Pengaruh Hipoksia pada Model Biomaterial Niche Perivaskular Sumsum Tulang

Abstrak
Nasib sel punca hematopoietik (HSC) dibentuk oleh lingkungan mikro yang berbeda yang disebut relung dalam sumsum tulang. Ketenangan, ekspansi, dan diferensiasi secara langsung dan tidak langsung diatur oleh kombinasi kompleks sekretom sel, interaksi sel-ke-sel, sinyal mekanis, dan faktor metabolik termasuk tegangan oksigen. Lingkungan perivaskular dalam sumsum tulang telah terlibat dalam memandu nasib HSC. Namun, sumsum tulang menghadirkan lingkungan yang hipoksia (≈1-4% O 2 ) relatif terhadap kondisi kultur sel tradisional, dan studi hipoksia in vitro menjadi rumit oleh kecepatan kondisi normoksik selama isolasi HSC menginduksi diferensiasi. Ada peluang unik untuk menggunakan model sumsum tulang yang direkayasa untuk menyelidiki dampak hipoksia yang ditentukan pada nasib HSC. Di sini, dampak terkoordinasi dari tegangan oksigen dan sekretom perivaskular pada sel punca dan progenitor hematopoietik (HSPC) murine diperiksa secara in vitro. Temuan ini menyoroti pentingnya mengurangi syok oksigen selama isolasi sel dalam model sumsum yang direkayasa. Kami melaporkan peralihan ke arah fenotipe Lineage − dengan kultur hipoksia, perluasan HSPC sebagai respons terhadap media terkondisi ceruk perivaskular, dan peningkatan pemeliharaan HSPC dalam model hidrogel sumsum tulang dalam kultur hipoksia ketika syok oksigen dikurangi selama isolasi menggunakan siklosporin A.

1 Pendahuluan
Sel punca hematopoietik (HSC) berada di sumsum tulang dan melalui proses hematopoiesis, menghasilkan sel darah dan sel imun lengkap yang dibutuhkan sepanjang hidup seseorang. [ 1 ] Sel ini jarang ditemukan di sumsum tulang dan diidentifikasi secara prospektif menggunakan flow cytometry. Umumnya, kompartemen sel punca dan sel progenitor hematopoietik (HSPC) diidentifikasi sebagai Lin − Sca-1 + c-Kit + , dan populasi ini biasanya disebut sebagai populasi LSK. [ 2 , 3 ] Kompartemen ini selanjutnya meliputi HSC yang berepopulasi jangka panjang, HSC yang berepopulasi jangka pendek, dan progenitor multipoten (LT-HSC, ST-HSC, dan MPP) yang dapat diidentifikasi secara fenotip melalui ekspresi CD150 dan CD48, dan secara fungsional berbeda dalam kapasitas pembaruan diri dan repopulasinya. [ 4 , 5 ] Meskipun tidak sepenuhnya dipahami, tampaknya HSC yang lebih mirip sel punca, seperti subfraksi CD150 + CD48 − CD41 − dikaitkan dengan tingkat ketenangan yang lebih tinggi. [ 4 , 6 ] Transplantasi HSC digunakan untuk menyembuhkan penyakit termasuk leukemia myeloid akut, penyakit sel sabit, dan banyak lainnya. [ 7 ] Sayangnya, sejumlah besar kekambuhan pasca-transplantasi terjadi ketika sel donor gagal untuk dicangkok, yang sering kali disebabkan oleh dosis sel yang rendah. [ 8 , 9 ] Salah satu kemungkinan jalan untuk mengurangi risiko ini adalah ekspansi sel punca pra-transplantasi untuk meningkatkan dosis sel yang diberikan. Sementara langkah-langkah signifikan telah dibuat baru-baru ini di bidang ini, [ 10 , 11 ] ekspansi tetap menjadi tantangan di bidang hematologi yang sangat bergantung pada kultur sel 2D konvensional. Pemahaman yang lebih baik tentang bagaimana HSC berinteraksi dengan dan diatur secara positif oleh lingkungan mikro sumsum tulang aslinya pada akhirnya dapat memberikan pengaruh ilmiah yang diperlukan untuk perluasan klinis HSC.

HSC telah diidentifikasi di beberapa lokasi unik sumsum tulang, disebut niche, yang menyediakan serangkaian sinyal matriks, seluler, dan biomolekuler yang memengaruhi pertumbuhan HSC, dormansi, dan spesifikasi garis keturunan. [ 12 ] Dua niche yang paling sering dinamai yang secara berbeda mendukung HSC adalah niche endosteal, yang proksimal ke permukaan bagian dalam tulang, dan niche perivaskular (PVN) yang kadang-kadang dibagi lagi menjadi niche periarteriolar dan perisinusoidal. [ 13 , 14 ] Sumsum tulang adalah jaringan hipoksia secara keseluruhan, dengan kadar oksigen bervariasi antara 1–4% tergantung pada lokasi, [ 15 ] dan dengan ketegangan oksigen tertinggi di dekat permukaan tulang dan arteriol, dan terendah di tengah sumsum dan dekat sinusoid. [ 15 , 16 ] Hipoksia niche diyakini memainkan peran penting dalam aktivitas HSC dengan membantu mempertahankan sebagian kecil HSC yang dorman melalui stabilisasi HIF-1α. [ 17 , 18 ] Pekerjaan yang diterbitkan oleh Broxmeyer Lab menunjukkan pentingnya ketegangan oksigen selama kultur sel dan selama isolasi sel, menemukan bahwa isolasi HSC di udara sekitar dengan konsentrasi oksigen tinggi dengan cepat menyebabkan syok/stres oksigen ekstrafisiologis (EPHOSS). [ 19 – 22 ] Di sini, isolasi normoksik menyebabkan peningkatan generasi spesies oksigen reaktif (ROS) dan aktivitas mitokondria, induksi pori transisi permeabilitas mitokondria (MPTP), dan diferensiasi HSC. Namun, fenotipe ini dapat dikurangi melalui isolasi semua-hipoksia yang rumit atau dengan menggunakan siklosporin A untuk menghambat siklofilin D, faktor kunci dalam induksi MPTP. Studi-studi ini menunjukkan bahwa isolasi HSC hipoksia (3% O 2 ) atau yang disuplemenkan siklosporin A dari sumsum tulang menghambat diferensiasi dan meningkatkan kemanjuran transplantasi pada tikus.

Sebagian besar model niche hematopoietik in vitro telah dilakukan dalam inkubator konvensional dengan ≈18% O2 [ 23 ] , yang jauh melebihi kadar oksigen fisiologis dalam sumsum tulang. Salah satu metode untuk mempelajari efek kadar oksigen rendah adalah dengan menggunakan pemicu kimia hipoksia. [ 24 ] Braham et al. menggunakan kobalt (II) klorida heksahidrat untuk menginduksi lingkungan hipoksia dan melihat penurunan proliferasi sel [ 25 ] tetapi tidak mengevaluasi penanda fenotipik respons HSPC. Yang lain menggunakan inkubator yang dikontrol oksigen (hipoksia): misalnya, Amiri et al. mengkultur bersama HSC manusia dengan sel punca mesenkimal Wharton jelly (WJ-MSC) dalam hipoksia versus normoksia. [ 26 ] Menariknya, bola-bola WJ-MSC yang dikultur bersama dengan HSC dalam kondisi hipoksia meningkatkan jumlah HSC dan sel-sel pemrakarsa kultur jangka panjang, meskipun efeknya tampaknya terutama didorong oleh bola-bola WJ-MSC daripada hipoksia. Araki et al. menunjukkan bahwa kultur hipoksia mengurangi ROS dan memungkinkan perluasan HSPC manusia yang lebih besar melalui ligan 1 mirip Delta dan pensinyalan Notch. [ 27 ] Akhirnya, Igarashi et al. menunjukkan perluasan selektif HSC dalam kultur hipoksia 2D. [ 28 ] Temuan-temuan ini memotivasi upaya-upaya untuk membuat model-model biomaterial sumsum tulang untuk memeriksa kombinasi hipoksia dan ceruk pada perluasan HSPC.

Kami sebelumnya telah mengembangkan model PVN sumsum tulang untuk kultur HSPC murine dalam hidrogel gelatin termetakrilat (GelMA). [ 29 , 30 ] Studi-studi ini meneliti peran media terkondisi PVN dan kultur bersama langsung dengan PVN yang direkayasa, menemukan faktor angiokrin yang berasal dari PVN meningkatkan retensi subset HSPC serta perluasan populasi sel hematopoietik yang berdiferensiasi terminal. Di sini, kami meneliti pengaruh hipoksia ekstraseluler dan faktor yang berasal dari PVN pada aktivitas HSPC. Pertama-tama kami meneliti bagaimana paparan hipoksia berkelanjutan (1,5% O 2 ) mengubah morfologi jaringan endotel serta sekretomnya. Kami kemudian menganalisis respons HSPC terhadap hipoksia dalam hidrogel 3D dengan atau tanpa media terkondisi dari model PVN yang direkayasa. Akhirnya, kami menggunakan siklosporin A untuk mengurangi efek EPHOSS selama isolasi HSC dan menyelidiki dampak paparan hipoksia berkelanjutan dan sekretom perivaskular pada nasib HSPC dalam model GelMA sumsum tulang. Upaya ini berupaya untuk menentukan pentingnya mediasi EPHOSS serta peran sinyal metabolik dan biomolekuler dari lingkungan mikro vaskular sumsum tulang selama studi in vitro perluasan HSC.

2 Bahan dan Metode
2.1 Kultur Sel
Sel endotel primer yang berasal dari sumsum tulang belakang tikus (BMEC) dibeli dari Cell Biologics (Chicago, IL), dan sel punca mesenkimal tikus (MSC) dari Cyagen (Santa Clara, CA). BMEC dikultur dalam medium sel endotel tikus lengkap yang terdiri dari 5% FBS, EGF, hidrokortison, VEGF, ECGS, heparin, l-glutamin, dan larutan antibiotik-antimikotik (Cell Biologics). MSC dikultur dalam medium pertumbuhan MSC tikus dengan 10% FBS (Cyagen). Sel dikultur dalam 5% CO 2 pada suhu 37° C. BMEC digunakan pada tahap 7 dan MSC digunakan pada tahap 10 sesuai dengan petunjuk pemasok.

2.2 Pembentukan dan Karakterisasi Hidrogel Gelatin Metakrilat
Gelatin Tipe A dengan Kekuatan Bloom 300 (Sigma–Aldrich, St. Louis, MO) difungsionalkan dengan gugus metakrilamida seperti yang dijelaskan sebelumnya. [ 29 , 31 ] Secara singkat, anhidrida metakrilat ditambahkan tetes demi tetes ke dalam larutan gelatin dan penyangga karbonat-bikarbonat pada pH 9–10 [ 32 ] . Setelah satu jam, reaksi dihentikan dengan menambahkan air deionisasi (DI) hangat. pH diperiksa untuk memastikannya berada di antara 6–7, kemudian larutan gelatin didialisis terhadap air DI selama satu minggu dan dikeringkan dalam keadaan beku. Rasio gelatin:MA diubah untuk mengendalikan derajat fungsionalisasi (DOF) dan dikuantifikasi dengan 1 H NMR seperti yang dijelaskan sebelumnya. [ 31 ] Untuk penelitian ini, GelMA dengan DOF 63% relatif terhadap puncak fenilalanin digunakan untuk semua percobaan (Gambar S1A , Informasi Pendukung). Hidrogel dibentuk dengan melarutkan GelMA pada 5wt.% dalam PBS pada suhu 65° C, dengan 0,1% b/v litium asilfosfinat (LAP) sebagai fotoinisiator. Larutan prepolimer dipipet ke dalam cetakan Teflon melingkar dengan diameter 5 mm dan ketebalan 1 mm untuk percobaan kultur sel, kemudian diekspos ke sinar UV (λ = 365 nm, 7,1 mW cm −2 ) selama 30 detik.

Kekakuan hidrogel diukur dengan kompresi tak terbatas pada Sistem Pengujian Universal Instron 5943 (Instron, Norwood, MA) seperti yang dijelaskan sebelumnya. [ 33 ] Secara singkat, hidrogel dikompresi pada laju 0,1 mm min −1 , dan modulus dihitung menggunakan kode MATLAB khusus. [ 34 ] Modulus diperkirakan dari kecocokan dengan rezim viskoelastis linier regangan 0–15% di luar offset awal 2,5% di atas lantai kebisingan. [ 35 ]

2.3 Pembentukan Jaringan Endotel pada Hipoksia atau Normoksia
Jaringan endotel dibentuk dengan mengkokultur BMEC dan MSC dalam rasio 2:1 (BMEC:MSC) dengan total kepadatan sel 2×106 sel mL −1 . Sel disuspensikan kembali dalam larutan prepolimer, dipipet ke dalam cetakan Teflon, dan difotopolimerisasi seperti dijelaskan di atas. Hidrogel dikultur selama 7 hari dalam campuran 1:1 media endotel dan media StemSpan SFEM HSC (Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Kanada) dengan tambahan 50 ng mL −1 VEGF dengan perubahan media parsial (volume 2/3) setiap hari, menyisakan ≈250 µL media untuk memungkinkan faktor yang disekresikan sel tetap berada dalam kultur. Media diseimbangkan semalaman di stasiun kerja fisiologis InVivO2 (Baker Ruskinn, Sanford, ME) atau inkubator kultur sel konvensional untuk menyeimbangkan dengan kadar oksigen yang sesuai. Gel hipoksia dibuat pada saat yang sama dengan gel normoksia, kemudian dipindahkan ke inkubator hipoksia yang diatur ke 1,5% O 2 , 5% CO 2 , dan 37 ° C.

2.4 Pewarnaan Imunofluoresensi Jaringan Sel Endotel
Hidrogel difiksasi dalam formalin (Sigma Aldrich) dan dicuci dengan PBS. Gel kemudian diblokir dalam PBS dengan 2% bovine serum albumin (BSA, Sigma–Aldrich) dan 0,1% Tween 20 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Sel diwarnai dengan antibodi primer semalaman pada suhu 4 °C (Tabel S1 , Informasi Pendukung), kemudian dicuci dan diinkubasi dengan antibodi sekunder semalaman pada suhu 4 °C seperti yang dijelaskan sebelumnya. [ 30 , 36 , 37 ] Gel kemudian direndam dalam PBS dengan 0,5% Tween 20 untuk permeabilisasi sel yang dienkapsulasi. Hoechst 33 342 (Invitrogen) ditambahkan sebagai pewarna tandingan pada 1:2000 dalam PBS selama 30 menit setelah pewarnaan sekunder. PBS dengan 0,1% Tween-20 digunakan untuk mencuci di semua langkah setelah permeabilisasi.

2.5 Akuisisi dan Analisis Gambar
Gambar jaringan endotel yang digunakan untuk analisis karakteristik morfologi diperoleh dengan mikroskop confocal cakram berputar DMi8 Yokogawa W1 yang dilengkapi dengan kamera digital Hamamatsu EM-CCD (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL). Tumpukan Z diperoleh dengan kedalaman 200 µm dan ukuran langkah 5 µm. Enam daerah dicitrakan per gel, dan tiga gel dianalisis per kondisi. Jaringan dikuantifikasi untuk metrik panjang jaringan total, dan jumlah cabang dan persimpangan, menggunakan jalur komputasi yang ditetapkan sebelumnya yang diimplementasikan dalam ImageJ dan MATLAB. [ 30 , 38 , 39 ] Singkatnya, plugin khusus di ImageJ memfilter dan membinerisasi tumpukan z sehingga pembuluh diekstraksi dari gambar. Di MATLAB, pembuluh diskeletonisasi dan kemudian diubah menjadi jaringan nodal yang dapat dikuantifikasi. Karena pendekatan ini menghasilkan kerangka 3D dari semua pembuluh dalam volume eksperimen, pendekatan ini mampu secara akurat mengungkap jumlah cabang dan segmen pembuluh. [ 40 ] Deposisi dan kolokalisasi protein divisualisasikan menggunakan mikroskop confocal multifoton Zeiss LSM710 atau mikroskop confocal Zeiss LSM880 Airyscan. Untuk analisis tumpang tindih dan cakupan areal, tumpukan-z dibinerisasi dan dikompresi menjadi proyeksi intensitas maksimum menggunakan ImageJ, lalu dianalisis menggunakan kode MATLAB kustom. [ 29 , 39 ] Fraksi tumpang tindih antara CD31 dan podoplanin didefinisikan sebagai fraksi area CD31 + (pembuluh) yang juga merupakan podoplanin + saat gambar ditumpangkan.

2.6 Susunan Sitokinin
Media yang dikondisikan dikumpulkan pada hari ke-7 dari kondisi jaringan endotel hipoksia dan normoksia. Proteome Profiler Mouse Angiogenesis Cytokine Array (R&D Systems, Minneapolis, MN) digunakan untuk mengidentifikasi apa yang disekresikan oleh kultur bersama jaringan endotel. Setiap array diinkubasi dengan 1 mL media yang dikondisikan, dan membran dicitrakan dengan ImageQuant 800 (Cytiva, Marlborough, MA) menggunakan chemiluminescence dan waktu pencahayaan 4 menit. Gambar dianalisis menggunakan plugin profil mikroarray di ImageJ untuk mengukur kepadatan titik-titik yang terintegrasi. Pengukuran dikurangi dengan latar belakang, dan kemudian dinormalisasi ke titik kontrol positif.

2.7 Isolasi Sel Punca dan Sel Progenitor Hematopoietik Normoksik, yang Ditambahkan Siklosporin A, dan Hipoksia
Semua pekerjaan yang menggunakan sel primer dilakukan di bawah protokol kesejahteraan hewan yang disetujui (Protokol Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional #23 033, Universitas Illinois Urbana-Champaign). LSK murine diisolasi dari tikus C57BL/6 betina berusia 4–8 minggu (Laboratorium Jackson, Bar Harbor, ME) seperti yang dijelaskan sebelumnya. [ 33 ] Secara singkat, tibiae dan femora dikeluarkan dan dihancurkan menggunakan alu dan lumpang untuk membebaskan sel dari sumsum tulang. Campuran sel diperkaya terlebih dahulu menggunakan buffer lisis sel darah merah 1X (Biolegend, San Diego, CA) diikuti oleh pengayaan negatif garis keturunan hematopoietik menggunakan EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit Stemcell Technologies). Sel kemudian diwarnai untuk penanda garis keturunan, Sca-1, dan c-Kit (Tabel S2 , Informasi Pendukung) dan disortir melalui penyortiran sel yang diaktifkan oleh floresensi menggunakan Bigfoot Spectral Cell Sorter (Invitrogen).

2.8 Kultur Sel Punca Hematopoietik pada Hipoksia versus Normoksia
Untuk studi tentang efek hipoksia dan media terkondisi PVN pada sel punca, LSK dienkapsulasi dalam hidrogel GelMA seperti yang dijelaskan sebelumnya, [ 41 ] dengan 4500–6000 LSK/gel. Hidrogel dipertahankan dalam pelat 24 sumur selama 4 hari dengan penggantian media pada hari ke-2. Media merupakan campuran 50:50 media terkondisi yang dikumpulkan dari kultur hidrogel PVN dan Stemspan SFEM (Stemcell Technologies) dengan konsentrasi akhir 100 ng mL −1 SCF (Peprotech, Cranbury, NJ) dan 0,1% penisilin/streptomisin (PS, Gibco, Waltham, MA), atau media kontrol Stemspan SFEM dengan 100 ng mL −1 SCF dan 0,1% penisilin-streptomisin. Gel kemudian dikulturkan dalam inkubator kultur sel normal dengan oksigen sekitar (≈18%) dan 5% CO 2 , atau stasiun kerja fisiologis InVivO 2 dengan kadar O 2 1,5% dan CO 2 pada 5%.

Pada hari ke-4, hidrogel dilarutkan menggunakan 50 unit mL −1 kolagenase tipe IV (Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, NJ) pada pengocok dalam inkubator pada suhu 37 °C selama 20 menit, dengan pencampuran lembut dengan pipet. Kolagenase dipadamkan dengan 1 mL PBS + 5% FBS dan disentrifugasi pada 300 rcf x 5 menit. Pelet yang dikumpulkan disuspensikan kembali dalam PBS + 5% FBS dan diwarnai dengan koktail antibodi (Tabel S3 , Informasi Pendukung) untuk membedakan HSC yang berepopulasi jangka panjang (LT-HSC: CD150 + CD48 − LSK) dan HSC yang berepopulasi jangka pendek (ST-HSC: CD150 − CD48 − LSK), dan progenitor multipoten (MPP: CD150 +/− CD48 + LSK). [ 42 , 43 ] Setelah pewarnaan, sel difiksasi dan dipermeabilisasi dengan Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (Invitrogen). Sel disuspensikan kembali dalam PBS + 5% FBS dan dianalisis menggunakan FACSymphony A1 flow cytometer (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Kontrol fluoresensi minus satu (FMO) dibuat dengan mengisolasi sel sumsum tulang yang diperkaya Lin − sesuai dengan protokol isolasi sel primer yang dijelaskan di atas.

2.9 Statistik
Normalitas data ditentukan menggunakan uji Shapiro-Wilkes, [ 44 , 45 ] dan homoskedastisitas menggunakan uji Brown-Forsythe [ 46 , 47 ] pada tingkat signifikansi 0,05. Untuk eksperimen dengan dua kelompok, uji t dua sampel Student dilakukan, atau sebagai alternatif uji Mann–Whitney U digunakan sebagai alternatif nonparametrik jika normalitas dan homoskedastisitas tidak terpenuhi. Untuk eksperimen faktorial 2×2, uji ANOVA 2 arah digunakan jika normalitas dan homoskedastisitas terpenuhi, diikuti dengan uji Perbedaan Signifikan Jujur Tukey untuk membandingkan kelompok. Ketika kondisi tersebut tidak terpenuhi, uji Kruskal–Wallis digunakan untuk mengevaluasi efek utama, dan uji Jumlah Peringkat Wilcoxon Berpasangan digunakan untuk membandingkan kelompok. Koreksi Benjamini & Hochberg diterapkan untuk uji statistik yang membandingkan beberapa kelompok. [ 48 ] Semua pengujian dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak statistik R. Sejumlah replikasi (nilai n) dilaporkan dalam keterangan gambar. Grafik dibuat dalam R, dan grafik batang menunjukkan nilai rata-rata ± kesalahan standar rata-rata (SEM) kecuali dinyatakan lain. Signifikansi statistik faktor dalam ANOVA 2 arah atau analisis Kruskal–Wallis dilaporkan di sudut kanan atas setiap plot, dan signifikansi antara masing-masing kelompok ditunjukkan pada plot sebagai berikut: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Jika tidak dinyatakan lain, pengaruh faktor dan perbedaan antara masing-masing kelompok tidak signifikan secara statistik.

3 Hasil
3.1 Pembentukan Jaringan Endotel Primer pada Hipoksia dan Normoksia
Kami pertama kali memeriksa kemampuan BMEC dan MSC murine untuk membentuk jaringan endotel dalam kondisi normoksia dan hipoksia standar: ≈18% [ 23 ] dan 1,5% oksigen, masing-masing ( Gambar 1A ). Semua hidrogel yang digunakan dalam penelitian ini memiliki kekakuan 2,64 ± 0,28 kPa (Gambar S1B , Informasi Pendukung), konsisten dengan sumsum tulang (0,25–24,7 kPa [ 49 ] ). Eksperimen sebelumnya yang dilakukan dengan sistem serupa telah mengungkapkan bahwa kultur perivaskular terbentuk melalui jaringan dalam 7 hari. [ 29 , 39 ] Dalam penelitian ini, kami juga menemukan bahwa kultur 7 hari cukup untuk membentuk jaringan yang kuat. Proyeksi intensitas maksimum untuk sel CD31 + mengungkapkan jaringan PVN dalam normoksia dan hipoksia (Gambar 1B ). Sementara kultur hipoksia menginduksi jaringan dengan panjang total yang lebih rendah, lebih sedikit pembuluh, dan lebih sedikit titik cabang (Gambar 1C–E , Tabel S4 , Informasi Pendukung) pada hari ke-7, panjang cabang rata-rata serupa untuk kultur normoksik dan hipoksia, yang menunjukkan blok pembangun pembuluh yang serupa terlepas dari ketegangan oksigen (Gambar 1F ). Tidak mengherankan, aktivitas metabolik komposit jaringan endotel menunjukkan pengurangan 28% yang signifikan ( p < 0,001) dalam kondisi hipoksia versus normoksik (Gambar 1G ).

Gambar 1
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
A) Skema eksperimen yang menggambarkan pembentukan gel PVN. B) Pewarnaan CD31 pada hari ke-7 menunjukkan pembentukan jaringan dalam kultur bersama EC-MSC tikus yang tumbuh dalam kondisi hipoksia versus normoksia. Skala batang 200 µm. Diagram batang menunjukkan C) panjang jaringan total, D) kerapatan titik cabang, E) kerapatan jaringan, dan F) panjang cabang rata-rata untuk jaringan yang dikulturkan dalam kondisi hipoksia dan normoksia. N = 6 gel untuk studi morfologi. G) Aktivitas metabolik dinilai menggunakan uji alamarBlue. N = 9 gel. * menunjukkan p < 0,05; ** menunjukkan p < 0,01; *** menunjukkan p < 0,001.
Kami kemudian memvisualisasikan ekspresi dan/atau pengendapan protein yang terkait dengan sel-sel mesenkimal dan endotel di sumsum tulang asli. Awalnya, kami bertujuan untuk membedakan sel-sel endotel arteriol dan sinusoidal dengan ekspresi Sca-1 dan podoplanin (podoplanin). [ 50 ] Meskipun kami tidak mengamati pewarnaan bersama sel-sel endotel CD31 + dengan podoplanin atau Sca-1, kami mengamati pewarnaan kuat MSC dengan podoplanin ( Gambar 2A ); lebih lanjut, kami tidak mengamati perbedaan dalam tumpang tindih sel-sel EC CD31 + dengan MSC podoplanin + dalam normoksia atau hipoksia. Jaringan menunjukkan laminin, molekul matriks ekstraseluler penting yang diperkaya di dinding yang melapisi sel-sel endotel [ 51 ] ; kadar laminin pada hari ke-7 masih rendah tetapi secara kualitatif lebih tinggi dalam normoksia (Gambar S2B , Informasi Pendukung). Terakhir, jaringan yang diwarnai untuk protein sambungan ketat Occludin dan zonula okludens 1 (ZO-1) menunjukkan jumlah ZO-1 yang cukup besar terlepas dari tekanan oksigen, yang menunjukkan pematangan awal jaringan PVN dalam hidrogel GelMA (Gambar 2C–E ).

Gambar 2
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
A) Contoh gambar jaringan PVN yang diwarnai untuk CD31, podoplanin, dan Nukleus. B) Tumpang tindih fraksional (skala 0 hingga 1) antara CD31 dan podoplanin disajikan sebagai ukuran kolokalisasi. C) Contoh gambar jaringan PVN yang diwarnai untuk CD31, Okludin, ZO-1, dan Nukleus. Barplot berikutnya mengukur pengendapan D) Okludin dan E) ZO-1. Untuk setiap kondisi, 3 gambar diambil untuk mengkarakterisasi masing-masing dari N = 3 gel sebelum perbandingan analitis. Barplot mewakili mean ± SEM.
3.2 Sekresi Sitokin Terkait Angiogenesis dan Hematopoiesis
Media terkondisi dari hidrogel PVN yang dipertahankan dalam hipoksia mengandung banyak sitokin yang terkait dengan pembentukan pembuluh darah serta regulasi HSC ( Gambar 3 ). Sebagian besar faktor diekspresikan lebih tinggi dalam kultur normoksik dibandingkan dengan kultur hipoksia. CXCL12, pengatur kuat pemeliharaan dan retensi HSC dalam sumsum tulang, diekspresikan lebih tinggi dalam kondisi normoksik. Kami juga mengamati peningkatan faktor pertumbuhan hepatosit (HGF), faktor yang terlibat dalam pemeliharaan HSC, dalam kultur normoksik. Menariknya, osteopontin, faktor yang diketahui mendorong ketenangan HSC, diekspresikan lebih tinggi dalam kultur hipoksia. Faktor lain yang diekspresikan lebih tinggi dalam hipoksia termasuk IGFBP-3, MCP-1, dan MMP3. Karena sebagian besar perbedaan yang diamati antara sekretom yang dikultur normoksik dan hipoksia relatif kecil, jaringan normoksik lebih luas, dan karena CXCL12 diatur ke atas dalam media yang dikultur normoksik, kami melanjutkan dengan media PVN yang dikultur normoksik dalam percobaan berikutnya.

Gambar 3
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Ekspresi relatif sitokin yang terdeteksi yang disekresikan dari BMEC dan MSC yang dienkapsulasi dalam gel GelMA dalam kondisi normoksik dan hipoksia. Data dinormalisasi ke titik referensi. Analisis dilakukan pada N = 2 kelompok media terkondisi normoksik dan N = 2 kelompok media terkondisi hipoksia dengan pengukuran duplikat yang dilakukan pada setiap membran. Plot menunjukkan rata-rata ± standar error dari rata-rata. Lipatan perubahan ekspresi dilaporkan di atas setiap pasangan kondisi sebagai Hipoksik / Normoksik.
3.3 Kultur HSPC dalam Hipoksia dengan Media Terkondisi PVN
LSK murine kemudian dienkapsulasi dalam hidrogel GelMA dan dikultur dalam normoksia atau hipoksia dengan atau tanpa media terkondisikan dari kultur perivaskular ( Gambar 4A ). Pekerjaan sebelumnya telah menunjukkan kemampuan untuk mengkarakterisasi keputusan nasib HSC dalam menanggapi kondisi kultur berbasis biomaterial hanya dalam 4 hari. [ 29 , 41 , 52 ] Akibatnya, untuk pekerjaan ini sel hematopoietik yang dienkapsulasi dianalisis melalui flow cytometry setelah 4 hari kultur untuk mengukur respons jangka pendek terhadap hipoksia dan sinyal angiokrin. Penggabungan media PVN memiliki dampak signifikan pada ekspansi sel dan komposisi fenotipik kompartemen HSPC. Ketika dikultur dengan media PVN, jumlah total sel menjadi dua kali lipat untuk kultur normoksik dan hipoksia (Gambar 4B ). Sementara kultur hipoksia umumnya kurang berdampak daripada media PVN, kultur hipoksia menyebabkan pergeseran ke arah peningkatan sel Lin − (lebih primitif) (Gambar 4C ). Memeriksa perluasan relatif fraksi sel Lin − versus Lin + (hari ke-4 vs awal), kedua populasi menunjukkan peningkatan yang signifikan sebagai respons terhadap media terkondisi PVN (Gambar 4D,E ). Memeriksa fraksi HSPC, kami mengamati efek yang lebih besar dari media PVN. Di sini, kami mengamati peningkatan perubahan lipat 2,70x dan 3,19x dalam kultur normoksik dan hipoksia, masing-masing, sebagai respons terhadap media PVN (Gambar 4F ) serta pergeseran fenotipik dalam kompartemen HSPC (Gambar 4G–I ). Sementara fraksi LT-HSC tidak terpengaruh, fraksi ST-HSC berkurang dan fraksi MPP meningkat. Penting untuk dicatat bahwa dampak pada ST-HSC dan MPP ini disebabkan oleh tingkat perluasan populasi yang berbeda dan bukan oleh hilangnya ST-HSC (Gambar S3 A—C, Informasi Pendukung).

Gambar 4
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
A) Skema eksperimen menggambarkan kondisi kultur oksigen dan media yang diuji. Barplot melaporkan mean ± SEM pada hari ke-4 dari jumlah HSPC dan distribusi sebagai fungsi dari tegangan oksigen dan media sebagai berikut: B) sel; C) fraksi sel Lin − , D) sel Lin − dinormalisasi ke jumlah sel awal, E) sel Lin + dinormalisasi ke jumlah sel awal, F) LSK dinormalisasi ke jumlah sel awal, G) LT-HSC sebagai fraksi kompartemen LSK, H) ST-HSC sebagai fraksi kompartemen LSK, dan I) MPP sebagai fraksi kompartemen LSK. Jumlah awal sel adalah 6000. N = 5 gel untuk kondisi Hipoksia/Kontrol; N = 4 gel untuk semua kondisi lainnya. Signifikansi faktor dalam Kruskal-Wallis atau ANOVA 2 arah dilaporkan di sudut kanan atas setiap plot. * menunjukkan p < 0,05 antara masing-masing kelompok. Jika tidak dinyatakan sebaliknya, pengaruh faktor dan perbedaan antara kelompok individu tidak signifikan secara statistik.
3.4 Mitigasi Syok Oksigen dan Kultur Sel Punca dan Sel Progenitor Hematopoietik pada Hipoksia
Setelah mengamati dampak terbatas hipoksia pada fenotipe HSPC, kami berhipotesis bahwa EPHOSS yang dialami selama isolasi HSPC dapat menutupi efek kultur hipoksia karena paparan oksigen singkat pun dapat mengubah fenotipe dan ekspansi HSPC. Untuk menguji hipotesis ini, kami mengisolasi HSPC dengan dan tanpa buffer yang dimuat siklosporin A, dan kemudian melakukan kultur GelMA dalam kondisi normoksik dan hipoksia ( Gambar 5A ). Di sini, kultur hipoksia secara signifikan meningkatkan ekspansi sel (Gambar 5B ) terutama untuk HSPC yang diisolasi dengan siklosporin A untuk menekan syok oksigen. Keseimbangan sel Lin − dan Lin + pada akhir kultur bergeser ke arah Lin − ketika sel dikultur dalam hipoksia (Gambar 5C ) – sekali lagi, dengan efek yang lebih besar pada sel yang diisolasi dengan siklosporin A. Ekspansi sel Lin − sangat meningkat dengan kultur hipoksia untuk HSPC yang diisolasi dengan siklosporin A (Gambar 5D ). Isolasi siklosporin A juga sedikit meningkatkan ekspansi Lin + dalam kondisi hipoksia (Gambar 5E ).

Gambar 5
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
A) Skema eksperimen menggambarkan kondisi isolasi dan kultur oksigen yang diuji. Barplot melaporkan mean ± SEM pada hari ke-4 dari jumlah HSPC dan distribusi sebagai fungsi dari tegangan oksigen dan buffer isolasi sebagai berikut: B) sel; C) fraksi sel Lin − , D) sel Lin − dinormalisasi ke jumlah sel awal, E) sel Lin + dinormalisasi ke jumlah sel awal, F) LSK dinormalisasi ke jumlah sel awal, G) LT-HSC sebagai fraksi kompartemen LSK, H) ST-HSC sebagai fraksi kompartemen LSK, dan I) MPP sebagai fraksi kompartemen LSK. Jumlah awal sel adalah 6000. N = 5 gel untuk semua kondisi. Signifikansi faktor dalam Kruskal-Wallis atau ANOVA 2 arah dilaporkan di sudut kanan atas setiap plot. * menunjukkan p < 0,05 antara masing-masing kelompok. Jika tidak diindikasikan sebaliknya, efek faktor dan perbedaan antara masing-masing kelompok tidak signifikan secara statistik.
Yang menarik, isolasi siklosporin A yang dipasangkan dengan kultur hipoksia menyebabkan peningkatan signifikan dalam jumlah LSK selama kultur (Gambar 5F ). Karena komposisi fraksional kompartemen HSPC tidak terpengaruh (Gambar 5G–I ), peningkatan LSK setelah isolasi siklosporin A dan kultur hipoksia dikaitkan dengan peningkatan jumlah absolut LT-HSC, ST-HSC, dan MPP (Gambar S4 A—C, Informasi Pendukung).

3.5 Dampak Terkoordinasi Hipoksia dan Media Pengkondisian Niche Perivaskular dengan Isolasi Siklosporin A
Setelah menunjukkan pentingnya mitigasi EPHOSS selama isolasi HSC, kami meneliti efek hipoksia dan medium terkondisi PVN pada HSPC yang diisolasi dengan siklosporin A untuk mengurangi EPHOSS ( Gambar 6A ). Di sini, medium terkondisi PVN menginduksi ekspansi sel yang signifikan (Gambar 6B ). Kultur hipoksia menggeser komposisi fraksional sel ke arah fenotipe Lin − (Gambar 6C,D ), sementara penggabungan medium terkondisi PVN sangat meningkatkan ekspansi sel Lin + (Gambar 6E ). Kami juga mengamati efek hipoksia yang serupa pada HSPC yang diisolasi dengan siklosporin A yang dikultur dalam media kontrol, dengan peningkatan (p = 0,088) dalam jumlah LSK untuk sel yang diisolasi dengan siklosporin A, dikultur dalam kondisi hipoksia dibandingkan dengan sel yang dikultur dalam kondisi normoksia (Gambar 6F ), sementara perbandingan subpopulasi dalam kompartemen LSK terhalang oleh jumlah sel yang rendah (Gambar 6G–I ).

Gambar 6
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
A) Skema eksperimen menggambarkan kondisi kultur oksigen dan media yang diuji setelah isolasi dengan siklosporin A. Grafik batang melaporkan rerata ± SEM pada hari ke-4 jumlah HSPC dan distribusi sebagai fungsi dari tegangan oksigen dan media setelah isolasi dengan penyangga yang mengandung siklosporin A: B) sel; C) fraksi sel Lin − , D) sel Lin − dinormalisasi ke jumlah sel awal, E) sel Lin + dinormalisasi ke jumlah sel awal, F) LSK dinormalisasi ke jumlah sel awal, G) LT-HSC sebagai fraksi kompartemen LSK, H) ST-HSC sebagai fraksi kompartemen LSK, dan I) MPP sebagai fraksi kompartemen LSK. Jumlah awal sel adalah 4500. N = 5 gel untuk gel yang dikultur hipoksia; N = 4 gel untuk gel yang dikultur normoksia. Signifikansi faktor dalam Kruskal–Wallis atau ANOVA 2 arah dilaporkan di sudut kanan atas setiap grafik. * menunjukkan p < 0,05 antara masing-masing kelompok. Jika tidak dinyatakan sebaliknya, pengaruh faktor dan perbedaan antara masing-masing kelompok tidak signifikan secara statistik.

4 Diskusi
Dalam penelitian ini, kami meneliti efek kadar oksigen yang relevan secara fisiologis pada pembentukan pembuluh darah sumsum tulang dan efek hipoksia serta media yang dikondisikan PVN pada perluasan HSPC murine. Kami menemukan bahwa media yang dikondisikan PVN memberikan sinyal yang kuat untuk memengaruhi perluasan HSPC dan diferensiasi yang menguntungkan. Khususnya, kami mengamati efek kultur hipoksia pada HSPC sebagian besar dikaburkan oleh kondisi isolasi HSPC, dan bahwa isolasi menggunakan metode untuk mengurangi EPHOSS yang terkait dengan oksigen penting untuk studi in vitro tentang nasib HSC.

Kami pertama kali meneliti pembentukan jaringan PVN 3D dalam hidrogel gelatin menggunakan BMEC dan MSC murine. Perbandingan kuantitatif pembentukan jaringan dalam kondisi hipoksia versus normoksia menunjukkan panjang jaringan total, kepadatan pembuluh, dan kepadatan titik cabang yang lebih rendah dalam kultur hipoksia. Sementara hipoksia dapat menginduksi peningkatan regulasi gen terkait angiogenesis, efeknya tidak terlihat dalam kultur hidrogel jangka pendek. Pekerjaan yang sedang berlangsung sedang meneliti profil ekspresi dari kumpulan gen angiogenik yang lebih besar (VEGF, Angiopoietin-1, Tie2, PDGFβ) serta kemungkinan menambahkan faktor eksogen untuk lebih meningkatkan aktivitas angiogenik. Namun, pemeriksaan literatur yang lebih dekat mengungkapkan sebuah studi oleh Gawlitta et al. yang mencoba untuk melakukan prevaskularisasi konstruksi tulang sebelum implantasi dalam kondisi oksigen rendah (5%) yang juga menunjukkan pembentukan jaringan yang berkurang. [ 53 ] Di sini, pelet sel pembentuk koloni endotel dan sel stroma multipoten gagal membentuk struktur prevaskular dalam kondisi hipoksia, tetapi menunjukkan pembentukan yang kuat dalam kondisi normoksia. Mereka berhipotesis bahwa sementara hipoksia adalah penginduksi kuat angiogenesis (pembentukan pembuluh darah baru dari pembuluh yang ada), itu mungkin tidak memberikan dukungan metabolik yang cukup untuk mendorong vasculogenesis yang efektif (pembentukan jaringan vaskular de novo). Mereka juga berhipotesis bahwa karena ukuran besar cluster dan batas difusi, sel-sel di pusat konstruksi normoksik dapat mengalami hipoksia, sementara mereka yang dalam kondisi hipoksia akan mengalami kadar oksigen yang lebih rendah. Pekerjaan ini berbeda dari penelitian kami karena mereka mengandalkan cluster sel 3D daripada perancah atau hidrogel; namun, transportasi difusif dalam hidrogel 3D juga dapat lebih lanjut mengurangi oksigen dan ketersediaan molekul kecil dalam model PVN kami, [ 30 , 41 ] terutama saat sel berkembang biak hingga kepadatan tinggi dan mengonsumsi lebih banyak oksigen. Dalam pekerjaan sebelumnya, kami telah menemukan bahwa panjang jaringan, jumlah pembuluh, dan jumlah cabang bergantung pada kepadatan penyemaian awal. [ 29 ] Kami mempertahankan kepadatan penyemaian tetap dalam studi ini, tetapi tekanan oksigen mungkin telah mengubah laju proliferasi dan sebagai akibatnya, memengaruhi jaringan endotel yang dihasilkan. Aktivitas metabolik pada hari ke-7 dari kultur perivaskular kami menunjukkan sel-sel yang dipertahankan dalam hipoksia memiliki aktivitas metabolik yang jauh lebih rendah, yang mungkin disebabkan oleh jumlah sel yang lebih sedikit atau jumlah sel yang kurang aktif yang sama. Studi lebih lanjut akan diperlukan untuk menentukan kasus mana yang lebih akurat, seperti melalui kuantifikasi jumlah total sel pada hari ke-7 dalam setiap kultur atau pemeriksaan aktivitas proliferasi sel dalam model PVN melalui analisis imunofluoresensi Ki67 atau aktivitas EdU. [ 54 , 55 ]

Sinyal kuat podoplanin pada MSC dalam studi ini akan berguna untuk visualisasi jaringan dalam studi mendatang. Podoplanin terutama diekspresikan pada beberapa jenis sel stroma mesenkimal, [ 56 ] dan penting untuk perkembangan dan fungsi beberapa jaringan, struktur termasuk paru-paru, jantung, dan jaringan limfatik. Protein ini juga telah dipelajari sebagai biomarker kanker dan sebagai penanda peningkatan transisi epitel-mesenkimal yang terkait dengan motilitas dan metastasis. [ 57 ] Podoplanin berinteraksi dengan CLEC-2, reseptor yang diekspresikan pada trombosit dan beberapa sel imun, untuk menginduksi agregasi trombosit dan perkembangan pembuluh limfatik. [ 56 , 58 ] Meskipun tidak dievaluasi secara khusus di sini, jumlah dan fungsi trombosit dan sel imun dapat diselidiki sehubungan dengan keberadaan podoplanin + MSC ini dalam model sumsum tulang yang lebih kompleks di masa mendatang. Analisis media terkondisi menggunakan susunan sitokin angiogenesis mengungkapkan ekspresi berbagai macam faktor oleh BMEC dan MSC yang dikultur bersama yang dipertahankan dalam keadaan hipoksia atau normoksia. Kultur normoksik memiliki ekspresi sitokin terkait remodeling matriks yang lebih tinggi, termasuk MMP9, yang kemungkinan berkontribusi pada pembentukan jaringan yang lebih besar. Meskipun sebagian besar faktor yang diekspresikan lebih kuat dalam kultur normoksik bersifat pro-angiogenik, beberapa faktor anti-angiogenik, termasuk CXCL10, Endostatin, Pentraxin-3, Trombospondin-2, dan TIMP-1 juga meningkat. [ 59 – 63 ] Semua faktor yang diekspresikan lebih banyak atau sama dalam kultur hipoksia bersifat pro-angiogenik. Secara kombinasi, pengamatan ini menunjukkan bahwa PVN normoksik dapat mendekati fenotipe angiostatik lebih cepat dibandingkan dengan kultur hipoksia. Kultur PVN normoksik juga menunjukkan ekspresi CXCL12 yang lebih tinggi yang bersifat antiangiogenik, [ 64 ] tetapi juga merupakan faktor relung hematopoietik yang diketahui memainkan peran penting dalam retensi dan pemeliharaan HSC. [ 65 ] Faktor pertumbuhan hepatosit juga jauh lebih banyak diekspresikan dalam kultur normoksik, dan terkait dengan angiogenesis [ 66 ] dan pemeliharaan stemness pada sel punca dan progenitor hematopoietik. [ 67 ] Kultur PVN hipoksia menunjukkan tingkat osteopontin yang lebih tinggi, pengatur negatif ukuran kumpulan HSC yang dikaitkan dengan tingkat ketenangan yang lebih tinggi, [ 68 , 69 ] yang memotivasi penelitian masa depan yang melengkapi HSC yang dienkapsulasi dengan media yang dikondisikan hipoksia.

Pentingnya ketegangan oksigen diterima secara umum, tetapi menunjukkan pentingnya ini terbukti kurang mudah daripada hanya membudidayakan sel pada berbagai tingkat oksigen. Semua percobaan menunjukkan pergeseran fenotipik ke arah sel progenitor hematopoietik Lin dengan kultur hipoksia, tetapi efek lainnya bergantung pada isolasi HSPC menggunakan siklosporin A untuk mengurangi dampak syok oksigen. Pergeseran fenotipik dan fungsional dalam HSPC yang dikultur baru-baru ini diamati dalam kultur 2D tanpa penggunaan siklosporin A untuk mengurangi syok oksigen, [ 28 ] tetapi perubahan fenotipik ini hanya diamati sejak hari ke-14 dan seterusnya dan kapasitas fungsional dievaluasi setelah 28 hari. Meskipun isolasi berbasis siklosporin A mungkin tidak diperlukan untuk mengamati efek hipoksia pada akhirnya, masuk akal bahwa isolasi berbasis siklosporin A dapat meningkatkan atau mempercepat ekspansi dalam kultur hipoksia dengan memperbaiki syok oksigen dan melewati pemulihan fenotipik ini. HSPC yang dikultur dalam kondisi hipoksia dan normoksia menunjukkan peningkatan retensi sebagian kecil LSK primitif selama periode kultur 4 hari dengan adanya media terkondisi PVN (Gambar 4F ), tetapi efek ini berkurang selama kultur 4 hari ketika sel diisolasi dengan siklosporin A dan dikultur dalam kondisi hipoksia (Gambar 6F ).

Secara keseluruhan, penelitian ini menunjukkan bahwa ketegangan oksigen merupakan variabel signifikan tidak hanya dalam pembentukan model biomaterial sumsum tulang, tetapi juga dalam isolasi sel yang dimasukkan ke dalam model. Meskipun media PVN yang diaplikasikan memiliki efek serupa pada perluasan sel Lin + , efeknya pada perluasan Lin − dan kompartemen HSPC lebih bervariasi. Pekerjaan sebelumnya oleh Eliasson et al. yang membudidayakan HSPC di bawah oksigen 1% menunjukkan peningkatan proporsi HSC yang tenang, tetapi ini secara bersamaan mengurangi perluasan sel hematopoietik. [ 70 ] Yang penting, kami mengamati peningkatan jumlah HSPC fenotipik serta sel hematopoietik Lin + , yang menunjukkan bahwa faktor tambahan di luar suplementasi eksogen, seperti biomaterial, kondisi metabolik, dan sel yang dikultur bersama akan meningkatkan metode untuk perluasan HSC dalam perluasan pekerjaan ini di masa mendatang. Di sini, kami mengamati keberadaan CXCL12 dan osteopontin, tetapi faktor-faktor lain yang disekresikan telah terlibat dalam regulasi HSC dan dapat disetel melalui kondisi kultur bersama. Penelitian lebih lanjut diharapkan dapat mengungkap fenotipe yang tepat (yaitu, arteriol vs sinusoidal) dari kultur PVN berbasis hidrogel dan mengeksplorasi ko-kultur langsung sel perivaskular dengan HSPC. Selain itu, sementara penelitian ini menyelidiki peran pensinyalan parakrin yang berasal dari PVN satu arah dengan suplementasi media terkondisi, penelitian mendatang dapat menyelidiki hubungan silang sel HSC-niche secara lebih langsung menggunakan eksperimen Transwell atau ko-enkapsulasi yang menyajikan model sumsum tulang yang lebih dinamis.

5 Kesimpulan
Dalam penelitian ini, kami mengevaluasi dampak kultur hipoksia pada model hidrogel GelMA dari sumsum tulang. Kami selanjutnya mengeksplorasi dampak gabungan dari mitigasi EPHOSS dalam isolasi HSPC, kultur hipoksia, dan suplementasi media terkondisikan pada nasib HSPC dalam model hidrogel ini. Jaringan PVN menunjukkan tanda-tanda pematangan awal melalui ekspresi laminin, okludin, dan ZO-1 di bawah kondisi normoksik dan hipoksia, dan kondisi kultur ini menginduksi ekspresi regulator utama pemeliharaan dan ketenangan HSC termasuk CXCL12 dan osteopontin. Media terkondisikan PVN menunjukkan potensi untuk meningkatkan perluasan HSPC berbasis biomaterial. Kultur hipoksia secara konsisten menggeser distribusi sel ke arah fenotipe Lin − yang lebih primitif dan mitigasi EPHOSS dengan siklosporin A secara signifikan meningkatkan pemeliharaan HSPC ketika diikuti oleh kondisi kultur hipoksia. Temuan ini menunjukkan pentingnya metode isolasi dan kultur hipoksia dalam model rekayasa sumsum tulang, memperkenalkan elemen kunci pada upaya yang ditujukan pada pemeliharaan dan perluasan HSC dengan platform biomaterial.