai senyawa yang menyebabkan efek teratogenik pada perkembangan embrio/janin. Senyawa atau obat dikelompokkan ke dalam lima Kategori FDA yang berbeda, yaitu A, B, C, D, dan X, [ 17 ] yang mencerminkan gradien toksisitas yang ditentukan melalui uji validasi pada organisme model, yang berkisar dari efek minimal atau tidak ada (Kategori A) hingga malformasi parah atau kematian (Kategori X) ( Tabel 1 ). Pustaka akhir yang dipilih dalam studi ini mencakup 28 senyawa (Tabel S1 , Informasi Pendukung) dalam berbagai kategori teratogenisitas, seperti vitamin (asam askorbat dan asam retinoat), antihistamin (propafenon hidroklorida), antibiotik (penisilin dan isoniazid), NSAID (ibuprofen), pestisida/disinfektan (2,4,6-triiodofenol dan karbamazepin), obat kemoterapi (5-fluorourasil dan busulfan), dan teratogen lain yang diketahui bagi manusia (thalidomide).

Tabel 1. Pemeriksaan FDA terhadap pelabelan kehamilan. Peraturan tersebut mengharuskan setiap produk diklasifikasikan ke dalam salah satu dari lima kategori kehamilan (A, B, C, D, atau X) berdasarkan risiko efek samping pada reproduksi dan perkembangan atau, untuk kategori tertentu, berdasarkan risiko tersebut yang ditimbang terhadap potensi manfaatnya. [ 17 ]

Konsentrasi yang digunakan dalam penyaringan dipilih berdasarkan temuan literatur tentang efek teratogen pada perkembangan embrio tikus, serta konsentrasi yang digunakan untuk pengujian dengan model embrio in vitro. Untuk senyawa yang tidak memiliki konsentrasi referensi yang diuji pada embrio tikus atau model in vitro, data yang diketahui dari organisme model lain dalam volume per kg dihitung untuk memperkirakan kisaran perkiraan untuk penyaringan.

Penyaringan dilakukan dalam dua tingkat, yang langkah pertama melibatkan identifikasi rentang konsentrasi di mana senyawa tersebut menyebabkan efek pada perkembangan XEn/EpiCs. Langkah kedua dalam penyaringan melibatkan perluasan rentang menjadi lima konsentrasi untuk menemukan dosis minimum dan maksimum senyawa untuk memberikan pengurangan signifikan dalam pembentukan XEn/EpiCs menggunakan deteksi morfologi otomatis. Setiap senyawa dalam percobaan percontohan ini diuji pada tiga replikasi independen.

2.2 Penyaringan Tiga Konsentrasi Teratogen untuk Menilai Tingkat Toksisitas Perkembangan pada XEn/EpiCs
Untuk memulai pembentukan XEn/EpiCs dalam susunan microwell, sel punca embrionik tikus (sel mES) disemai ke dalam pelat penyaringan 96-well yang berisi susunan microwell yang dibentuk secara termal berdiameter 300 µm, pada kepadatan 18-24 sel per microwell. Selama 24 jam pertama, sel-sel tersebut diekspos ke dalam medium induksi yang ditentukan secara kimia untuk memungkinkan spesifikasi epiblast (Epi) dan endoderm ekstraembrionik (XEn) ( Gambar 1a ). Setelah 24 jam, medium induksi diganti dengan medium basal tanpa penambahan serum atau molekul pensinyalan. Dari 48 hingga 72 jam, struktur tersebut diekspos ke senyawa perlakuan pada tiga konsentrasi, dengan kondisi kontrol diperlakukan dengan 0,1% DMSO atau air untuk memperhitungkan pelarut dalam semua kondisi perlakuan (Gambar 1a ). XEn/EpiCs berkembang sepenuhnya pada 120 jam (Gambar 1b ), yang merupakan titik akhir percobaan untuk melakukan berbagai validasi kualitatif dan kuantitatif.

Gambar 1
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Penyaringan tiga konsentrasi teratogen untuk mengkaji tingkat toksisitas perkembangan pada XEn/EpiCs: a) skema protokol untuk pembentukan XEn/EpiCs di dalam sumur mikro, waktu penambahan teratogen, dan hasil pembacaan untuk mengkaji toksisitas perkembangan yaitu uji morfometrik dan sitotoksisitas, seperti uji ATP dan pewarnaan antibodi Caspase 3/7. b) Gambar montase fluoresensi sumur dengan XEn/EpiCs; saluran masuk: XEn/EpiC yang diperbesar dengan Epi (Hoechst), XEn (Hoechst+ Gata6:mVenus reporter), dan PAC (Phalloidin) (Tabel 03). c) Klasifikasi berbagai fenotipe berdasarkan garis waktu perkembangan yang mereka wakili dan jaringan yang mereka bentuk dan atur. d) Alur kerja analisis citra otomatis untuk memperoleh morfometrik XEn/EpiC, yang digunakan untuk menjalankan algoritma pembelajaran mesin terbimbing untuk mengukur hasil berbagai fenotipe yang diamati dalam citra. e) Persentase hasil dari lima fenotipe yang diamati setelah paparan senyawa nonteratogenik (legenda dalam [c]). f) Persentase hasil dari lima fenotipe yang diamati setelah paparan senyawa teratogenik. Tanda bintang menunjukkan perubahan signifikan secara statistik dalam persentase hasil berbagai varian XEn/EpiC. g,h) Pengukuran otomatis luas XEn/EpiC setelah paparan senyawa nonteratogenik dan teratogenik, masing-masing; setiap titik menunjukkan satu XEn/EpiC. Data adalah mean ± sd yang diperoleh dari n = 3 sumur, dengan setiap sumur berisi ≈ 165 struktur. Semua pengujian hipotesis statistik dilakukan dengan menggunakan uji Dunnett; ∗ melambangkan P ≤ 0,05, ∗∗ melambangkan P < 0,01, ∗∗∗ melambangkan P < 0,001, dan ∗∗∗∗ melambangkan P < 0,0001 (ANOVA satu arah dengan uji pasca Dunnett).
Bahasa Indonesia: Dalam pekerjaan sebelumnya, kami mengembangkan jalur analisis gambar otomatis menggunakan perangkat lunak CellProfiler untuk mengidentifikasi struktur yang diamati berdasarkan morfometrik, seperti profil area, bentuk, dan intensitas; dan melakukan pembelajaran mesin terawasi menggunakan CellProfiler Analyst untuk mengklasifikasikan beragam morfologi yang diamati dalam model embrio berbasis sel punca kami dan untuk mengukur parameter morfometrik utama. [ 14 ] Sistem ini memungkinkan kami untuk secara sistematis mengevaluasi pustaka teratogen dan mengkategorikan efeknya ke dalam empat kelompok utama: i) senyawa yang menyebabkan efek tergantung dosis (gradien) (Gambar 1e,f ), ii) senyawa yang mengganggu perkembangan melalui perubahan morfologi (morfotoksik) ( Gambar 2a,b ), iii) senyawa yang tidak menyebabkan efek signifikan pada perkembangan XEn/EpiCs (Gambar 2c ), dan iv) senyawa yang menginduksi sitotoksisitas dan morfotoksisitas tinggi (Gambar 2d,e ). Efisiensi pembentukan (hasil) untuk setiap jenis morfologi dinilai dan dibandingkan antara kondisi (perlakuan dan kontrol) untuk mengidentifikasi efek potensial pada peristiwa kunci morfogenetik berturut-turut selama perkembangan. Analisis diagram fase multiparametrik yang dilakukan pada hasil XEn/EpiCs versus area XEn/EpiCs karena paparan senyawa ditunjukkan pada Gambar S1 , Informasi Pendukung. Senyawa yang berbeda dikelompokkan berdasarkan efeknya masing-masing diplot pada Gambar S2 dan S3 , Informasi Pendukung.

Gambar 2
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Efek penting lain dari senyawa pada perkembangan XEn/EpiCs: a) Persentase hasil dari lima fenotipe yang diamati untuk senyawa yang memengaruhi perkembangan XEn/EpiCs. b) Gambar montase fluoresensi sumur dengan struktur yang diperoleh setelah perlakuan asam retinoat pada 0,4 nm , 33 nm , dan 100 nm . (Sisipan) sumur yang diperbesar yang menunjukkan morfologi struktur yang diamati dalam setiap kondisi perlakuan. c) Persentase hasil dari lima fenotipe yang diamati untuk senyawa yang tidak menyebabkan efek signifikan pada hasil pembentukan XEn/EpiCs. d) Persentase hasil dari lima fenotipe yang diamati untuk senyawa yang menunjukkan efek yang sangat toksik. e) Gambar montase fluoresensi sumur dengan struktur yang diperoleh setelah perlakuan Busulfan pada 2,03 µm , 40,6 µm , dan 255,8 µm . Gambar dipercerah hanya untuk tujuan tampilan. Gambar mentah digunakan untuk analisis otomatis. Data adalah mean ± sd yang diperoleh dari n = 3 sumur, dengan setiap sumur berisi ≈ 165 struktur. Skala batang: 100 µm; Semua pengujian hipotesis statistik dilakukan menggunakan uji Dunnett; ∗ mewakili P ≤ 0,05, ∗∗ mewakili P < 0,01, ∗∗∗ mewakili P < 0,001, dan ∗∗∗∗ mewakili P < 0,0001 (ANOVA satu arah dengan uji pasca Dunnett).
Beberapa senyawa yang tidak bersifat teratogenik (seperti asam askorbat, penisilin, indapamida, dan tiamin) menunjukkan sedikit tetapi signifikan pengurangan dalam efisiensi pembentukan XEn/EpiCs pada dosis tertinggi (Gambar 1e ); sementara, beberapa senyawa yang diketahui bersifat teratogenik (seperti asam valproat, deksametason, bosentan, dan karbamazepin) menunjukkan sedikit penurunan dalam rasio XEn/EpiCs terhadap morfologi lain (Gambar 1f ), bersama-sama menunjukkan efek gradien (tergantung dosis). Perubahan signifikan (ditunjukkan oleh tanda bintang pada gambar) menunjukkan perubahan signifikan secara statistik dalam hasil khususnya dari kelas morfologi XEn/EpiC.

Misalnya, yield% dari XEn/EpiCs yang terpapar penisilin G pada 63 µ m (rendah), 1 mm ( sedang), dan 2 mm ( tinggi) masing-masing adalah 54% ( p ≤ 0,05), 52% ( p < 0,01), dan 49% ( p < 0,0001), dibandingkan dengan 72% pada kontrol (Gambar 1d ). Sementara itu, rasio struktur XEn/Epi yang tidak terpolarisasi meningkat dari 4% pada dosis rendah dan sedang menjadi 10% pada dosis tinggi (Gambar 1e ). Tren serupa diamati untuk pengobatan dosis tinggi Tiamin (Gambar 1e ). Sepanjang garis yang sama, pengurangan hasil XEn/EpiCs karena asam askorbat disertai dengan pengurangan hasil roset XEn/Epi dari 18% pada dosis sedang menjadi 12% pada dosis tinggi. Hal ini diimbangi dengan peningkatan hasil XEn/Epi non-terpolarisasi dari 2% dan 5% pada dosis rendah dan sedang, masing-masing, menjadi 18% pada dosis tinggi (Gambar 1e ). Telah ditunjukkan dari beberapa penelitian lain bahwa serangkaian kejadian yang terkontrol dengan baik di epiblas, yaitu transportasi cairan vektor, pelepasan vesikel sitoplasma ke ruang antar sel, adhesi yang dimediasi integrin, dan masuknya air ke pusat epiblas, memfasilitasi perluasan lumen. [ 18 ] Pengamatan peningkatan rasio struktur XEn/Epi non-terpolarisasi dalam penelitian kami berpotensi menunjukkan efek senyawa pada polarisasi epiblas dan lumenogenesis.

Demikian pula, %XEn/EpiCs yang diobati dengan deksametason pada konsentrasi 10 nm , 1 µm , dan 100 µm berkurang secara signifikan masing-masing sebesar 60%, 58% ( p ≤ 0,05), dan 55% ( p < 0,01) (Gambar 1e ). Dosis deksametason yang tinggi juga menunjukkan peningkatan rasio XEn amorf sebesar 6% dibandingkan dengan 2% pada dosis yang lebih rendah, dan struktur mirip EB sebesar 18% dibandingkan dengan 14% pada dosis yang lebih rendah (Gambar 1f ). Tren ini juga diamati dalam pengobatan dengan bosentan dan karbamazepin, yang keduanya telah terbukti menginduksi teratogenisitas tergantung dosis pada sel punca pluripoten berpola mikro manusia in vitro oleh Xing, J., et al., 2017. [ 10 ] Senyawa lain di perpustakaan yang menunjukkan efek yang lebih ringan ditunjukkan pada Gambar S4 , Informasi Pendukung.

Kuantifikasi lebih lanjut dari keseluruhan area XEn/EpiCs yang terpapar pada kondisi perlakuan yang berbeda tidak menunjukkan perubahan signifikan dalam ukuran (Gambar 1g,h ) dengan pengecualian untuk perlakuan dengan asam valproat 4 µ m , yang menunjukkan pengurangan signifikan dalam ukuran dengan 5000 µm 2 ( p < 0,0001) dibandingkan dengan 7000 µm 2 pada kontrol (Gambar 1h ).

Secara keseluruhan, empat dari sepuluh senyawa dari kelas non-teratogenik, yaitu asam askorbat, penisilin G, indapamida, dan tiamin, menunjukkan efek yang bergantung pada dosis pada dosis yang lebih tinggi, tanpa perubahan signifikan dalam ukuran XEn/EpiCs. Senyawa yang tersisa dari kelas non-teratogenik menunjukkan efek yang lebih jelas, yang dibahas di bagian berikutnya. Ini menunjukkan bahwa senyawa pada dosis yang umum terpapar, sejalan dengan temuan sebelumnya dari uji toksikologi standar, tampaknya tidak memengaruhi viabilitas sel (seperti yang terlihat dari ukuran XEn/EpiCs) atau morfogenesis, tetapi hanya sedikit memengaruhi efisiensi struktur embrionik untuk maju dalam perkembangan. Bersama-sama, hasil ini menunjukkan perspektif baru terhadap temuan yang diketahui untuk beberapa senyawa.

2.3 Efek Lain yang Menonjol dari Senyawa pada Perkembangan XEn/EpiCs
Dalam studi yang sama, senyawa yang umum digunakan, seperti asam retinoat all-trans (turunan metabolik dari vitamin A), kafein, dan aspirin, berdampak lebih parah pada pembentukan XEn/EpiCs saat terpapar dari 48 hingga 72 jam kultur. Dengan peningkatan dosis, senyawa ini menunjukkan peningkatan morfotoksisitas (efek morfologi yang memengaruhi perkembangan), terbukti dari hasil yang lebih tinggi dari morfologi XEn/EpiC yang kurang berkembang. Misalnya, perlakuan dengan kafein, asam retinoat, dan aspirin menyebabkan hasil yang lebih tinggi dari roset XEn/Epi; asam retinoat, etretinat, dan isotretinoin menyebabkan hasil yang lebih tinggi dari struktur XEn/Epi non-terpolarisasi; asam retinoat dan aspirin menyebabkan hasil yang lebih tinggi dari struktur seperti EB; dan etretinat, dan isotretinoin menyebabkan hasil yang lebih tinggi dari struktur XEn amorf (Gambar 2a,b ). Paparan asam retinoat pada dosis 0,4 nm ( rendah), 33 nm ( sedang), dan 100 nm ( tinggi), menunjukkan tren penurunan tajam dalam hasil XEn/EpiCs (Gambar 2b ) dengan 58%, 43% ( p ≤ 0,05), dan 28% ( p < 0,0001), masing-masing, dibandingkan dengan 72% pada kontrol (Gambar 2a ). Sementara itu, hasil XEn/Epi non-terpolarisasi meningkat secara signifikan, dengan 14% pada dosis sedang dan tinggi dibandingkan dengan 4% pada kontrol (Gambar 2a,b ). Demikian pula, paparan kafein menunjukkan pengurangan hasil XEn/EpiCs antara tiga dosis dari dosis rendah ke dosis tinggi dengan 48%, 50%, dan 52% ( p ≤ 0,05), masing-masing, dibandingkan dengan 72% pada kontrol (Gambar 2a ). Turunan retinoid sintetis, seperti etretinat dan isotretinoin, juga menunjukkan efek yang bergantung pada dosis pada pembentukan XEn/EpiC, yang secara signifikan mengurangi hasil dan menampilkan rasio yang lebih tinggi dari tahap XEn/EpiC sebelumnya. Khususnya, isotretinoin 332,8 µ m menyebabkan rasio yang lebih tinggi dari fenotipe XEn/Epi non-terpolarisasi dan XEn Amorf. Hal ini dapat disebabkan oleh polarisasi Epi yang gagal atau tertunda, epitelisasi XEn, dan pembentukan PAC (Gambar 2a ).

Senyawa, seperti talidomid, asam folat, difenhidramin, dan ibuprofen, menunjukkan hasil XEn/EpiCs yang sama seperti kontrol tanpa efek signifikan pada morfologi (Gambar 2c ). Misalnya, perlakuan dengan asam folat pada dosis 147,26 µ ​​m (rendah), 2,26 mm ( sedang), dan 9,06 mm ( tinggi) menunjukkan hasil XEn/EpiC masing-masing sebesar 60%, 58%, dan 68% dibandingkan dengan 72% pada kontrol (Gambar 2c ). Namun, senyawa teratogenik yang diketahui, talidomid, tidak menyebabkan pengurangan signifikan pada hasil XEn/EpiCs; sebaliknya, peningkatan yang sedikit tetapi tidak signifikan terlihat pada dosis tertinggi 100 µ m (62,63%) dibandingkan dengan 0,4 µ m (58,64%) (Gambar 2c ). Pengamatan ini harus dikaitkan dengan mekanisme kerja thalidomide yang diketahui pada tahap embriogenesis selanjutnya; sementara, XEn/EpiCs merupakan tahap peri-implantasi. Lebih jauh, pengamatan ini harus dikonfirmasi menggunakan dosis senyawa yang lebih tinggi untuk mengidentifikasi dosis terendah yang memengaruhi perkembangan XEn/EpiC. Dengan menggabungkan pengamatan ini, kami mengamati bahwa senyawa ini tidak memiliki efek merugikan pada perkembangan XEn/EpiCs untuk konsentrasi yang diuji di sini.

Senyawa 5-fluorouracil dan busulfan, yang merupakan obat kemoterapi, menunjukkan toksisitas perkembangan yang lebih tinggi dengan meningkatnya dosis (Gambar 2d ). Perlakuan dengan 5-fluorouracil pada dosis 768,75 nm ( rendah), 76,875 nm ( sedang), dan 768,75 µ m (tinggi) menunjukkan pengurangan yang nyata dalam hasil XEn/EpiCs dengan masing-masing 55%, 20%, dan 0% (Gambar 2d ). Rasio struktur XEn/Epi non-terpolarisasi lebih tinggi ketika terpapar dosis 76,875 nm ( sedang) dengan 32% dibandingkan dengan 4% pada kontrol. Juga diamati bahwa dosis sedang dan tinggi 5-fluorouracil menginduksi sitotoksisitas dalam kultur dengan kematian sel sebesar 36,6% dan 98,58%, yang terlihat dari pengurangan total dalam ukuran dan disintegrasi struktur XEn/EpiC (Gambar 2d ). Dalam kasus serupa, gambar montase fluoresensi struktur pada perlakuan busulfan menunjukkan kematian sel sebesar 87,4% pada dosis tertinggi dan penghentian perkembangan dengan 12,63% struktur membentuk varian XEn/EpiC sebelumnya, yang memengaruhi polarisasi dan ekspansi XEn dan Epi (Gambar 2e ). Hal ini dapat dijelaskan oleh mekanisme kerja senyawa-senyawa ini dari studi in vivo dan in vitro, yang dengannya mereka telah terbukti menginduksi penangkapan siklus sel dan apoptosis. [ 19 ] Pengamatan ini menunjukkan bahwa senyawa-senyawa seperti 5-fluorouracil dan busulfan bersifat sitotoksik serta morfotoksik pada dosis tinggi (Gambar 2d ).

Secara keseluruhan, kami mengamati bahwa senyawa-senyawa, seperti asam retinoat, etretinat, isotretinoin, dan aspirin, memengaruhi perkembangan XEn/EpiCs pada dosis yang lebih tinggi, sehingga menghasilkan hasil roset XEn/Epi atau XEn/Epi non-polarized yang lebih tinggi. Selain itu, pengobatan dengan kafein memengaruhi perkembangan XEn/EpiCs pada semua dosis. Dengan demikian, senyawa-senyawa ini memberikan efek morfotoksik pada perkembangan XEn/EpiCs tanpa memengaruhi ukurannya. Selain itu, kami juga menemukan bahwa beberapa obat kemoterapi atau obat yang menginduksi apoptosis, seperti busulfan dan 5-fluorouracil, menyebabkan penghentian perkembangan pada dosis tinggi.

Pendekatan ini menyoroti mekanisme gangguan perkembangan yang rumit oleh senyawa tertentu, yang menekankan pentingnya penilaian morfologi dalam studi toksisitas. Perlu dicatat bahwa indikasi ini juga memerlukan studi lanjutan untuk menunjukkan relevansi temuan ini pada tahap pengembangan selanjutnya.

2.4 Penilaian Morfotoksisitas Melalui Pembacaan Kualitatif dan Kuantitatif Berbasis Gambar
Penilaian toksisitas perkembangan melalui fitur morfologi dapat menjelaskan mekanisme senyawa yang tidak mengganggu perkembangan secara luas tetapi menargetkan peristiwa morfogenetik tertentu. Untuk mengamati apakah senyawa dalam pustaka kami menyebabkan efek morfotoksik, kami menggunakan pengukuran hasil otomatis dari CellProfiler Analyst (CPA) yang dihasilkan sebelumnya untuk mengidentifikasi rasio fenotipe yang berbeda. Pengklasifikasi pembelajaran mesin yang diawasi memberikan informasi tentang tingkat perkembangan berdasarkan tonggak morfologi sepanjang kontinum perkembangan embrio. Efek morfotoksik kemudian diidentifikasi dari efek senyawa yang menunjukkan proporsi yang lebih tinggi dari tahap awal XEn/EpiCs atau menunjukkan variasi dalam pengukuran area. Kami menemukan bahwa senyawa, seperti kafein, busulfan, deksametason, dan asam valproat, menyebabkan peningkatan delaminasi lapisan XEn dari epiblas, menampilkan struktur yang lebih terpisah dibandingkan dengan XEn/EpiCs yang lebih kompak dalam kontrol. Paparan kafein pada dosis sedang dan tinggi, yaitu, 1 mm dan 2 mm , menyebabkan peningkatan kejadian delaminasi pada XEn/EpiCs, dengan dosis 2 mm menyebabkan efek morfologi paling signifikan ( Gambar 3a ). Kuantifikasi area delaminasi, yaitu, ruang antara XEn dan Epi, menggunakan ImageJ untuk mengukur dan mengurangi area Epi secara manual dari area XEn bagian dalam, menunjukkan peningkatan yang signifikan lebih tinggi dengan 2600 µm 2 pada dosis 2 mm (tinggi) dibandingkan dengan 800 µm 2 pada 500 µ m (rendah) kafein (Gambar 3b ).

Gambar 3
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Pengukuran morfometri otomatis dari berbagai jenis efek toksisitas perkembangan: a) gambar fluoresensi yang diperbesar dari XEn/EpiCs tunggal pada peningkatan dosis kafein. b) Pengukuran area delaminasi di antara dosis kafein tinggi, sedang, dan rendah dengan mengurangi area epiblas dari area bagian dalam XEn. c) Gambar fluoresensi yang diperbesar dari XEn/EpiCs tunggal pada peningkatan dosis asam retinoat. d) Kuantifikasi jumlah rongga yang terbentuk dalam struktur XEn/Epi non-terpolarisasi dengan 2, 3, 4, dan > 4 rongga per struktur. e) Gambar fluoresensi yang diperbesar dari XEn/EpiCs tunggal pada peningkatan dosis ampiron. f) Kuantifikasi otomatis ukuran XEn/EpiCs dalam semua kondisi perlakuan. Data adalah mean ± sd yang diperoleh dari n = 3 sumur, dengan setiap sumur berisi ≈ 165 struktur. Skala batang: 100 µm. Semua pengujian hipotesis statistik dilakukan dengan menggunakan uji Dunnett; ∗ menyatakan P ≤ 0,05, ∗∗ menyatakan P < 0,01, ∗∗∗ menyatakan P < 0,001, dan ∗∗∗∗ menyatakan P < 0,0001 (ANOVA satu arah dengan uji akhir Dunnett).
Untuk mengkarakterisasi struktur yang terdelaminasi dalam pengaturan otomatis, alur kerja CPA dibuat untuk melakukan pembelajaran mesin terawasi untuk struktur yang terdelaminasi vs. yang tidak terdelaminasi. Algoritme yang dihasilkan menilai semua kondisi perlakuan dan mengukur hasil struktur yang terdelaminasi per kondisi perlakuan. Diamati bahwa ada rasio struktur yang terdelaminasi secara signifikan lebih tinggi setelah paparan kafein dan busulfan, masing-masing sebesar 38% dan 50%, dibandingkan dengan 16% pada kontrol (Gambar S5 , Informasi Pendukung). Sementara perlakuan dengan asam valproat dan deksametason juga menunjukkan peningkatan hasil sebesar 24% dengan dosis tinggi, tidak ada signifikansi statistik yang diamati dibandingkan dengan kontrol (Gambar S5 , Informasi Pendukung).

Paparan asam retinoat (RA) ditemukan secara signifikan mengurangi hasil XEn/EpiCs tetapi meningkatkan hasil struktur XEn/Epi non-terpolarisasi (Gambar 2a ). Setelah penyelidikan lebih lanjut terhadap morfologi struktur XEn/Epi non-terpolarisasi setelah paparan RA, epitelisasi XEn tampak terjadi secara normal; namun, Epi non-terpolarisasi telah membentuk beberapa rongga yang tersebar ketika terpapar dosis sedang dan tinggi RA (Gambar 3c ). Ini menunjukkan bahwa polarisasi Epi dan pembentukan PAC terpengaruh, mungkin karena efek morfotoksik RA. Kuantifikasi jumlah rongga dalam struktur dari tiga dosis menunjukkan bahwa pada dosis terendah (0,4 nm ) , 45% struktur membentuk rongga tunggal dan 12% tidak membentuk rongga, sesuai dengan struktur XEn/EpiCs dan XEn/Epi non-terpolarisasi (Gambar S6 , Informasi Pendukung). Selain itu, 3% struktur masing-masing membentuk dua atau tiga rongga. Mayoritas (45%) struktur yang terpapar dosis sedang (33 nm ) RA mengakibatkan struktur XEn/Epi non-terpolarisasi tanpa rongga (Gambar S6 , Informasi Pendukung). Namun, yang menarik, dosis sedang RA juga menyebabkan sejumlah besar struktur dengan dua, tiga, dan empat rongga, dengan 13% (≈16 struktur) dengan dua rongga; sementara, 8% dan 6% struktur mengembangkan tiga dan empat rongga, masing-masing (Gambar 3d ). Demikian pula, dosis tertinggi 100 nm RA mengembangkan beberapa struktur dengan dua, tiga, empat, dan lima rongga dengan masing-masing 7%, 6%, 8%, dan 4% (Gambar 3d ).

Beberapa senyawa, seperti ampiron, tidak menunjukkan efek signifikan pada hasil XEn/EpiCs, tetapi penyelidikan lebih lanjut terhadap data morfometri dari CellProfiler menunjukkan pengurangan signifikan pada ukuran XEn/EpiCs (Gambar 3e ), diukur sebagai pengurangan area proyeksi XEn/EpiCs dari 9000 µm 2 menjadi 7000 µm 2 , 5000 µm 2 , dan 5000 µm 2 masing-masing dalam dosis rendah, sedang, dan tinggi (Gambar 3f ).

Secara keseluruhan, pengamatan terhadap berbagai fitur dalam struktur menunjukkan potensi efek morfotoksik pada pembentukan XEn/EpiCs dengan atau tanpa harus memiliki efek sitotoksik langsung. Senyawa-senyawa ini meliputi asam retinoat, kafein, busulfan, asam valproat, deksametason, dan ampiron. Eksperimen lebih lanjut yang lebih luas di masa mendatang harus difokuskan pada perkembangan XEn/EpiCs ini untuk durasi yang lebih lama guna mengidentifikasi efek perubahan morfologi ini pada tahap perkembangan selanjutnya. Secara keseluruhan, hasil-hasil ini menekankan nilai tambah dari penyertaan metrik morfotoksisitas dalam uji DART berthroughput tinggi yang melengkapi uji sitotoksisitas tradisional, yang akan memberikan pandangan yang lebih holistik tentang efek senyawa-senyawa tertentu pada perkembangan.

2.5 Kurva Respon Dosis Teratogen untuk Menilai Kisaran Toksisitas Perkembangan
Dari penyaringan awal dengan tiga konsentrasi, dosis tertinggi dan terendah yang diperlukan untuk menimbulkan efek pada perkembangan XEn/EpiCs diidentifikasi. Langkah berikutnya adalah memperluas batas atau menambahkan konsentrasi antara untuk menciptakan gambaran yang lebih komprehensif tentang efek morfologi yang disebabkan oleh senyawa tersebut. Untuk tujuan ini, senyawa yang menyebabkan efek gradien (tergantung dosis), memengaruhi perkembangan, dan yang menyebabkan sitotoksisitas tinggi dipilih untuk menjalankan penyaringan lanjutan dengan lima dosis. Dengan mengamati % hasil dari morfologi yang berbeda dalam setiap kondisi perlakuan menggunakan alur pembelajaran mesin otomatis, beberapa senyawa non-teratogenik, seperti isoniazid, penisilin, dan ibuprofen, masih menunjukkan efek gradien pada perkembangan XEn/EpiCs, dengan dosis tertinggi mengurangi kejadian tetapi tidak secara signifikan memengaruhi pembentukannya, menampilkan efisiensi ≈ 60% ( Gambar 4a ).

Gambar 4
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Skrining dengan lima konsentrasi teratogen untuk menilai kisaran sitotoksisitas: Hasil% XEn/EpiCs setelah paparan a) senyawa nonteratogenik dan b) senyawa teratogenik dari 48 hingga 72 jam. c) Desain eksperimen untuk uji ATP CellTiter Glo 3D pada sampel yang diobati dan kontrol pada 72 dan 120 jam perkembangan; uji ATP menggunakan CellTiterGlo 3D yang mendeteksi kadar ATP yang dilepaskan oleh sel hidup saat terpapar d) penisilin G, e) asam retinoat, f) asam valproat, g) deksametason, dan h) 5-Fluorourasil pada lima dosis yang meningkat. Garis hitam menunjukkan kadar ATP dari sampel 1 yang dikumpulkan pada 72 jam; garis biru menunjukkan kadar ATP dari sampel 2 yang dikumpulkan pada 120 jam, setelah penghilangan dan pencucian senyawa; dan garis putus-putus merah mewakili kadar ATP kontrol. Setiap titik mewakili sampel gabungan dari tiga replikasi biologis ( n = 3), yaitu, dari tiga sumur individual dari pelat 96 sumur, yang berisi ≈ 165 struktur/sumur. Suspensi yang berisi struktur dipindahkan ke pelat 96 sumur berdinding buram untuk membaca luminesensi secara akurat. Waktu integrasi 0,25–1 detik per sumur digunakan sebagai pedoman untuk deteksi berdasarkan petunjuk pabrik pembuat.
Misalnya, pengobatan dengan 63 µ m , 200 µ m , 1 mm , 2 mm , dan 20 mm penisilin G menunjukkan XEn/EpiCs% masing-masing sebesar 72%, 70%, 72%, 71%, dan 62%, yang menunjukkan bahwa dosis tertinggi senyawa tersebut secara signifikan memengaruhi perkembangan XEn/EpiCs dibandingkan dengan kontrol dengan 79%, tetapi masih kurang drastis (Gambar 4a ). Demikian pula, penambahan ibuprofen pada dosis tinggi 200 dan 400 µ m menunjukkan pengurangan yang signifikan dalam hasil XEn/EpiCs sebesar 60% dibandingkan dengan kontrol (Gambar 4a ).

Sebaliknya, pengobatan dengan senyawa teratogenik, seperti deksametason, asam valproat, karbamazepin, siklofosfamid, bosentan, propafenon HCl, indapamida, dan asam trans-retinoat, menunjukkan efek sitotoksik yang drastis setelah paparan pada dosis yang lebih tinggi (Gambar 4b ). Secara khusus, dosis tertinggi yang dipilih dari senyawa tersebut memengaruhi pembentukan XEn/EpiCs secara signifikan. Dalam kasus deksametason, pada konsentrasi 10 nm , 1 µm , 10 µm , 100 µm , dan 200 µm , hasil XEn/EpiCs turun drastis dengan masing-masing 64%, 66%, 60%, 15%, dan 10% (Gambar 4b ). Perlakuan dengan asam retinoat trans menunjukkan peningkatan toksisitas secara progresif dengan peningkatan dosis, dengan dosis terendah, yaitu 0,4 nm dan 10 nm menunjukkan pembentukan XEn/EpiCs masing-masing sebesar 70% dan 68%; sedangkan dosis yang lebih tinggi, yaitu dosis 33 nm , 100 nm , dan 1 µm menunjukkan pembentukan XEn/EpiCs masing-masing sebesar 42%, 38%, dan 36% (Gambar 4b ).

Secara bersamaan, dari paparan senyawa yang berbeda pada lima konsentrasi, kami mengamati tren yang menarik dalam efeknya terhadap perkembangan. Hasil ini membantu menentukan dosis yang menimbulkan efek morfologis terhadap perkembangan dan dosis yang menimbulkan toksisitas perkembangan maksimum.

Untuk mengukur tingkat sitotoksisitas yang disebabkan oleh paparan senyawa toksik dan menghubungkannya dengan pengamatan perubahan morfologi, kadar ATP pada setiap kondisi diukur menggunakan kit uji CellTiter Glo 3D (Promega), yang dengannya kadar ATP menunjukkan jumlah sel yang hidup. Pengumpulan dan pengukuran sampel dilakukan pada dua titik waktu; sampel pertama dikumpulkan 24 jam setelah paparan senyawa (48–72 jam), setelah itu senyawa perlakuan dihilangkan dan disegarkan dengan media biasa. Sampel kedua dikumpulkan 48 jam setelah penghilangan senyawa (120 jam) (Gambar 4c ). Dua titik waktu (sampel 1 dan 2) dipilih untuk mengidentifikasi efek langsung paparan senyawa pada struktur (paparan akut), serta kemampuan sel untuk mengejar garis waktu perkembangan setelah penghilangan senyawa (efek kronis), untuk mengidentifikasi apakah toksisitas dapat dibalik. Diamati bahwa pengobatan dengan penisilin G menyebabkan penurunan kadar ATP pada dosis yang lebih rendah yaitu 63 µ m , 200 µ m , 1 mm , dan 2 mm dengan 5,6, 5,3, 6,0, dan 5,8 × 106 U luminesensi, masing-masing, relatif terhadap 6,2 × 106 U pada kontrol (garis merah) (Gambar 4d ). Hal ini dapat disebabkan oleh hasil XEn/EpiCs yang semakin berkurang dengan meningkatnya dosis. Menariknya, kadar ATP yang dilepaskan pada dosis tertinggi 20 mm meningkat menjadi 6,7 × 106 U ketika diukur 24 jam setelah pengobatan (Gambar 4d ). Sementara itu, kadar ATP tetap konstan pada semua dosis, relatif terhadap kontrol, ketika diukur pada 120 jam (sampel 2), yang menyiratkan tidak ada efek sitotoksik pada perkembangan setelah penghilangan senyawa (Gambar 4d ). Peningkatan kadar ATP 24 jam setelah paparan penisilin dosis sangat tinggi ini dapat disebabkan oleh peralihan metabolisme seluler ke arah pelepasan ATP tinggi, efek yang juga terlihat pada sel bakteri yang diobati antibiotik. [ 20 ] Pengamatan unik adalah pengobatan 24 jam dengan asam retinoat (RA), yang menunjukkan peningkatan kadar ATP, dengan peningkatan dosis, relatif terhadap kontrol (Gambar 4e ). Mirip dengan dosis tinggi penisilin, ini dapat disebabkan oleh peralihan metabolik ke fosforilasi oksidatif yang diinduksi oleh RA, segera setelah paparan, pada dosis yang lebih tinggi. Menariknya, pemulihan pada 120 jam (sampel 2) menunjukkan kadar ATP yang seragam, menyerupai kontrol, yang menunjukkan pembalikan efek RA setelah penghilangan senyawa. Ini menunjukkan bahwa meskipun menyebabkan efek morfotoksik, mempengaruhi perkembangan, seperti yang diamati pada Gambar 3c, tidak ada efek sitotoksik yang signifikan setelah penghilangan senyawa pada dosis yang dipilih (Gambar 4e ).

Dalam kasus asam valproat, ada penurunan signifikan pada level ATP relatif terhadap kontrol dasar saat konsentrasi meningkat, dengan penurunan paling signifikan sebesar 1,5 × 106 U saat terpapar dosis 10 mm ( Gambar 4f ). Pengukuran sampel 2 menunjukkan pemulihan lengkap pada jumlah sel kecuali dalam kasus dosis 10 mm ( tertinggi) di mana level ATP tampak turun signifikan hingga 0,9 × 106 U. Bersama-sama, ini menunjukkan efek sitotoksik ireversibel asam valproat pada perkembangan XEn/EpiC pada dosis 10 mm yang gagal menyelamatkan efeknya meskipun senyawa tersebut dihilangkan (Gambar 4f). Pengobatan dengan deksametason menunjukkan penurunan level ATP , dengan pengobatan dosis tertinggi (199 µ m ) menunjukkan 2,4 × 106 U ATP relatif terhadap dasar (Gambar 4g ). Pemulihan jumlah sel dan perkembangan dalam sampel 2 pada dosis 10 nm menunjukkan 9,9 × 106 U ATP, tingkat yang sama dengan kontrol. Namun, dosis yang lebih tinggi menunjukkan kadar ATP yang berkurang, dengan sampel 2 pada dosis tertinggi menampilkan 1,4 × 106 U ATP (Gambar 4g ). Menarik untuk dicatat bahwa deksametason pada dosis 100 µm , baik dalam sampel 1 maupun sampel 2, memiliki tingkat ATP yang relatif lebih tinggi dibandingkan dengan dosis 10 µm . (Gambar 4g ). Efek unik ini dikaitkan dengan hubungan dosis-respons deksametason yang non-monotonik ketika diobati pada sel punca. Misalnya, deksametason telah diterima secara luas untuk meningkatkan diferensiasi sel punca mesenkimal menuju diferensiasi osteogenik, kondrogenik, dan adipogenik. [ 21 ] Namun, tergantung pada dosisnya, diferensiasi dapat diarahkan secara istimewa ke arah diferensiasi adipogenik daripada diferensiasi osteogenik [ 22 ] pada 10 ─7 mol L ─1 ; sementara, pada dosis yang lebih rendah 10 ─8 mol L ─ , deksametason dapat mempertahankan kesukuan dan proliferasi MSC. [ 21 ] Dalam penelitian kami, kadar ATP menunjukkan puncak pada dosis 100 µ m , mungkin menunjukkan dosis ambang batas, di mana deksametason dapat memiliki efek penghambatan pada diferensiasi, juga menjelaskan hasil XEn/EpiCs yang berkurang pada dosis ini. Obat antikanker, 5-fluorouracil, menunjukkan sitotoksisitas yang parah melampaui dosis 76,876 nm , dengan kadar ATP turun menjadi 1,0 × 10 6U, dan pemulihan struktur ini pada 120 jam dalam sampel 2 juga menunjukkan kadar ATP yang sangat rendah (Gambar 4h ). Hal ini konsisten dengan pengukuran hasil yang diamati sebelumnya menggunakan kuantifikasi otomatis tentang efek sitotoksik dan morfotoksik dari 5-fluorouracil (Gambar 2d ).

Temuan ini menunjukkan bahwa senyawa, seperti asam retinoat, yang tidak menunjukkan efek sitotoksik pada dosis paparan tinggi pada 120 jam, menunjukkan efek morfotoksik seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3c . Sementara itu, menarik juga untuk menemukan bahwa dosis morfotoksik deksametason dan asam valproat, yang menunjukkan penurunan signifikan dalam hasil XEn/EpiCs, juga menunjukkan peningkatan efek sitotoksik. Hal ini sekali lagi menekankan pentingnya pembacaan morfometrik yang melengkapi studi sitotoksisitas untuk sepenuhnya memahami implikasi senyawa pada perkembangan.

2.6 Karakterisasi Kematian Sel Dengan Pembacaan Morfogenetik Sebagai Ukuran Toksisitas Perkembangan
Dari perlakuan dengan senyawa pada lima konsentrasi, diamati bahwa dosis tertinggi menyebabkan pengurangan yang sangat drastis dalam hasil pembentukan XEn/EpiCs. Asumsi yang paling umum untuk efek ini adalah bahwa senyawa tersebut menyebabkan kematian sel, sehingga mengakibatkan penurunan % XEn/EpiCs. Untuk menilai secara kualitatif sifat kematian sel dalam struktur ini, 120 jam XEn/EpiCs dalam setiap kondisi perlakuan, untuk semua lima konsentrasi, dan kontrol diwarnai dengan antibodi Caspase 3/7 yang terbelah, penanda yang umum digunakan untuk memverifikasi kematian sel dengan peningkatan ekspresinya pada sel-sel yang mengalami apoptosis akhir dan sekarat. Sel-sel tersebut juga diwarnai untuk Hoechst (inti) ( Gambar 5a )
Skrining dengan lima konsentrasi teratogen untuk menilai kisaran sitotoksisitas: Hasil% XEn/EpiCs setelah paparan a) senyawa nonteratogenik dan b) senyawa teratogenik dari 48 hingga 72 jam. c) Desain eksperimen untuk uji ATP CellTiter Glo 3D pada sampel yang diobati dan kontrol pada 72 dan 120 jam perkembangan; uji ATP menggunakan CellTiterGlo 3D yang mendeteksi kadar ATP yang dilepaskan oleh sel hidup saat terpapar d) penisilin G, e) asam retinoat, f) asam valproat, g) deksametason, dan h) 5-Fluorourasil pada lima dosis yang meningkat. Garis hitam menunjukkan kadar ATP dari sampel 1 yang dikumpulkan pada 72 jam; garis biru menunjukkan kadar ATP dari sampel 2 yang dikumpulkan pada 120 jam, setelah penghilangan dan pencucian senyawa; dan garis putus-putus merah mewakili kadar ATP kontrol. Setiap titik mewakili sampel gabungan dari tiga replikasi biologis ( n = 3), yaitu, dari tiga sumur individual dari pelat 96 sumur, yang berisi ≈ 165 struktur/sumur. Suspensi yang berisi struktur dipindahkan ke pelat 96 sumur berdinding buram untuk membaca luminesensi secara akurat. Waktu integrasi 0,25–1 detik per sumur digunakan sebagai pedoman untuk deteksi berdasarkan petunjuk pabrik pembuat.
Misalnya, pengobatan dengan 63 µ m , 200 µ m , 1 mm , 2 mm , dan 20 mm penisilin G menunjukkan XEn/EpiCs% masing-masing sebesar 72%, 70%, 72%, 71%, dan 62%, yang menunjukkan bahwa dosis tertinggi senyawa tersebut secara signifikan memengaruhi perkembangan XEn/EpiCs dibandingkan dengan kontrol dengan 79%, tetapi masih kurang drastis (Gambar 4a ). Demikian pula, penambahan ibuprofen pada dosis tinggi 200 dan 400 µ m menunjukkan pengurangan yang signifikan dalam hasil XEn/EpiCs sebesar 60% dibandingkan dengan kontrol (Gambar 4a ).

Sebaliknya, pengobatan dengan senyawa teratogenik, seperti deksametason, asam valproat, karbamazepin, siklofosfamid, bosentan, propafenon HCl, indapamida, dan asam trans-retinoat, menunjukkan efek sitotoksik yang drastis setelah paparan pada dosis yang lebih tinggi (Gambar 4b ). Secara khusus, dosis tertinggi yang dipilih dari senyawa tersebut memengaruhi pembentukan XEn/EpiCs secara signifikan. Dalam kasus deksametason, pada konsentrasi 10 nm , 1 µm , 10 µm , 100 µm , dan 200 µm , hasil XEn/EpiCs turun drastis dengan masing-masing 64%, 66%, 60%, 15%, dan 10% (Gambar 4b ). Perlakuan dengan asam retinoat trans menunjukkan peningkatan toksisitas secara progresif dengan peningkatan dosis, dengan dosis terendah, yaitu 0,4 nm dan 10 nm menunjukkan pembentukan XEn/EpiCs masing-masing sebesar 70% dan 68%; sedangkan dosis yang lebih tinggi, yaitu dosis 33 nm , 100 nm , dan 1 µm menunjukkan pembentukan XEn/EpiCs masing-masing sebesar 42%, 38%, dan 36% (Gambar 4b ).

Secara bersamaan, dari paparan senyawa yang berbeda pada lima konsentrasi, kami mengamati tren yang menarik dalam efeknya terhadap perkembangan. Hasil ini membantu menentukan dosis yang menimbulkan efek morfologis terhadap perkembangan dan dosis yang menimbulkan toksisitas perkembangan maksimum.

Untuk mengukur tingkat sitotoksisitas yang disebabkan oleh paparan senyawa toksik dan menghubungkannya dengan pengamatan perubahan morfologi, kadar ATP pada setiap kondisi diukur menggunakan kit uji CellTiter Glo 3D (Promega), yang dengannya kadar ATP menunjukkan jumlah sel yang hidup. Pengumpulan dan pengukuran sampel dilakukan pada dua titik waktu; sampel pertama dikumpulkan 24 jam setelah paparan senyawa (48–72 jam), setelah itu senyawa perlakuan dihilangkan dan disegarkan dengan media biasa. Sampel kedua dikumpulkan 48 jam setelah penghilangan senyawa (120 jam) (Gambar 4c ). Dua titik waktu (sampel 1 dan 2) dipilih untuk mengidentifikasi efek langsung paparan senyawa pada struktur (paparan akut), serta kemampuan sel untuk mengejar garis waktu perkembangan setelah penghilangan senyawa (efek kronis), untuk mengidentifikasi apakah toksisitas dapat dibalik. Diamati bahwa pengobatan dengan penisilin G menyebabkan penurunan kadar ATP pada dosis yang lebih rendah yaitu 63 µ m , 200 µ m , 1 mm , dan 2 mm dengan 5,6, 5,3, 6,0, dan 5,8 × 106 U luminesensi, masing-masing, relatif terhadap 6,2 × 106 U pada kontrol (garis merah) (Gambar 4d ). Hal ini dapat disebabkan oleh hasil XEn/EpiCs yang semakin berkurang dengan meningkatnya dosis. Menariknya, kadar ATP yang dilepaskan pada dosis tertinggi 20 mm meningkat menjadi 6,7 × 106 U ketika diukur 24 jam setelah pengobatan (Gambar 4d ). Sementara itu, kadar ATP tetap konstan pada semua dosis, relatif terhadap kontrol, ketika diukur pada 120 jam (sampel 2), yang menyiratkan tidak ada efek sitotoksik pada perkembangan setelah penghilangan senyawa (Gambar 4d ). Peningkatan kadar ATP 24 jam setelah paparan penisilin dosis sangat tinggi ini dapat disebabkan oleh peralihan metabolisme seluler ke arah pelepasan ATP tinggi, efek yang juga terlihat pada sel bakteri yang diobati antibiotik. [ 20 ] Pengamatan unik adalah pengobatan 24 jam dengan asam retinoat (RA), yang menunjukkan peningkatan kadar ATP, dengan peningkatan dosis, relatif terhadap kontrol (Gambar 4e ). Mirip dengan dosis tinggi penisilin, ini dapat disebabkan oleh peralihan metabolik ke fosforilasi oksidatif yang diinduksi oleh RA, segera setelah paparan, pada dosis yang lebih tinggi. Menariknya, pemulihan pada 120 jam (sampel 2) menunjukkan kadar ATP yang seragam, menyerupai kontrol, yang menunjukkan pembalikan efek RA setelah penghilangan senyawa. Ini menunjukkan bahwa meskipun menyebabkan efek morfotoksik, mempengaruhi perkembangan, seperti yang diamati pada Gambar 3c, tidak ada efek sitotoksik yang signifikan setelah penghilangan senyawa pada dosis yang dipilih (Gambar 4e ).

Dalam kasus asam valproat, ada penurunan signifikan pada level ATP relatif terhadap kontrol dasar saat konsentrasi meningkat, dengan penurunan paling signifikan sebesar 1,5 × 106 U saat terpapar dosis 10 mm ( Gambar 4f ). Pengukuran sampel 2 menunjukkan pemulihan lengkap pada jumlah sel kecuali dalam kasus dosis 10 mm ( tertinggi) di mana level ATP tampak turun signifikan hingga 0,9 × 106 U. Bersama-sama, ini menunjukkan efek sitotoksik ireversibel asam valproat pada perkembangan XEn/EpiC pada dosis 10 mm yang gagal menyelamatkan efeknya meskipun senyawa tersebut dihilangkan (Gambar 4f). Pengobatan dengan deksametason menunjukkan penurunan level ATP , dengan pengobatan dosis tertinggi (199 µ m ) menunjukkan 2,4 × 106 U ATP relatif terhadap dasar (Gambar 4g ). Pemulihan jumlah sel dan perkembangan dalam sampel 2 pada dosis 10 nm menunjukkan 9,9 × 106 U ATP, tingkat yang sama dengan kontrol. Namun, dosis yang lebih tinggi menunjukkan kadar ATP yang berkurang, dengan sampel 2 pada dosis tertinggi menampilkan 1,4 × 106 U ATP (Gambar 4g ). Menarik untuk dicatat bahwa deksametason pada dosis 100 µm , baik dalam sampel 1 maupun sampel 2, memiliki tingkat ATP yang relatif lebih tinggi dibandingkan dengan dosis 10 µm . (Gambar 4g ). Efek unik ini dikaitkan dengan hubungan dosis-respons deksametason yang non-monotonik ketika diobati pada sel punca. Misalnya, deksametason telah diterima secara luas untuk meningkatkan diferensiasi sel punca mesenkimal menuju diferensiasi osteogenik, kondrogenik, dan adipogenik. [ 21 ] Namun, tergantung pada dosisnya, diferensiasi dapat diarahkan secara istimewa ke arah diferensiasi adipogenik daripada diferensiasi osteogenik [ 22 ] pada 10 ─7 mol L ─1 ; sementara, pada dosis yang lebih rendah 10 ─8 mol L ─ , deksametason dapat mempertahankan kesukuan dan proliferasi MSC. [ 21 ] Dalam penelitian kami, kadar ATP menunjukkan puncak pada dosis 100 µ m , mungkin menunjukkan dosis ambang batas, di mana deksametason dapat memiliki efek penghambatan pada diferensiasi, juga menjelaskan hasil XEn/EpiCs yang berkurang pada dosis ini. Obat antikanker, 5-fluorouracil, menunjukkan sitotoksisitas yang parah melampaui dosis 76,876 nm , dengan kadar ATP turun menjadi 1,0 × 10 6U, dan pemulihan struktur ini pada 120 jam dalam sampel 2 juga menunjukkan kadar ATP yang sangat rendah (Gambar 4h ). Hal ini konsisten dengan pengukuran hasil yang diamati sebelumnya menggunakan kuantifikasi otomatis tentang efek sitotoksik dan morfotoksik dari 5-fluorouracil (Gambar 2d ).

Temuan ini menunjukkan bahwa senyawa, seperti asam retinoat, yang tidak menunjukkan efek sitotoksik pada dosis paparan tinggi pada 120 jam, menunjukkan efek morfotoksik seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3c . Sementara itu, menarik juga untuk menemukan bahwa dosis morfotoksik deksametason dan asam valproat, yang menunjukkan penurunan signifikan dalam hasil XEn/EpiCs, juga menunjukkan peningkatan efek sitotoksik. Hal ini sekali lagi menekankan pentingnya pembacaan morfometrik yang melengkapi studi sitotoksisitas untuk sepenuhnya memahami implikasi senyawa pada perkembangan.

2.6 Karakterisasi Kematian Sel Dengan Pembacaan Morfogenetik Sebagai Ukuran Toksisitas Perkembangan
Dari perlakuan dengan senyawa pada lima konsentrasi, diamati bahwa dosis tertinggi menyebabkan pengurangan yang sangat drastis dalam hasil pembentukan XEn/EpiCs. Asumsi yang paling umum untuk efek ini adalah bahwa senyawa tersebut menyebabkan kematian sel, sehingga mengakibatkan penurunan % XEn/EpiCs. Untuk menilai secara kualitatif sifat kematian sel dalam struktur ini, 120 jam XEn/EpiCs dalam setiap kondisi perlakuan, untuk semua lima konsentrasi, dan kontrol diwarnai dengan antibodi Caspase 3/7 yang terbelah, penanda yang umum digunakan untuk memverifikasi kematian sel dengan peningkatan ekspresinya pada sel-sel yang mengalami apoptosis akhir dan sekarat. Sel-sel tersebut juga diwarnai untuk Hoechst (inti) ( Gambar 5a ) (Tabel 03).

Gambar 5
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Karakterisasi kematian sel dengan pembacaan morfogenetik sebagai ukuran toksisitas perkembangan: a) gambar fluoresensi 120 jam XEn/EpiCs yang diwarnai untuk penanda kematian sel yang dibelah Caspase 3/7 dan Hoechst dalam kontrol dan ketika diobati dengan penisilin G, talidomida, karbamazepin, asam retinoat, deksametason, dan asam valproat, pada lima dosis. Pengukuran intensitas terpadu objek ketika diobati dengan b) penisilin G, c) talidomida, d) asam retinoat, e) karbamazepin, f) deksametason, dan g) asam valproat. Data adalah rata-rata ± sd Skala batang: 100 µm. Semua pengujian hipotesis statistik dilakukan dengan menggunakan uji Dunnett. ∗ melambangkan P ≤ 0,05, ∗∗ melambangkan P < 0,01, ∗∗∗ melambangkan P < 0,001, dan ∗∗∗∗ melambangkan P < 0,0001 (ANOVA satu arah dengan uji pasca Dunnett).
Telah diamati bahwa XEn/EpiCs yang terbentuk dalam kondisi kontrol menunjukkan gugusan sel Caspase 3/7 + di bagian tengah struktur dalam rongga pro-amnion. Dari penelitian sebelumnya, telah ditunjukkan bahwa pada E4.5, epiblas menerima isyarat polarisasi yang dimediasi integrin dari membran dasar yang disekresikan oleh endoderm viseral di sekitarnya, masuknya air melalui gradien osmotik, dan polaritas apikal-basal eksklusif E-Cadherin/Podocalyxin, yang mengarah pada perluasan rongga pro-amnion (PAC). [ 18 ] Namun, karena kurangnya suplementasi serum atau matriks eksternal dalam medium XEn/EpiCs yang dikultur secara in vitro, lumenogenesis melibatkan peningkatan apoptosis di dalam rongga. [ 23 ] Oleh karena itu, XEn/EpiCs dalam semua kondisi perlakuan menunjukkan gugusan sel Caspase 3/7 + di dalam PAC. Namun, bila dibandingkan dengan kontrol, kondisi perlakuan menunjukkan tingkat kematian sel yang berbeda tergantung pada konsentrasinya.

Dalam kasus penisilin G, rasio sel Caspase 3/7 + dalam lumen XEn/EpiCs meningkat dengan meningkatnya dosis dan lebih jelas pada dosis 20 mm ( Gambar 5a ). Tingkat ekspresi Caspase 3/7 dalam setiap objek (per sumur) dihitung menggunakan jalur otomatis, mengukur intensitas terintegrasi di ruang angkasa. Pengukuran otomatis intensitas terintegrasi dalam struktur di bawah dosis perlakuan penisilin yang berbeda tidak menunjukkan peningkatan signifikan dalam ekspresi Caspase 3/7 dibandingkan dengan kontrol (Gambar 5b ).

Paparan terhadap thalidomide tidak menunjukkan pengurangan drastis dalam hasil XEn/EpiCs (Gambar 5a ). Namun, pada dosis tertinggi 200 µ m , terdapat efek pada morfologi (Gambar 5a ) serta peningkatan intensitas Caspase 3/7 (Gambar 5c ). Mirip dengan pengobatan thalidomide, paparan terhadap carbamazepine menunjukkan hasil pembentukan XEn/EpiCs yang relatif lebih tinggi pada dosis yang lebih rendah dan hasil yang sedikit berkurang pada dosis yang lebih tinggi (Gambar 4b ). Namun, imunopewarnaan struktur mengungkapkan ekspresi Caspase 3/7 yang lebih tinggi pada dosis tertinggi 398 µ m (Gambar 5d ) dengan populasi Caspase 3/7+ di kedua kompartemen PAC dan XEn, divalidasi oleh peningkatan intensitas dibandingkan dengan kontrol (Gambar 5d ).

Pengobatan dengan asam retinoat menunjukkan efek menarik pada perkembangan XEn/EpiCs. Intensitas Caspase 3/7 tampak minimal pada konsentrasi 0,4 nm dan 10 mm , proporsional dengan pengamatan sebelumnya (Gambar 5a ). Namun, efeknya lebih jelas dari konsentrasi 10 nm , secara signifikan menyebabkan morfotoksisitas serta sitotoksisitas dengan pengobatan dengan dosis tertinggi asam retinoat 1 µ m membentuk struktur XEn/Epi non-terpolarisasi (Gambar 5a ), menampilkan peningkatan intensitas Caspase 3/7 (Gambar 5e ). Paparan deksametason menunjukkan pengurangan morfologis ketika terpapar dosis 100 µ m dan seterusnya (Gambar 5a ), membentuk lebih banyak struktur XEn seperti EB atau amorf daripada XEn/EpiCs. Ini juga terlihat dari intensitas terintegrasi yang berkurang pada 100 dan 199 µ m deksametason (Gambar 5f ). Hal ini menunjukkan bahwa pengobatan dengan deksametason mempengaruhi epitelisasi XEn dan polarisasi Epi (Gambar 4a ). Mirip dengan deksametason, pengobatan dengan asam valproat meningkatkan rasio kematian sel di PAC dengan peningkatan dosis (Gambar 5a ). Namun, pada dosis tertinggi asam valproat 10 mm , kematian sel drastis disertai dengan morfologi terhambat tanpa pembentukan XEn/EpiCs dalam kondisi ini, hanya membentuk struktur seperti EB (Gambar 4a ). Hal ini juga diperkuat dengan pengukuran intensitas terintegrasi ekspresi Caspase 3/7, yang menunjukkan peningkatan signifikan dengan peningkatan dosis (Gambar 5g ).

Pengukuran distribusi intensitas radial fluoresensi Caspase 3/7 memungkinkan visualisasi area kematian sel dalam bin radial yang berbeda dalam XEn/EpiCs (Gambar S7 , Informasi Pendukung), di mana setiap bin sesuai dengan XEn, Epi, atau PAC. Dengan cara ini, kematian sel, yang diwakili oleh sel-sel positif Caspase 3/7, dapat digambarkan per kompartemen melalui kuantifikasi koefisien variasi (radialCV) intensitas antara bin yang berbeda (Gambar S8 , Informasi Pendukung). Hasil yang diamati untuk efek asam valproat berkorelasi dengan temuan sebelumnya dan menunjukkan bahwa radialCV bin 1, 2, dan 3 meningkat secara signifikan dalam dosis 333 µ m dan 1 mm , yang menunjukkan kematian sel yang tinggi dalam kompartemen PAC dan XEn (Gambar S8 , Informasi Pendukung). Selain itu, dosis 10 mm ( tertinggi), yang tampaknya menyebabkan efek sitotoksik dan morfotoksik yang tinggi, juga menunjukkan morfologi yang sangat terpengaruh pada skema distribusi intensitas radial (Gambar S7 , Informasi Pendukung).

Dengan menggabungkan semua temuan, kami menunjukkan bahwa pengukuran sitotoksisitas dapat dilakukan secara paralel dengan penilaian morfologi dalam mikrowell menggunakan jalur analisis gambar otomatis, yang secara langsung menghubungkan morfologi dengan proses perkembangan yang telah terpengaruh. Kami menggunakan jalur tersebut untuk mengukur lebih lanjut distribusi intensitas spasial kematian sel menggunakan pewarnaan caspase 3/7, yang memberikan petunjuk tentang efek asam valproat pada kompartemen jaringan yang berbeda.

3 Diskusi
Studi percontohan ini menunjukkan bahwa XEn/EpiCs yang dibudidayakan dalam susunan mikrowell menyajikan model serbaguna, yang memungkinkan pembentukan yang kuat dan pencitraan throughput tinggi dari struktur seperti embrio dan memfasilitasi ekstraksi data morfologi dan fungsional yang luas. Paparan langsung atau tidak langsung terhadap agen eksogen dapat mengganggu perkembangan janin mamalia, menjadikannya prioritas tinggi untuk mengevaluasi dan memvalidasi kandidat obat baru dan yang sudah ada untuk toksisitas perkembangan dan teratogenisitas. Keuntungan utama XEn/EpiCs, dibandingkan dengan model embrio 3D lainnya, adalah pembentukan terkontrol dari jaringan endodermal epiblast dan ekstraembrionik, yang berkembang bersama sebagai respons terhadap induksi kimia melalui tahap peri-implantasi. Sebelumnya, kami telah menunjukkan pembentukan XEn/EpiCs yang kuat dalam platform mikrowell yang dibentuk secara termal, yang memungkinkan ekstraksi informasi morfologi dari struktur untuk memodulasi jalur pensinyalan. [ 14 ] Dengan menggunakan sistem ini, kami menilai perpustakaan senyawa dan mengamati efek toksisitas bergantung dosis pada XEn/EpiCs, yang memengaruhi berbagai proses morfogenetik dan jenis jaringan.

Penilaian toksisitas tradisional bergantung pada pengukuran sitotoksisitas melalui uji mikrotiter dan analisis titik akhir yang mengevaluasi proliferasi, diferensiasi, dan migrasi yang terganggu. Namun, toksisitas perkembangan sering kali bermanifestasi sebagai perubahan morfologi selama embriogenesis awal; dan dengan demikian, hanya mengandalkan penanda sitotoksisitas atau diferensiasi memberikan pemahaman yang tidak lengkap tentang potensi teratogenik suatu senyawa. Pendekatan yang lebih komprehensif diperlukan untuk mengevaluasi dampak teratogen pada perkembangan embrio secara menyeluruh. Fitur unik model kami terletak pada kemampuannya untuk secara otomatis mendeteksi, mengekstraksi, dan mengukur parameter seperti luas, bentuk, ukuran, tekstur, dan intensitas dari setiap XEn/EpiC, memfasilitasi klasifikasi morfologi yang diamati dan hubungannya dengan peristiwa perkembangan yang terpengaruh. [ 14 ]

Teratogen, senyawa yang melewati sawar maternal selama kehamilan, dapat mengganggu program morfogenetik embrionik dengan berbagai tingkat keparahan. Senyawa-senyawa ini secara tradisional dikategorikan berdasarkan efek, tingkat keparahan, dosis, dan validasinya pada model hewan. Meskipun eksplorasi yang lebih luas terhadap perkembangan XEn/EpiC pada tahap selanjutnya, menggunakan rentang dosis dan jendela pengobatan yang lebih luas, diperlukan untuk sepenuhnya memvalidasi XEn/EpiC sebagai model in vitro untuk penilaian teratogenisitas, studi percontohan ini memberikan wawasan awal yang penting.

Hasil kami, seperti yang dirangkum dalam Tabel 2 , mengidentifikasi efek minimal hingga tidak ada pada pembentukan XEn/EpiC setelah paparan obat yang umum diresepkan seperti ibuprofen dan asam folat. Ini mengikuti efek suplementasi asam folat oral yang diketahui dan telah dipelajari dengan baik, yang secara luas direkomendasikan untuk wanita sebelum pembuahan dan selama trimester pertama kehamilan karena perannya yang penting dalam mendukung perkembangan tabung saraf. [ 24 ] Paparan terhadap senyawa yang belum menunjukkan efek teratogenik yang signifikan pada model hewan pengerat, seperti thalidomide [ 25 ] dan diphenhydramine HCl (kategori FDA B), [ 26 ] juga tidak mempengaruhi perkembangan XEn/EpiCs dalam konsentrasi yang diuji dalam penelitian ini. Hasil ini menunjukkan XEn/EpiCs sebagai model embrio tikus yang relevan dan alternatif yang dapat merangkum temuan senyawa dan obat yang diketahui dari penelitian hewan.

Tabel 2. Garis besar efek semua senyawa: T/A berarti senyawa ini tidak dieksplorasi melampaui penyaringan tiga dosis dalam studi percontohan ini.

Menariknya, paparan senyawa non-teratogenik lainnya, yaitu asam askorbat, penisilin, indapamida, dan tiamin, menunjukkan efek tergantung dosis, dengan dosis tertinggi secara signifikan mengurangi pembentukan XEn/EpiCs (Gambar 1e ). Hal ini sejalan dengan studi embriotoksisitas tergantung dosis yang ditunjukkan sebelumnya dengan senyawa ini, yang menyebabkan toksisitas pada embrio hewan pengerat pada dosis tinggi. [ 27 ] Sementara itu, senyawa dengan efek teratogenik yang terdokumentasi dengan baik, seperti asam valproat (VPA), [ 28 ] deksametason, [ 29 ] bosentan, [ 30 ] karbamazepin, [ 31 ] dan propafenon HCl [ 32 ] menyebabkan pengurangan yang signifikan dalam hasil XEn/EpiCs pada dosis tertinggi. Klaster Epi/XEn antara 72 dan 120 jam mengalami epitelisasi XEn, polarisasi apikal-basal Epi, dan pembentukan lumen. Dengan memaparkan senyawa-senyawa tersebut dari 48 hingga 72 jam selama perkembangan XEn/EpiCs, yang meniru jendela pra-implantasi perkembangan embrio, kami dapat mengamati efek senyawa-senyawa tersebut dalam mengganggu morfologi struktur, membentuk varian-varian XEn/EpiC tahap awal. Misalnya, paparan VPA dari 48 hingga 72 jam dapat memengaruhi polarisasi Epi dan pembentukan lumen, sehingga membentuk rasio roset XEn/Epi dan XEn/Epi non-terpolarisasi yang lebih tinggi pada dosis sedang dan menyebabkan sitotoksisitas ekstrem pada dosis tertinggi. Di masa mendatang, pengobatan kombinasi dengan asam folat setelah pengobatan VPA berpotensi menyelamatkan efek VPA, seperti yang terlihat pada kultur sel punca pluripoten manusia. [ 33 ]

Asam valproat (VPA), penghambat histone deacetylase, memengaruhi diferensiasi sel punca secara tergantung dosis. Misalnya, diketahui dapat meningkatkan stemness serta diferensiasi dengan mengaktifkan jalur perkembangan termasuk BMP [ 34 ] dan TGFbeta, tergantung pada jenis sel dan konsentrasi yang digunakan. [ 35 ] Kami beralasan bahwa dosis rendah secara selektif mengubah ekspresi gen, mungkin mengurangi ukuran rongga pro-amnion dengan memengaruhi proliferasi, apoptosis, atau komposisi matriks ekstraseluler. Sebuah studi baru-baru ini, oleh Zhang et al., 2022 pada struktur seperti tabung saraf berdiferensiasi sel punca pluripoten manusia, mengamati efek toksik karena paparan VPA dengan menghambat pembentukan lumen. [ 33 ] Dalam studi kami, kami mengamati bahwa pengobatan dengan VPA 4 µ m menyebabkan pengurangan ukuran keseluruhan XEn/EpiCs (Gambar 1h ), mungkin karena VPA mengubah fungsi cytoskeletal dan polarisasi sel. Namun, dosis VPA sedang dan tinggi tidak menunjukkan fenotipe ini, meskipun menyebabkan hasil yang berkurang. Kami berspekulasi bahwa dosis yang lebih tinggi menyebabkan perubahan epigenetik yang lebih luas, yang berpotensi mengaktifkan mekanisme kompensasi yang mengimbangi efek ini.

Yang perlu diperhatikan secara khusus adalah senyawa yang menghasilkan perubahan morfologi signifikan, yang kami klasifikasikan sebagai morfotoksik terhadap perkembangan (Gambar 2 dan Gambar 3 ). Misalnya, paparan kafein menyebabkan delaminasi lapisan XEn dari Epi, khususnya pada dosis tertinggi 2 mm , dengan area delaminasi yang lebih besar dibandingkan dengan kontrol (Gambar 3a,b ). Fenotipe ini mencerminkan morfologi yang terlihat pada Nodal knock-out [ 15 ] atau Nodal menghambat XEn/EpiCs, [ 14 ] serta dalam kondisi dengan peningkatan aktivasi jalur Wnt dan BMP [ 14 ] (Gambar S9 , Informasi Pendukung), yang menunjukkan mekanisme aksi yang serupa untuk kafein. Penelitian sebelumnya juga menunjukkan bahwa dosis tinggi kafein menyebabkan anomali parah dalam perkembangan embrio tikus normal. [ 36 ] Temuan ini menyoroti potensi kebutuhan untuk mempertimbangkan kembali ambang batas keamanan untuk paparan kafein karena dosis yang lebih rendah dapat memberikan efek morfologi yang halus namun signifikan pada perkembangan.

Paparan asam retinoat juga menghasilkan hasil yang menarik. Pada dosis sedang dan tinggi, hasil XEn/EpiCs menurun secara signifikan, dan persentase struktur yang lebih tinggi tetap berada dalam tahap perkembangan awal, yang ditandai dengan Epi yang tidak terpolarisasi. Investigasi lebih lanjut mengungkapkan bahwa struktur ini sering kali mengandung beberapa rongga yang lebih kecil dan hancur daripada rongga tunggal, dengan jumlah rongga yang hancur meningkat dengan dosis asam retinoat yang lebih tinggi (Gambar 3c,d ). Hasil ini menunjukkan bahwa dosis tinggi asam retinoat mengganggu polarisasi epiblas dan lumenogenesis. Temuan ini sejalan dengan penelitian oleh Collins dan Mao (1999) tentang efek perkembangan RA, [ 37 ] yang menggemakan pengamatan bahwa paparan RA janin dapat menyebabkan kelainan fungsional dan perilaku yang parah. Uji ATP setelah paparan RA menunjukkan peningkatan produksi ATP saat terpapar dosis RA yang lebih tinggi, relatif terhadap kontrol, saat diukur 24 jam setelah paparan gabungan (Gambar 4e ). Ini bisa jadi merupakan hasil dari pergeseran profil metabolik selama diferensiasi dalam struktur ini. Sebuah studi yang relatif baru-baru ini tentang diferensiasi kardiomiosit yang diinduksi RA pada sel punca embrionik manusia (hESC) mengidentifikasi pematangan metabolik yang dicirikan oleh pergeseran metabolik dari glikolisis ke fosforilasi oksidatif. Hal ini menyebabkan peningkatan produksi ATP dalam sel. [ 38 ] Meskipun studi serupa tidak ada pada sel punca embrionik tikus, masuk akal bahwa RA dapat memengaruhi aktivitas metabolik yang serupa ketika terpapar pada tahap dan durasi tertentu selama diferensiasi. Studi lain mengidentifikasi efek jumlah lintasan pada profil metabolik diferensiasi sel endoderm ekstraembrionik (XEn), di mana sel-sel lintasan akhir memanfaatkan fosforilasi oksidatif untuk memperoleh energi. [ 39 ] Karena bukti langsung dari aktivitas metabolik sebagai respons terhadap RA pada sel punca embrionik manusia saat ini tidak ada, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengonfirmasi efek ini. Efek serupa juga diamati ketika terpapar dosis penisilin tertinggi pada 20 mm .

Seperti yang diharapkan, senyawa yang biasanya diresepkan untuk pengobatan kanker, seperti busulfan, 5-fluorouracil, etretinate, dan isotretinoin, menyebabkan terhambatnya perkembangan pada 48 jam, bertepatan dengan waktu pengobatan. Tidak ada pemulihan dalam perkembangan yang diamati setelah penghilangan senyawa ini (Gambar 2 ). Secara morfologis, struktur ini menyerupai badan embrioid dengan sel Gata6 (mVenus+) yang tersebar secara acak di antara sel Epi. Temuan ini menunjukkan bahwa agen kemoterapi menyebabkan efek morfotoksik dan sitotoksik, yang menekankan pentingnya menggunakan pendekatan komplementer untuk memprediksi toksisitas perkembangan.

Memperluas rentang konsentrasi senyawa tertentu hingga lima dosis memungkinkan kami mengidentifikasi dosis di mana efek perkembangan paling parah terjadi. Untuk asam valproat, deksametason, dan siklofosfamid, hasil XEn/EpiCs turun hingga kurang dari 20% pada dosis tertinggi (Gambar 4 ). Sitotoksisitas dinilai menggunakan uji mikrotiter berbasis ATP pada 72 jam, segera setelah paparan, dan pada 120 jam, setelah penghilangan senyawa. Khususnya, asam valproat, deksametason, dan 5-fluorourasil menyebabkan sitotoksisitas ireversibel pada dosis tertinggi, tanpa penyelamatan perkembangan pada 120 jam. Menariknya, paparan asam retinoat dosis tinggi menyebabkan efek sitotoksik pada 24 jam, tetapi pada 120 jam, struktur menunjukkan peningkatan pelepasan ATP, yang menunjukkan peningkatan proliferasi sel dan pemulihan dalam perkembangan setelah penghilangan senyawa (Gambar 4 ). Temuan ini konsisten dengan peningkatan pembentukan struktur XEn/Epi non-terpolarisasi setelah perawatan asam retinoat (Gambar 2a ).

Eksperimen di masa mendatang dengan paparan gabungan senyawa-senyawa tersebut pada titik waktu yang berbeda dan rentang konsentrasi yang lebih besar dapat menghasilkan kumpulan data yang komprehensif untuk memprediksi teratogenisitas in vivo dari senyawa-senyawa tersebut. Perluasan studi ini akan memerlukan pembandingan pengamatan morfologi dengan model-model in vitro dan studi-studi in vivo lainnya pada dosis-dosis yang berbeda, yang saat ini berada di luar cakupan studi percontohan sebesar ini.

Secara keseluruhan, kami mengamati bahwa senyawa dengan sifat dan mekanisme aksi yang berbeda memiliki dampak yang berbeda pada perkembangan dan morfogenesis XEn/EpiC. Melalui penyaringan ini, kami mengidentifikasi beberapa efek morfotoksik yang menarik dari senyawa, yang sebelumnya hanya dipelajari pada model hewan. Pendekatan ini memperluas kemampuan kami untuk mempelajari toksisitas perkembangan dalam sistem yang lebih mudah diakses. Kami mengusulkan bahwa melengkapi uji sitotoksisitas tradisional dengan penilaian morfotoksisitas menawarkan prediksi yang lebih akurat tentang toksisitas perkembangan dan reproduksi, yang berpotensi mencapai hasil yang sebanding dengan eksperimen in vivo dan mengurangi ketergantungan pada pengujian hewan. Metode untuk penilaian toksisitas perkembangan ini dapat digunakan sebagai langkah awal yang berdiri sendiri untuk membuat daftar pendek senyawa atau digunakan dalam kombinasi dengan pengujian yang ada untuk akhirnya meminimalkan penggunaan hewan dalam pengujian. Platform baru kami berpotensi menjadi alat yang ampuh untuk melakukan penyaringan toksikologi skala besar otomatis dan lebih jauh menjelaskan mekanisme yang memengaruhi perkembangan.

3.1 Keterbatasan Sistem Ini
Studi percontohan ini hanya diuji pada satu garis sel induk embrionik tikus, dari galur C57BL/6. Di masa mendatang, sistem ini harus diuji pada garis sel induk tikus lain dari galur yang sama. Lebih jauh, menilai variabilitas di seluruh garis dari galur yang berbeda (misalnya, AB2.2, R1/E, CD-1) akan memberikan wawasan yang lebih mendalam tentang kekokohannya. Selain itu, memperluas sistem ini untuk menguji model embrio yang berasal dari ESC atau iPSC manusia menggunakan pustaka dan pembacaan yang sama akan memberikan perbandingan yang baik dari kedua spesies dan memungkinkan peluang untuk memvalidasi efek di seluruh sistem. Alur kerja untuk ekstraksi fitur morfometrik saat ini mengenali lima varian XEn/EpiC primer. Beberapa senyawa yang menyebabkan efek yang nyata harus ditindaklanjuti dengan pengamatan dosis-respons dari waktu ke waktu, melacak proliferasi sel, dan morfologi waktu nyata, untuk menyimpulkan efek toksiknya secara akurat. Memperluas algoritma pembelajaran mesin untuk mengklasifikasikan fenotipe yang tidak diharapkan, seperti dengan menggabungkan analisis berbasis pembelajaran mendalam, akan meningkatkan fleksibilitas sistem dalam mendeteksi fitur baru, termasuk jumlah rongga yang berlebihan; sekaligus meminimalkan pengawasan dan kesalahan. Melakukan penyaringan dengan rentang konsentrasi yang lebih besar dan memetakan pembacaan morfometrik dan viabilitas secara sistematis untuk mengidentifikasi nilai IC50 morfo- dan sitotoksisitas merupakan hal yang menarik di masa mendatang.

4 Bagian Eksperimen
Garis Sel ES Tikus
Dalam penelitian ini, digunakan garis sel pelapor mES:: Gata6-h2b-Venus (mESC yang terdiri dari pelapor H2B-Venus di bawah elemen regulasi Gata6), yang merupakan hadiah dari laboratorium C. Schröters (Institut Fisiologi Molekuler Max Planck, Dortmund, Jerman). [ 40 ] Percobaan dilakukan menggunakan sel dalam bagian 10–18. Garis sel ES telah diuji untuk mikoplasma. Untuk semua percobaan dalam artikel ini, digunakan garis pelapor mES:: Gata6: H2B: Venus.

Sumur mikro yang dibentuk secara termal
Untuk kultur 3D mESC, digunakan mikrowell yang dibentuk secara termal, STATARRAY (pelat mikrowell polistirena 96-well dari 300MICRONS GmbH) [ 16 , 20 ] . Sebelum digunakan, well dicuci sekali dengan etanol 70% dan dua kali dengan air. Well kemudian diobati dengan larutan anti-adherensi (StemCell Technologies) dan diinkubasi selama ≈ 20 menit pada suhu ruangan di dalam kap aliran laminar; dan kemudian, dicuci tiga kali dengan PBS. PBS baru ditambahkan ke well dan disimpan hingga digunakan lebih lanjut.

Kultur Sel ES dan Reagen
Sel induk embrionik tikus (mESC) secara teratur diperbanyak pada lapisan pengumpan fibroblas embrionik tikus (mEF) tipe liar (B16/C57) yang diiradiasi, (T50)—yang diperoleh dari fasilitas inti Erasmus UMC+ iPS—pada pelat TC berlapis gelatin 0,15%. Untuk diferensiasi menjadi XEn/EpiC, mEF dikurangi sebelum disemai ke dalam sumur mikro.

Sel-sel dikultur menggunakan medium ES yang terdiri dari: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium High Glucose (Life Technologies) yang disuplemenkan dengan 10% fetal bovine serum (FBS, Greiner), 4 m m Glutamax (Life Technologies), 100 U mL −1 penicillin (Life Technologies), 100 mg mL −1 streptomycin (Life Technologies), dan 10 m m nonesensial amino acids (Life Technologies), dan yang baru disuplemenkan dengan 0,1 m m 2-mercaptoethanol (Life Technologies), 1000 U mL −1 leukemia inhibitory factor (LIF, Life Technologies), 3 µ m CHIR99021 (penghambat GSK3β, Axon Medchem), dan 1 µ m PD0325901 (penghambat MEK/ERK, Sigma–Aldrich). Sel-sel tersebut disegarkan setiap dua hari sekali dan ditransfusikan pada hari ketiga. Sel-sel dipisahkan dengan 0,5 mL Accutase selama 3 menit dan disemai pada kepadatan 10.000 sel cm −2 , bersama dengan 0,5 µ m Y27632 (ROCKi).

Budaya XEn/EpiCs dalam Mikrowell yang Dibentuk Secara Termal
Protokol ini diadaptasi dari Shankar et al., 2023. [ 14 ] Media induksi Epi/XEn yang mengandung media N2B27 tingkat lanjut disiapkan sebagai berikut: 46,3% DMEM/F12 tingkat lanjut (Invitrogen), 46,3% Neurobasal (Invitrogen), suplemen N2 1% (Invitrogen), suplemen B27 2% (Invitrogen), 1% Glutamax, 1% Asam Amino Non-Esensial, 1,5% BSA (Sigma), 0,5% HEPES, 0,4% Natrium Piruvat, 3 µ m CHIR99021, 0,1 mm 2 -merkaptoetanol, 1 mm 8Br-cAMP, 25 ug mL −1 Fgf4, 1 ug mL −1 Heparin, 10 n m Asam retinoat, 1 µ m Y27632, 5% FBS, dan 1% Pen/Strep. 25 µL media ditambahkan ke semua sumur dan ditempatkan di dalam inkubator.

Untuk membuang sel yang mati, mESC dicuci dua kali dengan PBS, diikuti dengan perlakuan dengan 0,5 mL Accutase selama 3 menit. Sel-sel tersebut kemudian disentrifugasi pada 200 × g selama 5 menit, dan pelet yang dihasilkan disuspensikan kembali dalam 7 mL medium MEF yang terdiri dari DMEM (glukosa tinggi, yang dilengkapi dengan Sodium piruvat dan Glutamax) dan 15% FBS. Untuk penipisan MEF, suspensi sel pertama-tama disemai ke dalam labu T75 yang tidak dilapisi dan diinkubasi selama 20–30 menit agar MEF dapat menempel pada permukaan. Tanpa mengganggu sel-sel yang menempel, supernatan dikumpulkan dengan hati-hati, disentrifugasi lagi, dan pelet disuspensikan kembali dalam 1 mL medium N2B27 tingkat lanjut. Setelah penghitungan sel, suspensi disesuaikan dengan konsentrasi 160.000 sel mL −1 menggunakan medium XEn-ind, dan 50 µL suspensi ini ditambahkan ke tabung yang berisi 150 µL medium XEn-ind. Selanjutnya, 200 µL suspensi sel yang telah disiapkan dituang ke dalam setiap sumur dan diinkubasi untuk memungkinkan pengendapan sel.

Dalam semua percobaan penyaringan, senyawa ditambahkan ke media N2B27 tingkat lanjut yang dilengkapi dengan 0,2% β-Mercaptoethanol dan 1% Penicillin/Streptomycin. Media yang mengandung senyawa ditambahkan pada 48 jam dan diganti dengan media baru pada 72 jam. Untuk kondisi kontrol, 0,1% DMSO ditambahkan antara 48 dan 72 jam. Kultur dilanjutkan hingga 120 jam, setelah itu, struktur diproses untuk analisis lebih lanjut.

Fiksasi dan Pewarnaan
Pada 120 jam, struktur dicuci tiga kali dengan PBS dan difiksasi selama 30 menit pada suhu kamar menggunakan larutan fiksasi yang mengandung 2% paraformaldehid (PFA) dingin dan 0,1% glutaraldehida. Setelah fiksasi, sumur dicuci tiga kali dengan PBS dan diproses untuk pewarnaan lebih lanjut atau disimpan pada suhu 4 °C.

Untuk pewarnaan, struktur dipermeabilisasi dengan 0,1% Triton X-100 atau 1% Tween-20 selama 30 menit pada suhu kamar. Selanjutnya, sumur diperlakukan dengan Hoechst 33342 (1:300) dan Phalloidin-AF647 (1:300) dalam 0,1% Triton X-100 dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. Setelah inkubasi, sumur dicuci tiga kali dengan PBS dan disimpan pada suhu 4 °C atau dicitrakan menggunakan mikroskop.

Untuk pewarnaan caspase 3/7, sampel yang difiksasi terlebih dahulu dipermeabilisasi dengan 0,1% Triton-x 100 atau 1% Tween-20 selama 30 menit pada suhu RT, kemudian diblokir dengan buffer pemblokiran (2% BSA, 5% serum spesies AB ke-2 inang, 0,5% glisin, 0,1%, Triton-X100, 0,2% Tween20) selama 1 jam dan akhirnya diinkubasi dengan pengenceran 1: 400 antibodi primer Caspase 3/7 yang dibelah semalaman pada suhu 4°. Sampel dicuci dan diinkubasi dengan antibodi sekunder yang dikonjugasikan dengan AF647 bersama dengan Hoechst dan Phalloidin-AF568 selama 2 jam pada suhu kamar. Sampel dicuci 3x dengan 1x PBS dan disimpan.

Pencitraan
Pencitraan struktur dilakukan menggunakan mikroskop confocal cakram berputar sel hidup Nikon Ti-E terbalik, dilengkapi dengan sistem kontrol lingkungan dan unit cakram berputar CrestOptics X-Light V2. Untuk semua pengukuran otomatis, objektif udara 20x (CLWD, OD = 2,10 mm, NA = 0,5) digunakan. Untuk menangkap seluruh sumur, termasuk semua sumur mikro, modul ‘gambar besar’ digunakan untuk menghasilkan montase yang dijahit. Analisis gambar manual, termasuk pengukuran hasil dan area, dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak NIS dan ImageJ. Semua gambar diperoleh menggunakan pencitraan epi-fluoresensi dalam bidang fokus tunggal, dipilih kira-kira pada bidang di mana ukuran rongga maksimal. Bidang pencitraan ini dipilih berdasarkan asumsi bahwa sebagian besar struktur berbentuk bulat, dan rongga terbentuk di bidang pusat struktur ( Tabel 3 ).

Tabel 3. Daftar antibodi dan pewarnaan fluoresensi.

Pembuatan dan Penyiapan Pipeline CellProfiler — Morfometrik (Pengukuran Fitur Morfologi)
Analisis struktur 3D dilakukan menggunakan CellProfiler (CP) v4.2.6 dan CellProfiler Analyst (CPA) v3.0.4 (Broad Institute). Dalam setiap citra montase sumur, masing-masing struktur diidentifikasi sebagai objek yang berbeda, dan setiap objek dikuantifikasi untuk pengukuran fitur bruto, termasuk luas, ukuran, bentuk, tekstur, intensitas, dan distribusi intensitas. Fitur Zernike juga disertakan dalam analisis. Kuantifikasi dilakukan menggunakan modul ‘MeasureObjectArea,’ ‘MeasureObjectIntensity,’ ‘MeasureObjectIntensityDistribution,’ ‘MeasureObjectSizeShape,’ dan ‘MeasureTexture.’ Hasil pengukuran seluruh struktur diekspor ke dalam file basis data untuk digunakan dengan CPA dan ke dalam spreadsheet untuk analisis hilir lebih lanjut seperti yang digunakan dalam Shankar et al., 2023. [ 14 ] Semua file dan alur kerja dapat dibagikan berdasarkan permintaan.

Pembelajaran Mesin yang Diawasi
Untuk pelatihan algoritma klasifikasi yang dibantu pembelajaran mesin yang diawasi, struktur individual (atau objek) dalam setiap sumur dikategorikan secara manual ke dalam lima kelas berbeda berdasarkan fitur morfologi visual. Fitur-fitur ini mencakup keberadaan epiblast (Epi) berbentuk roset terpolarisasi, spesifikasi sel-sel Gata6-positif, epitelisasi sel-sel Gata6-positif, dan pembentukan rongga pro-amniotik di bagian tengah Epi. Dengan menggunakan kriteria visual ini, objek-objek secara manual ditetapkan ke kelas-kelas yang berbeda untuk menghasilkan kumpulan data pelatihan. Dalam percobaan penulis, ukuran kumpulan pelatihan berkisar antara 25 hingga 30 struktur per kelas. Proses pelatihan melibatkan evaluasi dan penilaian kumpulan data menggunakan algoritma pembelajaran mesin ‘fast-gentle boosting’, yang menghasilkan aturan klasifikasi berdasarkan pengukuran fitur bruto yang diperoleh dari CellProfiler. Setelah pelatihan yang diawasi, kinerja pengklasifikasi dinilai dalam hal akurasi, presisi, ingatan, dan skor F1, menghasilkan nilai masing-masing 85%, 84%, 76%, dan 80% untuk klasifikasi XEn/EpiC, ditunjukkan secara rinci dalam ref.[ 14 ]

Kuantifikasi Hasil Menggunakan CellProfiler Analyst
Data keluaran dari alur kerja CellProfiler diimpor ke CellProfiler Analyst (CPA), tempat modul pengklasifikasi digunakan untuk mengimplementasikan algoritma pembelajaran mesin terbimbing berdasarkan metode ‘fast-gentle boosting’. Algoritma ini menerapkan pengukuran fitur yang diperoleh dari CellProfiler untuk mengembangkan aturan klasifikasi untuk setiap fenotipe. Untuk memastikan konsistensi di berbagai putaran eksperimen, struktur tambahan ditambahkan secara bertahap ke set pelatihan untuk memantau dan meningkatkan akurasi prediksi. Setelah set pelatihan difinalisasi, set pelatihan diterapkan untuk menilai seluruh set data, yang mencakup semua kondisi perlakuan dan kontrol dengan replikasi (≈288 sumur per eksperimen, setiap sumur berisi ≈160 struktur; 160 × 288 = 46.080 struktur dianalisis). Modul klasifikasi ini memberikan keluaran kuantitatif yang mencerminkan hasil setiap kelas struktur berdasarkan pengukuran fitur bruto yang diekstraksi.

Selain itu, jalur tersebut dilatih secara serupa untuk mengklasifikasikan struktur yang menampilkan ruang delaminasi antara kompartemen XEn dan Epi, yang digunakan dalam mengidentifikasi struktur delaminasi pada perlakuan kafein.

Kuantifikasi Area Menggunakan CellProfiler
Aturan yang dihasilkan untuk setiap kelas fenotip setelah pelatihan dengan modul pengklasifikasi diimpor kembali ke jalur CP di bawah modul “Filter objek”, dan objek yang termasuk dalam setiap kelas dapat difilter per gambar. Luas kelas fenotip ‘XEn/EpiCs’ kemudian diukur menggunakan modul ‘MeasureObjectArea’.

Distribusi Intensitas Radial dan Koefisien Varians (RadialCV)
Alur kerja analisis gambar otomatis juga dapat mengukur distribusi intensitas radial (Gambar S7 , Informasi Pendukung) dengan mengelompokkan setiap objek (XEn/EpiCs atau struktur dalam sumur mikro) ke dalam empat bin radial. Intensitas fluoresensi sel positif Caspase 3/7 dikuantifikasi dalam setiap bin. Karena gambar 2D XEn/EpiCs sesuai dengan tiga kompartemen berbeda—PAC, Epi, dan XEn—bin radial ini memberikan representasi spasial dari setiap kompartemen. Oleh karena itu, intensitas radial dalam bin pertama akan mencerminkan kematian sel dalam PAC, sedangkan intensitas radial dalam bin ketiga akan mencerminkan kematian sel dalam Epi. Ukuran kematian sel dikuantifikasi melalui pengukuran koefisien varians (RadialCV) untuk setiap bin (Gambar S8 , Informasi Pendukung).

Pengujian ATP
Untuk pengukuran ATP, digunakan kit luminesensi CellTiter Glo 3D, yang mana reagen ditambahkan ke sampel yang dikumpulkan pada 72 jam setelah paparan senyawa perlakuan, dan pada 120 jam, setelah penyegaran dengan media baru. Pengukuran luminesensi dihitung berdasarkan petunjuk dari produsen. Jumlah ATP yang diukur berbanding lurus dengan jumlah sel hidup dalam sampel, yang memberikan informasi tentang efek sitotoksik dari berbagai senyawa.

Analisis Statistik
Semua data yang diperoleh dari CP yang terdiri dari rasio hasil diproses terlebih dahulu dengan mengubah rasio yang berbeda dari fenotipe yang diamati menjadi nilai persentase per percobaan menggunakan Microsoft Excel. Semua pengukuran area yang diperoleh dari CP langsung diimpor ke GraphPad Prism (v10.4.1) untuk analisis lebih lanjut. Semua data disajikan sebagai mean ± SD. Semua percobaan dilakukan dalam rangkap tiga, dengan setiap kondisi perlakuan menghasilkan hingga 169 struktur per ulangan. Ukuran sampel ( n ) untuk pengukuran hasil adalah ≈ 160 struktur. Untuk pengukuran area, XEn/EpiC disaring berdasarkan rasionya dalam seluruh populasi dan diukur untuk semua ulangan ( n = 3). Ukuran sampel untuk analisis statistik pengukuran area dapat berada dalam kisaran 80–120 struktur tergantung pada kondisi perlakuan. Dalam grafik, setiap titik mewakili satu XEn/EpiC. Semua pengujian hipotesis statistik dilakukan dengan menggunakan uji Dunnett; ∗ melambangkan P < = 0,05, ∗∗ melambangkan P < 0,01, ∗∗∗ melambangkan P < 0,001, dan ∗∗∗∗ melambangkan P < 0,0001 (ANOVA satu arah dengan uji pasca Dunnet).