Pendekatan mikrofluida untuk biopsi cair pada glioblastoma: Wawasan tentang strategi diagnostik dan tindak lanjut

Abstrak
Glioblastoma (GBM) adalah tumor otak yang sangat ganas dengan prognosis kelangsungan hidup yang buruk yaitu 12–15 bulan meskipun ada strategi terapi saat ini. Mendiagnosis GBM merupakan tantangan, sering kali memerlukan teknik invasif seperti biopsi jaringan dan metode pencitraan yang dapat memberikan hasil yang tidak meyakinkan. Dalam hal ini, biopsi cair merupakan alternatif yang menjanjikan, yang menyediakan informasi yang berasal dari tumor dari sumber yang kurang invasif seperti darah atau cairan serebrospinal. Namun, konsentrasi biomarker yang biasanya rendah ini menimbulkan tantangan bagi teknik deteksi tradisional, yang membatasi sensitivitas dan spesifisitasnya. Kemajuan terbaru dalam mikrofluida menawarkan solusi potensial dengan meningkatkan isolasi dan deteksi sel dan molekul yang berasal dari tumor, sehingga meningkatkan kemampuan deteksinya. Tinjauan ini membahas kemajuan terbaru dalam sistem biopsi cair berbasis mikrofluida untuk glioblastoma, yang menjadi dasar bagi praktik diagnostik masa depan yang kurang invasif dan lebih akurat. Seiring berkembangnya teknologi ini, teknologi ini berpotensi mengubah diagnosis dan pemantauan GBM, yang pada akhirnya meningkatkan hasil pasien.

Singkatan
APNG
alkilourin-DNA-N-glikosilase
BBB
penghalang darah-otak
Bahasa Inggris: cfNA
sel bebas nukleat
CTC (Konvensi Sentral)
sel tumor yang bersirkulasi
DNA-nya
DNA tumor yang beredar
RNA-Ct
RNA tumor yang beredar
Sistem Saraf Pusat (SSP)
sistem saraf pusat
cairan serebrospinal (CSF)
cairan serebrospinal
Kendaraan Listrik
vesikel ekstraseluler
Badan Pengawas Obat dan Makanan (BPOM)
Badan Pengawas Obat dan Makanan
SPME-GC–MS
mikroekstraksi fase padat kromatografi gas spektrometri massa
GBM
penyakit glioma
saya
RNA eksosom imunomagnetik
RNA-L
RNA non-coding panjang
Manajemen Manajemen
O6-metilguanin DNA metiltransferase
RNA kecil
mikroRNA
Pemindaian MRI
pencitraan resonansi magnetik
MSP
PCR spesifik metilasi
PDMS
polidimetilsiloksan
PELIHARAAN
tomografi emisi positron
POC
titik perawatan
PIR
pirosekuensing
RANJANG
penilaian respon dalam neuro-onkologi
RNA pendek
mal RNA non-coding
TEP (Tetap Terpadu)
trombosit yang dibentuk oleh tumor
Bahasa Inggris
kekambuhan saluran
Waktu
lingkungan mikro tumor
VOC (Vokalografi)
senyawa organik yang mudah menguap
SIAPA
Organisasi Kesehatan Dunia
Pernyataan Dampak Translasi
Tinjauan ini menyoroti bagaimana mengintegrasikan teknologi mikrofluida dengan biopsi cair memungkinkan deteksi biomarker presisi tinggi dan pemantauan glioblastoma non-invasif, mengatasi tantangan kritis dalam diagnosis dan tindak lanjutnya. Dengan meningkatkan isolasi dan deteksi biomarker yang berasal dari tumor dengan kelimpahan rendah dalam cairan tubuh, teknologi ini memiliki potensi signifikan untuk meningkatkan diagnosis dini non-invasif, memandu keputusan terapeutik, dan mengubah manajemen pasien pada glioblastoma dan kanker lain yang tidak dapat diakses. Karya ini menjembatani inovasi bioteknologi dengan aplikasi klinis, menawarkan perspektif yang berdampak untuk alat diagnostik yang lebih tepat dan mudah diakses dalam onkologi.

1. PENDAHULUAN
Glioblastoma (GBM, astrocytoma WHO grade IV) adalah tumor otak primer yang paling sering terjadi, ganas, dan agresif pada orang dewasa, mencakup hampir 50% dari tumor otak ganas di semua kelompok usia. 1 – 3 Menurut klasifikasi terbaru Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) tahun 2021, GBM saat ini didefinisikan sebagai glioma astrositik difus tanpa mutasi pada gen IDH maupun gen histon H3. 4 , 5 Hal ini ditandai dengan proliferasi mikrovaskular, nekrosis, dan fitur molekuler spesifik, termasuk mutasi promoter TERT, amplifikasi gen EGFR, dan tanda tangan sitogenik +7/−10. 4 Tumor dapat muncul de novo sebagai GBM primer atau berkembang dari astrocytoma tingkat rendah sebagai GBM sekunder, dengan profil molekuler yang berbeda: GBM primer sering menunjukkan amplifikasi EGFR dan kehilangan PTEN, sedangkan GBM sekunder dikaitkan dengan mutasi TP53, ATRX, dan PDGFRA. 6 , 7 Perubahan lain, seperti mutasi PIK3CA yang terkait dengan kekambuhan lebih awal dan kelangsungan hidup yang lebih pendek, 8 dan status metilasi promotor MGMT juga merupakan biomarker yang diterima secara luas pada glioblastoma. 9

Meskipun ada kemajuan dalam pengobatan saat ini—termasuk pembedahan, radio-kemoterapi bersamaan, dan kemoterapi adjuvan (protokol Stupp) 4 — prognosis pasien tetap sangat buruk, dengan sedikit kemajuan selama empat dekade terakhir dalam hal pencegahan, deteksi dini, dan pengobatan. 3 Kelangsungan hidup rata-rata, bahkan dengan pengobatan Stupp, adalah antara 10 dan 15 bulan, dengan sebagian besar pasien mengalami kekambuhan tumor dalam waktu 1 tahun setelah diagnosis. Selain itu, tingkat kelangsungan hidup relatif 5 tahun hanya meningkat dari 4% menjadi 7% selama 40 tahun terakhir, dan ini turun menjadi 2% pada pasien berusia 65 tahun atau lebih. 3 , 10

Deteksi dini penyakit seperti kanker sangat penting, karena dapat meningkatkan hasil pengobatan pasien secara signifikan. Namun, dalam kasus GBM, diagnosis biasanya terjadi pada stadium lanjut karena sifat gejala awal yang tidak spesifik, yang tumpang tindih dengan kondisi jinak yang lebih umum. Presentasi klinis bervariasi tergantung pada ukuran dan lokasi tumor, dengan gejala yang sering terjadi termasuk sakit kepala, mual (sering kali terkait dengan peningkatan tekanan intrakranial), kelelahan, kelemahan, gangguan kognitif, ataksia, dan kejang. Mengingat sifat gejala yang tidak jelas ini dan keterbatasan alat diagnostik saat ini, terutama karena tumor tidak dapat diakses dan risiko yang terkait dengan prosedur invasif, lebih dari separuh pasien didiagnosis hanya setelah rawat inap darurat ketika tumor telah mencapai stadium lanjut. 10 , 11

Hal ini telah menyebabkan meningkatnya minat terhadap metode diagnostik dan pemantauan alternatif, seperti biopsi cair, yang menawarkan keuntungan karena kurang invasif dan berpotensi berguna untuk pemantauan berulang terhadap perkembangan penyakit. Namun, konsentrasi rendah biomarker GBM dalam sirkulasi menghadirkan tantangan teknis yang signifikan untuk metode deteksi tradisional. Dalam beberapa tahun terakhir, teknologi mikrofluida telah muncul sebagai pendekatan yang menjanjikan untuk mengatasi keterbatasan ini.

Perangkat mikrofluida memungkinkan manipulasi cairan yang tepat pada skala mikro, menawarkan sensitivitas dan spesifisitas yang unggul untuk isolasi, pengayaan, dan analisis biomarker tumor. Sistem ini meningkatkan deteksi biomarker yang bersirkulasi dari sampel biofluida minimal, sehingga secara signifikan meningkatkan kemampuan diagnostik dibandingkan dengan teknik konvensional. Dengan mengurangi volume sampel yang dibutuhkan, meningkatkan efisiensi penangkapan biomarker, dan memungkinkan analisis waktu nyata, platform mikrofluida memfasilitasi deteksi GBM dini dan memungkinkan pemantauan perkembangan penyakit yang lebih sering dan akurat.

Dalam ulasan ini, kami mengeksplorasi kemajuan terbaru dalam teknologi biopsi cair berbasis mikrofluida untuk glioblastoma, dengan fokus pada jenis-jenis biomarker utama—sel tumor yang bersirkulasi (CTC), vesikel ekstraseluler (EV), asam nukleat bebas yang bersirkulasi (cfNA), trombosit yang dibentuk oleh tumor (TEP), dan senyawa organik volatil (VOC)—dan perangkat mikrofluida yang dikembangkan untuk mendeteksi masing-masing, beserta aplikasi spesifiknya. Dengan memberikan gambaran umum tentang tantangan saat ini dan prospek masa depan, kami bertujuan untuk menyoroti peran teknologi yang baru muncul ini dalam meningkatkan diagnosis dini, mempersonalisasi strategi pengobatan, dan pada akhirnya meningkatkan hasil pasien dalam glioblastoma.

2 METODE DIAGNOSIS GLIOBLASTOMA YANG SEDANG BERLAKU
2.1 Metode diagnosis: neuroimaging dan biopsi jaringan
Pendekatan konvensional dalam diagnosis, subtipe, dan pemantauan kanker otak bergantung pada pencitraan canggih dan teknik histopatologi. Dalam pencitraan, ada beberapa metode yang banyak digunakan, seperti tomografi komputer, pencitraan resonansi magnetik (MRI), dan tomografi emisi positron (PET). Karena resolusi dan sensitivitasnya yang tinggi dibandingkan dengan yang lain, MRI saat ini merupakan yang paling banyak digunakan. 12 MRI mencakup sekuens pemulihan inversi yang dilemahkan oleh cairan dengan bobot T2, dan sekuens 3D dengan bobot T1 sebelum dan sesudah penerapan agen kontras berbasis gadolinium. 13 Integrasi teknik MRI tradisional dan canggih dengan pembelajaran mesin—suatu pendekatan yang dikenal sebagai radiomik—juga muncul sebagai metode untuk menggabungkan analisis kuantitatif ke dalam interpretasi pencitraan. Radiomik mencakup fitur-fitur seperti lokasi kekambuhan dan volume peningkatan kontras, yang memberikan wawasan prognostik dan diagnostik tambahan. 14

PET, sebuah teknik kedokteran nuklir, semakin relevan untuk diagnosis dan pemantauan GBM. Teknik ini terutama menggunakan dua kategori pelacak radioaktif: pelacak metabolisme glukosa (misalnya, 18 F-FDG) dan pelacak transpor asam amino (misalnya, 11 C-MET, 18 F-FET, dan 18 F-FDOPA). Meskipun 18 F-FDG awalnya merupakan yang paling banyak dipelajari, pelacak PET asam amino telah menunjukkan sensitivitas yang lebih unggul dalam mendeteksi glioma dan membedakan tumor rekuren dari perubahan yang disebabkan oleh pengobatan. 15 , 16

Namun, meskipun teknologi pencitraan telah maju, keandalan penilaian pencitraan masih dianggap kurang memadai, karena tampilan glioblastoma pada pemindaian pencitraan dapat sangat bervariasi. Oleh karena itu, semua pedoman merekomendasikan untuk mendapatkan sampel histologis sebelum memutuskan pilihan terapi. 4 MRI biasanya diikuti dengan reseksi atau biopsi jaringan tumor untuk memastikan diagnosis, tingkat, dan karakterisasi tumor. 17

2.2 Pemantauan dan tindak lanjut
Selain diagnosis, tindak lanjut tumor dilakukan dengan cara yang setara. Pemeriksaan klinis dan MRI merupakan metode mendasar dalam penilaian status penyakit dan respons terhadap pengobatan, mengikuti kriteria Response Assessment in Neuro-Oncology (RANO) yang telah ditetapkan. Setelah pengobatan awal, sebagian besar pasien menjalani pemindaian MRI dengan interval 2–6 bulan. Namun, neuroimaging rutin biasanya tidak diindikasikan kecuali gejala neurologis baru muncul, dan interval yang lebih lama antara pemindaian sering direkomendasikan untuk meminimalkan risiko pasien dari paparan berulang. 4 Pendekatan ini menghadirkan masalah yang signifikan bagi pasien GBM, karena kekambuhan tumor terjadi pada sekitar 90% kasus. 18 Kurangnya tindak lanjut yang lebih sering dapat mengakibatkan deteksi kekambuhan yang terlambat, yang menyebabkan perkembangan tumor dan prognosis yang lebih buruk. Oleh karena itu, ada kebutuhan mendesak untuk metode pemantauan non-invasif yang lebih sering untuk meningkatkan deteksi dini kekambuhan dan manajemen penyakit yang lebih baik.

2.3 Keterbatasan teknik diagnosis dan pemantauan saat ini
Meskipun menjadi protokol diagnostik standar Asosiasi Neuro-Onkologi Eropa, baik pencitraan saraf dengan MRI maupun reseksi bedah memiliki beberapa keterbatasan dan komplikasi. Seperti yang dijelaskan sebelumnya, MRI konvensional adalah teknik pilihan untuk deteksi dan tindak lanjut tumor, karena memungkinkan informasi tentang struktur dan lokasi dalam operasi terarah. Namun, MRI hanya dapat mendeteksi tumor padat jika massanya cukup, dan sulit untuk membedakan antara glioma tingkat tinggi (seperti GBM dan oligodendroglioma) atau penyakit lain seperti infeksi, limfoma, dan metastasis tumor primer ekstrakranial. Sementara pencitraan PET secara signifikan meningkatkan diferensiasi glioma dibandingkan dengan MRI, pencitraan ini masih menghadapi keterbatasan dalam membedakan oligodendroglioma dari GBM, karena keduanya menunjukkan penyerapan asam amino yang sama tingginya, sehingga mempersulit klasifikasinya. 19

Salah satu tantangan utama bagi ahli bedah saraf adalah membedakan perkembangan tumor yang sebenarnya dari perubahan peningkatan kontras terkait pengobatan, yang dikenal sebagai pseudoprogresi. 20 Hal ini sering terjadi setelah kemo-iradiasi gabungan dengan temozolomide (TMZ), standar perawatan saat ini untuk glioblastoma. Pseudoprogresi dapat meningkatkan peningkatan kontras, yang disebabkan oleh perubahan pada sawar darah-otak (BBB) ​​atau nekrosis radiasi. Pseudoprogresi terjadi pada 20%–30% pasien GBM, biasanya dalam 12 minggu pertama pengobatan, dan penting untuk membedakannya dari perkembangan yang sebenarnya untuk menghindari pembedahan atau pengobatan yang tidak perlu. 21 , 22 Sebaliknya, agen antiangiogenik dapat mengurangi peningkatan kontras pada MRI tanpa efek antitumor yang sebenarnya dengan mengubah permeabilitas pembuluh darah tumor, memberikan persepsi yang salah tentang penyusutan tumor. Fenomena ini dikenal sebagai pseudo-respons. 20 , 23 Uji coba terkini dengan agen terkait VEGF, seperti bevacizumab, telah menunjukkan penurunan cepat dalam peningkatan kontras dengan tingkat respons yang tinggi, tetapi dengan efek antitumor yang agak sederhana. 20 Kedua fenomena tersebut menekankan keterbatasan MRI sebagai ukuran aktivitas tumor, karena kasus di mana tidak ada perkembangan tumor, tetapi BBB yang terganggu harus dipertimbangkan.

Meskipun pendekatan multimoda yang memadukan MRI, PET, dan radiomik menjanjikan peningkatan pembedaan antara perkembangan sejati dan pseudoprogresi, teknik saat ini masih memerlukan validasi lebih lanjut dalam uji klinis multisenter berskala besar sebelum dapat diterapkan secara andal sebagai alat diagnostik yang tangguh. 24 Akibatnya, meskipun bersifat invasif, konfirmasi jaringan tetap menjadi standar emas untuk diagnosis GBM. 14 Selain itu, meskipun kemajuan dalam teknik pencitraan multimoda telah meningkatkan karakterisasi lesi, teknik tersebut hanya memberikan gambaran sebagian dari sifat tumor, yang menggarisbawahi perlunya strategi diagnostik baru yang dapat menghasilkan wawasan biologis yang lebih mendalam tentang perkembangan tumor dan respons terapeutik.

Bahasa Indonesia: Setelah MRI, biopsi jaringan dilakukan untuk mengkarakterisasi tumor dan memberikan diagnosis yang lebih lengkap. Dalam kasus otak, melakukan biopsi melibatkan tingkat risiko yang tinggi bagi pasien karena prosedur yang invasif. 25 , 26 Komplikasi yang terjadi setelah biopsi otak stereotaktik berbasis bingkai jarang terjadi tetapi memiliki efek samping yang serius. Invasivitas yang tinggi dapat menyebabkan efek seperti pembengkakan otak atau pendarahan, yang sangat mengubah fungsi otak. 27 Meskipun digambarkan sebagai prosedur invasif minimal dengan tingkat komplikasi yang rendah, kematian telah dilaporkan sebagai komplikasi paling parah setelah biopsi otak stereotaktik berbasis bingkai. 26 Selain itu, ada risiko yang muncul terkait dengan prosedur biopsi itu sendiri, kekambuhan traktus (TR), di mana sel tumor dapat menyebar di sepanjang traktus biopsi, risiko yang sebelumnya tidak dihargai dalam kasus metastasis otak. Studi terkini menunjukkan bahwa hingga 50% pasien dapat mengembangkan TR setelah biopsi, menyoroti pentingnya pemantauan radiografi yang cermat dan pertimbangan untuk memasukkan jalur biopsi ke dalam rencana terapi radiasi adjuvan untuk mengelola risiko ini. 28 Di sisi lain, tidak dapat diaksesnya beberapa tumor otak dan sedikitnya jumlah fragmen yang dapat diekstraksi membuat sulit untuk mendapatkan sampel jaringan yang sepenuhnya menangkap heterogenitas intratumoral yang besar.

Terkait dengan hal tersebut di atas, ada kebutuhan mendesak di klinik untuk mengidentifikasi metode deteksi yang kurang invasif untuk diagnosis dan prognosis, dan yang pada gilirannya, dapat memantau perkembangan tumor dan respons terhadap terapi. Teknik saat ini bukanlah prosedur yang dapat dilakukan berulang kali dari waktu ke waktu untuk menilai dinamika tumor dan profil molekulernya secara real time, tetapi hanya menawarkan pandangan statis tumor, yang diketahui mengalami perubahan morfologi dan molekuler yang konstan. 21

3 BIOPSI CAIRAN PADA GLIOBLASTOMA
Dalam konteks ini, biopsi cair semakin diakui sebagai alat yang berpotensi berharga untuk identifikasi dan karakterisasi biomarker kanker. 27 Telah menunjukkan banyak karakteristik yang menguntungkan dalam tugas ini, terutama karena sifatnya yang minimal invasif dan pengambilan sampel yang mudah. ​​12 Teknik diagnostik ini melibatkan analisis cairan biologis untuk mengidentifikasi dan mengisolasi molekul yang dilepaskan oleh tumor ke dalam sirkulasi darah umum dan cairan tubuh lainnya, seperti cairan serebrospinal (CSF), air liur, dan urin. Sementara darah adalah yang paling umum digunakan dalam glioblastoma, CSF juga digunakan untuk deteksi biomarker. 29 , 30 CSF bersirkulasi di otak dan sumsum tulang belakang dan karena itu berhubungan erat dengan sistem saraf pusat. Namun, pengambilan CSF memerlukan prosedur pungsi lumbal invasif. 21 Di antara molekul yang paling banyak dipelajari saat ini adalah cfNA (yang mencakup DNA tumor yang bersirkulasi (ctDNA) dan RNA tumor bebas sel yang bersirkulasi (ctRNA)), CTC, EV, VOC, dan TEP. 27 , 31 , 32 Molekul-molekul ini harus spesifik terhadap tumor dan hadir dalam konsentrasi yang memadai untuk dideteksi.

Selain kurang invasif dibandingkan biopsi jaringan, biopsi cair memiliki potensi untuk menentukan profil genetik pasien kanker. Untuk tumor otak, biomarker yang beredar berarti mengekstraksi informasi yang berguna menggunakan metode invasif minimal. Telah dilaporkan bahwa beberapa molekul ini dapat melewati BBB dan dapat dideteksi dalam darah pasien GBM, bahkan ketika permeabilitasnya tidak terganggu. 33 Molekul-molekul ini dapat melewati jaringan tumor dan dengan demikian dapat memberikan sampel tumor yang sebenarnya. Faktanya, korelasi yang signifikan telah terlihat antara profil genetik yang diperoleh dari ctDNA dengan biopsi cair dan tumor yang sesuai. 27 Oleh karena itu, metode ini dapat menjadi utilitas klinis yang besar, terutama dalam kasus-kasus di mana pembedahan merupakan kontraindikasi, atau hasil biopsi tidak meyakinkan (sekitar 25% pasien). 2 Selain itu, dalam kasus kekambuhan, yang merupakan persentase yang sangat tinggi, hanya 30% pasien yang menjadi kandidat untuk operasi kedua. Karena alasan ini, biomarker yang bersirkulasi dapat digunakan sebagai metode diagnosis molekuler tumor yang kambuh pada pasien yang tidak dapat dioperasi, sehingga memudahkan identifikasi perubahan yang menyebabkan kekambuhan dan kemungkinan pengobatan yang akan diterapkan. Kesederhanaan metode ekstraksi dapat relevan secara klinis, karena memungkinkan deteksi dini kanker melalui diagnosis langsung dan memungkinkan pengumpulan sampel serial yang secara akurat mencerminkan evolusi tumor dari waktu ke waktu. Pendekatan ini memfasilitasi pemantauan perubahan yang berpotensi membahayakan dalam agresivitas tumor, respons pengobatan, dan risiko kekambuhan. Selain itu, prosedur ini dapat memungkinkan identifikasi jalur pensinyalan yang terganggu, klasifikasi subtipe molekuler, dan juga penemuan biomarker. 12

Namun, keterbatasan teknologi deteksi telah menghambat ketersediaan dan pengetahuan tentang teknik ini hingga beberapa tahun terakhir. 34 Salah satu tantangan utama adalah rendahnya konsentrasi biomarker dalam darah, sehingga menyulitkan deteksi. Isolasi memerlukan prosedur yang lebih kompleks dan akurat untuk mendapatkan jumlah sel yang cukup, terutama pada kanker stadium awal. 35 Lokalisasi tumor juga memengaruhi kemampuan deteksi biomarker ini, dengan lesi otak, misalnya, yang sulit dinilai melalui analisis darah. 36 Teknologi mikrofluida menawarkan solusi yang menjanjikan untuk tantangan ini dengan memungkinkan isolasi dan analisis biomarker langka yang tepat, bahkan dalam konsentrasi rendah. Teknologi ini meningkatkan sensitivitas dan mengurangi kebutuhan volume sampel, yang sangat bermanfaat untuk mendeteksi biomarker pada tumor yang sulit dijangkau, seperti yang terletak di otak.

4 MIKROFLUIDIKA UNTUK BIOPSI CAIRAN PADA GLIOBLASTOMA
Mikrofluidika melibatkan studi dan manipulasi cairan pada skala submilimeter, biasanya berfokus pada kontrol yang tepat dari volume cairan kecil dengan memanfaatkan sifat fisik cairan tertentu. 37 , 38 Telah terbukti menjadi alat yang berguna untuk meningkatkan penelitian diagnostik dan biologis karena sensitivitas yang meningkat, toksisitas yang berkurang, biokompatibilitas, dan pengiriman obat yang ditingkatkan. 39 Dengan memungkinkan miniaturisasi, mikrofluidika memungkinkan integrasi beberapa langkah analitis dalam satu platform, mengurangi kebutuhan untuk volume sampel dan reagen yang besar. Pendekatan ini tidak hanya mempercepat pemrosesan sampel tetapi juga meningkatkan sensitivitas deteksi, membuatnya sangat berharga untuk mengisolasi dan menganalisis molekul atau biomarker yang ada dalam jumlah minimal atau ukuran kecil. 40 Melalui kemampuan ini, mikrofluidika menawarkan peningkatan yang signifikan dalam mendeteksi biomarker dengan kelimpahan rendah dengan presisi tinggi.

Metode fabrikasi perangkat mikrofluida dapat secara luas dikategorikan ke dalam tiga kelompok utama: teknik berbasis fotolitografi, teknik berbasis replikasi, dan xurografi. Dari ketiganya, pendekatan berbasis replikasi—termasuk litografi lunak, hot embossing, dan cetak injeksi—adalah yang paling banyak digunakan dalam penelitian biomedis karena fleksibilitas dan skalabilitasnya. 41 – 43 Sebagian besar perangkat tersusun dari polidimetilsiloksan (PDMS), yang menawarkan kinerja optik, biokompatibilitas, dan fleksibilitas yang baik, sekaligus memungkinkan pemantauan waktu nyata, pencitraan resolusi tinggi, dan kuantifikasi kejadian biologis. 44 , 45 Namun, bahan ini merupakan bahan yang dapat ditembus gas dan menahan molekul yang tidak spesifik. Sebagai alternatif, bahan lain telah muncul, seperti polimer olefin siklik. Bahan termoplastik ini, meski mempertahankan manfaat PDMS, memiliki permeabilitas gas rendah yang memungkinkan kontrol gas yang lebih tepat dan lebih mudah ditangani di jalur produksi. 46 , 47

Teknologi mikrofluida semakin banyak digunakan dalam penelitian kanker dan dapat digunakan untuk perawatan dan diagnosis yang dipersonalisasi. Dalam konteks ini, biosensor point-of-care (POC) muncul sebagai perangkat portabel inovatif yang memungkinkan deteksi penyakit yang cepat dan tepat di luar laboratorium. 48 , 49 Biosensor ini, yang mencakup platform penginderaan elektrokimia dan optik, telah menunjukkan potensi yang signifikan dalam diagnostik glioma. 49 – 51 Selain itu, teknik seperti PCR, RT–PCR, dan analisis sel tunggal berthroughput tinggi telah digunakan secara luas dalam platform mikrofluida berbasis tetesan. 52 Pendekatan ini telah diterapkan untuk mengkarakterisasi glioma berdasarkan status mutasi IDH1 mereka 53 dan untuk membedakan sel tumor glioblastoma menurut aktivitas proteolitiknya. 54 Aplikasi utama lainnya adalah di bidang organ-on-chip, yang menggunakan mikrofluida untuk meniru kondisi tumor in vivo secara dekat, menyediakan alat praklinis canggih untuk mempelajari perawatan yang dipersonalisasi untuk pasien individu. 55 – 57 Perangkat organ-on-chip telah dikembangkan untuk mensimulasikan lingkungan mikro glioblastoma, 58 , 59 migrasi dan invasi sel, 60 metastasis, 61 vaskularisasi dan ekstravasasi. 62 Lebih jauh lagi, perangkat ini semakin diintegrasikan ke dalam studi imuno-onkologi 63 , 64 dan skrining obat. 65 Khususnya, pengesahan terbaru Undang-Undang Modernisasi 2.0 Badan Pengawas Obat dan Makanan Amerika Serikat (FDA), yang menghapus persyaratan pengujian hewan ketika alternatif in vitro seperti organ-on-chip menunjukkan kinerja yang unggul, 66 telah semakin mendorong adopsi teknologi ini.

Biopsi cair merupakan salah satu aplikasi mikrofluida yang paling menjanjikan dalam penelitian GBM. Meskipun masih merupakan bidang yang baru muncul, berbagai perangkat mikrofluida telah tersedia untuk mengoptimalkan deteksi dan analisis penanda cair utama (Tabel 1 ). Ini termasuk CTC, EV, dan VOC. Dengan mengurangi kebutuhan akan prosedur invasif untuk diagnosis dan meningkatkan akurasi model penyakit, mikrofluida mengatasi tantangan utama dalam GBM, memungkinkan analisis biomarker minimal invasif, meningkatkan sensitivitas dan mengurangi positif palsu, sehingga memungkinkan penilaian diagnostik yang lebih akurat dan sering. 67 Di bagian berikut, pendekatan mikrofluida utama untuk setiap jenis biomarker dibahas.

TABEL 1. Gambaran umum metode biopsi cairan berbasis mikrofluida yang dikembangkan untuk studi glioblastoma.

4.1 Sel tumor yang bersirkulasi dalam model mikrofluida
CTC adalah sel tumor yang bermigrasi dari massa tumor padat ke dalam aliran darah. Hal ini diduga terjadi karena induksi transisi epitel-mesenkimal pada sel tumor, yang menyebabkan sel meningkatkan penanda mesenkimal yang memberi mereka sifat invasif dan migrasi. 77 CTC mengandung informasi genetik dari berbagai jenis, karena mengandung DNA, RNA, dan protein tumor, yang memungkinkan informasi berguna diperoleh untuk mempelajari perkembangan tumor, invasi, dan metastasis. 78 Namun, pada tumor otak, metastasis ekstrakranial tidak sering terjadi, sebagian besar disebabkan oleh keberadaan BBB dan kelangsungan hidup serta infiltrasi sel yang pendek dalam lingkungan netral. 79 CTC ditemukan dalam jumlah yang sangat kecil dalam aliran darah (antara 1 dan 10 sel/10 mL darah). 80 Secara khusus, jumlah CTC dalam GBM diperkirakan antara 1 dan 22 sel/2 juta sel mononuklear. 81 Oleh karena itu, penggunaan mikrofluida untuk isolasi CTC dapat membuka pintu untuk strategi diagnostik baru untuk glioblastoma menggunakan teknologi berbasis afinitas dan bebas afinitas, 82 karena sistem ini juga telah terbukti mencapai kemurnian yang lebih tinggi dalam CTC daripada metode lain, seperti sentrifugasi gradien densitas. 83 Kromatografi afinitas sel menggunakan ligan dengan afinitas untuk CTC untuk secara selektif mengisolasi sel-sel ini dari sisa sel yang ada dalam darah. 84 Teknologi ini diimplementasikan pada tumor lain seperti kanker serviks, 85 untuk diadaptasi beberapa tahun kemudian untuk mempelajari CTC pada tumor yang berbeda seperti melanoma, payudara, usus besar, paru-paru, dan kanker prostat melalui penggunaan ligan spesifik. 78 , 82 , 86 Namun, tidak ada kepastian homogenitas total dalam ekspresi penanda tertentu, terutama pada tumor yang heterogen seperti GBM. Oleh karena itu, seleksi negatif dapat menjadi alternatif untuk memperkaya sampel dalam CTC dari darah tepi. 81 Pendekatan bebas label ini didasarkan pada faktor fisik seperti ukuran dan deformitas sel, 87 dengan perangkat mikrofluida spiral menjadi salah satu opsi yang digunakan pada beberapa kanker kepala dan leher, 88 paru-paru 89 atau payudara. 90 Di sisi lain, ada sistem komersial yang menyediakan sistem yang andal untuk pemisahan CTC. Sistem CellSearch® adalah teknologi pertama yang disetujui FDA untuk penyelidikan CTC. 91 Sistem ini menggunakan ferofluida yang terdiri dari nanopartikel magnetik yang dilapisi dengan antibodi anti-EpCAM untuk menangkap sel-sel asal epitel. Namun, dalam GBM, CTC cenderung memiliki fenotipe mesenkimal, sehingga teknologi ini tidak cocok untuk penelitiannya. 92

Meskipun menjadi tumor di mana keberadaan CTC telah sedikit dipelajari dibandingkan dengan tumor lain, ada penelitian yang mengembangkan teknik mikrofluida untuk deteksi dan identifikasi glioblastoma. Dalam konteks ini, Ozkumur et al. mengembangkan perangkat mikrofluida yang disebut CTC-iChip, yang memungkinkan isolasi CTC dari darah utuh. 93 , 94 Sullivan et al. menerapkan teknologi ini pada pasien GBM, memperoleh CTC pada 13 dari 33 pasien. Penelitian menunjukkan bahwa CTC diperkaya dalam penanda diferensiasi mesenchymal atas saraf dibandingkan dengan GBM primer. 68 Wan et al. mengembangkan perangkat mikrofluida untuk mempelajari penangkapan CTC dari GBM dan pentingnya kecepatan fluida untuk isolasi partikel-partikel ini. Dengan menggunakan prinsip ini, mereka menggunakan substrat fungsional aptamer anti-EGFR dalam perangkat untuk mempelajari efisiensi pengikatan CTC. Mereka menemukan bahwa laju aliran 2 mm / s secara signifikan memfasilitasi penangkapan CTC. 69 Baru-baru ini, Müller Bark et al. melaporkan penggunaan teknologi mikrofluidik spiral untuk mengisolasi CTC dari seluruh darah pasien GBM yang baru didiagnosis sebelum dan setelah operasi (Gambar 1a ). Ini diikuti oleh karakterisasi dengan GFAP, vimentin, dan amplifikasi EGFR. Mereka menemukan CTC pada 13 dari 20 pasien dan menunjukkan bahwa pasien tanpa CTC setelah operasi memiliki kelangsungan hidup bebas kekambuhan yang lebih tinggi. 70 Selain itu, sistem Parsortix™ yang dijelaskan oleh Miller et al. dikembangkan untuk menangkap sel menurut ukuran dan deformitasnya, untuk analisis dan karakterisasi sel yang diisolasi selanjutnya. 95 Krol et al. menggunakan sistem ini untuk mendeteksi apakah sel yang bersirkulasi dapat tampak membentuk gugus dan dengan demikian melewati BBB pada 13 pasien dengan GBM yang berkembang (Gambar 1b ). Mereka mengamati gugus yang bervariasi dari 2 hingga 23 sel pada berbagai tahap perkembangan GBM. Pengurutan eksom dari kluster CTC mengungkapkan variasi pada 58 gen terkait tumor seperti ATM , PMS2 , POLE , APC , XPO1 , TFRE , JAK2 , ERBB4 , dan ALK . 71 Seperti yang ditunjukkan oleh artikel dalam bidang ini, sistem mikrofluida untuk mendeteksi CTC adalah sistem yang terus berkembang untuk menawarkan teknik yang lebih spesifik terhadap tumor, meskipun ada keterbatasan yang ditimbulkannya untuk GBM. Sistem komersial sudah ada untuk tujuan ini, dan optimalisasi sensitivitas dan efisiensi isolasi dapat membantu penerapan sistem ini sebagai metode diagnostik dan pemantauan alternatif untuk tumor yang sulit dijangkau seperti GBM.

GAMBAR 1
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Perangkat mikrofluida untuk mendeteksi CTC dalam GBM. (a) Perangkat mikrofluida spiral yang dikembangkan oleh Müller Bark dkk. 70 untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi CTC GBM dari seluruh darah menggunakan dinamika aliran inersia. Metode ini memungkinkan deteksi CTC yang mengekspresikan penanda terkait GBM seperti GFAP, vimentin, dan amplifikasi EGFR, yang relevan untuk pemantauan dan karakterisasi tumor. (b) Perangkat mikro Parsortix™ yang digunakan oleh Krol dkk. 71 untuk mengidentifikasi kelompok CTC GBM, memfasilitasi penilaian perkembangan tumor dan pemantauan respons terapi. Direproduksi berdasarkan syarat dan ketentuan lisensi Creative Commons Attribution (CC BY).
4.2 Vesikel ekstraseluler dalam model mikrofluida
EV mencakup semua vesikel membran yang disekresikan atau berasal dari sel jenis apa pun, yang perannya sangat bervariasi; dari komunikasi antarsel dalam lingkungan mikro hingga proliferasi, migrasi, resistensi obat, dan imunomodulasi. 96 Mereka adalah sekelompok nanopartikel terikat lipid-bilayer yang ukurannya berkisar antara 30 nm hingga 10 μm. Ini memberi mereka fitur yang sangat penting dalam studi glioblastoma, karena mereka mampu melewati BBB. 97 Molekul-molekul ini dapat diekstraksi dari plasma, serum, CSF, dan bahkan air liur. Pengumpulan CFS melibatkan metode yang intrusif dan sulit, 98 dan air liur dapat menunjukkan variabilitas karena metode pengumpulan dan analisis yang tidak konsisten. 99 Dalam darah, plasma lebih mudah diperoleh dan dapat menyediakan sejumlah besar molekul untuk dipelajari. Eksosom dan mikrovesikel adalah dua kelas utama EV yang berbeda dalam mekanisme pelepasan, ukuran, dan kontennya (miRNA, mRNA, dan DNA). Sel glioblastoma melepaskan EV yang berpartisipasi dalam komunikasi antarsel dengan lingkungan mikro tumor. Molekul-molekul ini telah menunjukkan hasil yang menjanjikan sebagai biomarker GBM, memberikan wawasan tentang karakterisasi molekuler dan subtipe untuk aplikasi terapeutik dan diagnostik yang potensial. 100

Terdapat berbagai teknik isolasi EV, masing-masing dengan kelebihan dan keterbatasannya sendiri. Ultracentrifugasi adalah metode umum yang menggunakan pemintalan berkecepatan tinggi untuk memisahkan EV, dengan sentrifugasi berturut-turut pada gaya tinggi yang menghilangkan sel-sel mati dan serpihan sebelum membentuk pelet EV. Di sisi lain, ultracentrifugasi gradien densitas menambahkan gradien densitas ke proses sentrifugasi, yang memungkinkan pemisahan EV yang lebih halus berdasarkan densitas apungnya, sehingga menghasilkan kemurnian yang lebih tinggi. 101 Teknik berbasis ukuran lainnya, seperti ultrafiltrasi dan kromatografi pengecualian ukuran, memisahkan EV berdasarkan ukurannya, yang menawarkan pendekatan yang lebih lembut yang menjaga integritas EV. Selain itu, kit komersial seperti ExoQuick™ dan ExoQuick ULTRA menyediakan metode sampel yang tepat dan minimal untuk isolasi EV. 98 , 102

Eksosom adalah molekul yang diperkaya dengan penanda membran spesifik seperti CD63, CD81, dan ALIX. 103 Secara spesifik, eksosom turunan GBM berbeda dari eksosom inang melalui amplifikasi reseptor faktor pertumbuhan epidermal (EGFR) dan mutasi spesifik lainnya seperti delesi EGFRvIII. 104 Studi yang menggunakan serum dari pasien GBM telah mengungkap keberadaan jejak inflamasi dengan mendeteksi biomarker EV. Di antara molekul yang ditemukan adalah VWF, FCGBP, C3, PROS1, dan SERPINA1. 100 Selain itu, peningkatan regulasi biomarker spesifik subtipe seperti CD44, CD63, dan CD81 telah ditemukan signifikan pada pasien GBM dibandingkan dengan kontrol. Selain itu, kadar dalam pasien GBM dapat bervariasi, yang dapat memberikan informasi tentang subtipe atau perkembangan tumor, sehingga membawa kita lebih dekat ke perawatan yang dipersonalisasi. 98 , 100

Masalah dengan metode isolasi saat ini adalah perlunya ultracentrifuge, selain protokol yang memakan waktu, dan metode yang lebih sederhana dan lebih cepat akan membantu dalam karakterisasi EV spesifik GBM. Dalam hal ini, teknik mikrofluida dapat berguna untuk mengatasi beberapa keterbatasan yang disebutkan. 105 Metode berbasis imunoafinitas yang dikembangkan oleh Chen et al. untuk isolasi EV dari pasien GBM dari volume kecil sampel darah dan sel yang dikultur patut diperhatikan. 72 Dalam perangkat tersebut, mereka menggunakan mikrokanal berlapis anti-CD63 untuk menangkap EV, karena mereka melihat bahwa itu diekspresikan secara berlebihan. Lebih jauh, mereka menunjukkan bahwa kuantitas dan kualitas EV yang ditangkap cukup untuk mendeteksi RNA eksosomal dan menilai RNA yang berasal dari tumor. Di sisi lain, Shao et al. mengembangkan sistem yang disebut analisis RNA eksosom imuno-magnetik (iMER), yang mengintegrasikan seleksi imunomagnetik, koleksi TNA, dan PCR waktu nyata dalam satu perangkat mikrofluida (Gambar 2 ). Dengan melakukan hal itu, mereka membandingkan profil eksosomal sampel GBM setelah pengobatan TMZ dan mampu mendeteksi kadar mRNA eksosomal dari O6-methylguanine DNA methyltransferase (MGMT) dan alkylurine-DNA-N-glycosylase (APNG) secara langsung dari sampel darah, yang mungkin merupakan penanda prediktif potensial untuk perolehan resistensi TMZ. 73 Karena itu, iMER dapat digunakan untuk memeriksa penanda diagnostik GBM, selain memungkinkan pemantauan efikasi obat secara real-time. Kelompok yang sama mengembangkan platform mikrofluidik lain untuk mendeteksi protein eksosomal. Oleh karena itu, penggunaan teknologi ini sebelum lisis dan deteksi mRNA dengan iMER dapat menjadi metode yang layak untuk mengekstrak informasi sebanyak mungkin dari sampel GBM. 106 , 107 Dalam penelitian lain, perangkat mikrofluidik yang disebut EV HB-Chip digunakan untuk mengisolasi EV dari sampel serum atau plasma pasien GBM. 74 Mereka mampu mendeteksi dan mengidentifikasi transkrip EGFRvIII yang relatif langka, serta gen yang spesifik untuk subtipe GBM. Dengan menggunakan EV HB-Chip, mereka menunjukkan spesifisitas EV tumor sebesar 94% dan tingkat deteksi sebesar 100 EV per μL. Akhirnya, penelitian Zhang dkk. mengembangkan platform analitis untuk memperoleh profil langsung dan multipleks dari RNA yang bersirkulasi dalam EV untuk karakterisasi GBM dalam darah. Teknologi tersebut, yang disebut kompleks enzim ZIF-8 untuk deteksi RNA digital regeneratif dan katalitik atau EZ-READ, menggunakan transduser responsif RNA untuk mengubah secara regeneratif dan meningkatkan secara katalitik sinyal dari target RNA langka yang ditemukan dalam EV dalam darah manusia. Teknologi ini memungkinkan pembentukan tanda-tanda spesifik untuk diagnosis dan subtipe dalam darah pasien GBM. 75

GAMBAR 2
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Platform iMER yang dikembangkan oleh Shao et al. 73 untuk mengkarakterisasi mRNA eksosomal dari sampel darah. (a) Platform iMER menyederhanakan pengayaan eksosom, ekstraksi RNA, dan analisis waktu nyata dengan menangkap eksosom kanker pada manik-manik magnetik, mengisolasi RNA melalui filter manik-manik kaca, dan memungkinkan transkripsi balik dan kuantifikasi dalam satu perangkat. (b) Mikrograf elektron pemindaian menunjukkan manik-manik magnetik yang difungsikan oleh antibodi terhadap EGFRvIII yang menangkap vesikel tumor. (c) Gambar perangkat iMER dengan 1 situs penangkapan imunomagnetik, 2 ekstraksi RNA, 3 transkripsi balik, dan 3 ruang qPCR untuk deteksi multipleks. Direproduksi berdasarkan syarat dan ketentuan lisensi Creative Commons Attribution (CC BY).

4.3 Asam nukleat tumor yang bersirkulasi dalam model mikrofluida
Dalam kategori ini, beberapa jenis molekul dapat ditemukan. cfDNA merujuk pada fragmen DNA dari 150–200 pasangan basa yang dilepaskan ke dalam cairan biologis terutama oleh sel-sel yang mengalami apoptosis, nekrotik, dan membelah dengan cepat serta CTC. Molekul cfDNA memiliki waktu paruh yang pendek (<1,5 jam), karena mereka cepat dihilangkan oleh fagositosis. Disebut ctDNA ketika fragmen tersebut milik sel tumor. 108 Ini mencakup 0,01%–10% dari keseluruhan DNA bebas sel dalam darah, tergantung pada lokasi tumor dalam darah, aktivitas tumor, atau pengobatan yang diterapkan. 109 Biasanya, kadar ctDNA pada individu yang sehat rendah (sekitar 10–15 ng/mL dalam plasma) dibandingkan dengan mereka yang memiliki tumor. Saat tumor membesar, lebih banyak sel melepaskan ctDNA. 110 Molekul ini dapat dibedakan berdasarkan ukurannya, peningkatan fragmentasi, dan mutasi yang tidak terdapat pada DNA sel sehat, menjadikannya biomarker penyakit. 111 ctDNA telah dipelajari secara ekstensif dalam berbagai jenis dan aplikasi kanker. Dalam kasus kanker kolorektal, mereka banyak digunakan untuk mengevaluasi respons dan adaptasi terhadap pengobatan. 112 – 114 Pada kanker payudara, keberadaannya telah diselidiki sebagai prediktor untuk kekambuhan, 115 , 116 respons, dan metastasis. 117 Temuan relevan pada ctDNA juga tersedia untuk jenis kanker lain seperti paru-paru 118 dan prostat, 119 antara lain. Dalam kasus glioblastoma, ada keterbatasan tertentu. Investigasi baru-baru ini menemukan mutasi pada 55% sampel plasma dari 222 pasien GBM menggunakan NGS, yang dapat menawarkan opsi yang layak untuk mengidentifikasi alternatif terapi berdasarkan penelitian genomik oleh ctDNA. 120 Namun, dalam sebagian besar penelitian, konsentrasi ctDNA yang diekstraksi lebih rendah dibandingkan dengan tumor lain karena adanya BBB. 110 , 121 Sebaliknya, CSF tampaknya kaya akan zat-zat ini, seperti yang ditampilkan dalam penelitian Wang et al. 122 Mereka mengungkapkan bahwa ctDNA dapat diidentifikasi melalui pengurutan eksom secara keseluruhan, yang memungkinkan analisis ekosistem GBM yang luas dapat dicapai tanpa menggunakan metode yang lebih intrusif.

Pola metilasi dalam DNA bebas sel juga muncul sebagai fitur genomik yang menjanjikan untuk mendeteksi keberadaan kanker dan menentukan asal-usulnya. 123 Penelitian telah menunjukkan bahwa profil metilasi DNA bebas sel yang dilepaskan dari tumor SSP dalam darah memungkinkan untuk mendeteksi penanda molekuler spesifik tumor. 124 Balaña dkk. menunjukkan bahwa profil metilasi promotor gen MGMT, p16, DAPK, dan RASSF1A dalam DNA yang berasal dari serum dari pasien GBM sangat sesuai dengan yang ditemukan dalam jaringan tumor yang cocok, menyoroti potensi profil cfDNA untuk karakterisasi tumor non-invasif. 125 Liu dkk. memeriksa hipermetilasi promotor dalam MGMT, p16INK4a, TIMP-3, dan THBS1, mengamati 100% spesifisitas dalam korelasi antara hipermetilasi DNA dalam serum dan LCS dengan jaringan tumor pada glioma. 126 Selain itu, mereka menemukan bahwa kadar metilasi MGMT, p16INK4a, dan THBS1 dalam serum glioma bersifat prediktif terhadap kelangsungan hidup keseluruhan yang lebih buruk, sementara hipermetilasi MGMT dan THBS1 dalam CSF berfungsi sebagai faktor prognostik untuk kelangsungan hidup bebas progresi. Demikian pula, Lavon dkk. menyelidiki hipermetilasi promotor MGMT, p16INK4a, TIMP-3, dan THBS1 dalam serum tumor tingkat rendah dan tinggi dan menemukan bahwa metilasi promotor MGMT sangat terkait dengan heterogenitas tumor, agresivitas, dan evolusi penyakit. 127 Estival dkk. mengevaluasi status metilasi MGMT dan konkordansinya di seluruh sampel darah utuh dan jaringan GBM yang dipasangkan menggunakan PCR spesifik metilasi (MSP) dan pyrosequencing (PYR). Hasil mereka menunjukkan sensitivitas yang lebih rendah dalam mendeteksi tanda metilasi pada cfDNA dibandingkan dengan jaringan tumor (sensitivitas rata-rata 31,5%), meskipun spesifisitas uji MSP dalam darah mencapai 96%, sedangkan metode PYR menunjukkan spesifisitas 76% dalam plasma.128 Untuk meningkatkan akurasi deteksi, Barault dkk. menerapkan uji Methyl-BEAMing pada cfDNA plasma dari pasien GBM, yang menunjukkan reproduktifitas, spesifisitas, dan sensitivitas yang tinggi untuk penilaian kuantitatif metilasi MGMT.129

Selain DNA, kategori ini juga mencakup ctRNA, yang terdiri dari mRNA, long non-coding RNA (lnRNA), dan small non-coding RNA (snRNA). Kelompok terakhir mencakup microRNA (miRNA). 108 miRNA adalah molekul kecil yang terdiri dari 19–25 pasangan basa dan merupakan molekul yang paling banyak beredar bebas dalam darah, meskipun miRNA juga terdapat dalam urin, air liur, dan CSF. 130 MiRNA dilepaskan oleh tumor dan sel inang ke dalam darah melalui apoptosis, nekrosis, atau sekresi aktif melalui EV atau terikat pada protein plasma. 131 MiRNA mengendalikan ekspresi gen pascatranskripsi dalam berbagai proses patologis dan nonpatologis, termasuk apoptosis, proliferasi, diferensiasi, migrasi, dan invasi, dan oleh karena itu merupakan biomarker yang menjanjikan untuk diagnosis kanker. 132 Khususnya, miR-21 dan miR-128 telah terbukti diekspresikan secara berlebihan pada pasien GBM, yang mendorong kelangsungan hidup dan invasi sel tumor. 133 , 134 Lebih jauh lagi, miR-21 telah terlibat dalam resistensi terhadap pengobatan, baik terhadap kemoterapi dan radioterapi. 135

Meskipun relevan, biopsi cair berdasarkan deteksi asam nukleat yang bersirkulasi telah dibatasi oleh jumlahnya yang rendah dalam darah, serta oleh teknik studi terkini, di mana tidak ada protokol standar untuk ekstraksi dan pemurnian sampel. 136 Dalam konteks ini, teknik mikrofluida dapat menjadi teknik yang berharga untuk mengisolasi dan menganalisis sebagian besar ctDNA dan menghindari degradasi atau lisis molekul. Misalnya, Kim et al. mengembangkan sistem lab-on-a-disc untuk mengisolasi cfDNA, yang dengannya mereka dapat mengisolasi 3 mL darah secara elektromagnetik dalam 30 menit, mengurangi risiko degradasi sampel. 137 Meskipun demikian, konsentrasi cfDNA memiliki variabilitas yang luas berdasarkan pasien, yang menjadi batasan ketika hanya ctDNA yang ada dalam proporsi kecil. Gwak et al. mengembangkan pusaran mikrofluida yang digabungkan dengan sorter cfDNA yang diaktifkan secara magnetik gradien. Dengan itu, perfusi sampel yang berkelanjutan dalam sistem memecahkan keterbatasan kuantitas. 138 Ou et al. menciptakan sistem yang menggabungkan pembagian tetesan mikrofluida, PCR multipleks fluoresen, dan teknologi penghitungan tetesan volume besar 3D mereka untuk membentuk sistem biopsi cair yang baru. Ini memungkinkan analisis total DNA tumor yang diperoleh dari sampel darah dengan spesifisitas 100%. 139 Selain itu, beberapa tes komersial telah disetujui oleh FDA untuk digunakan pada tumor padat. Ini adalah kasus Guardant360®, yang digunakan untuk menganalisis ctDNA dalam darah 140 ; ​​FoundationOne® Liquid, yang dapat mendeteksi ctDNA dan ctRNA dari sampel darah, mampu menganalisis hingga 300 gen 141 ; dan yang lain seperti uji Mutasi Cobas EGFR 142 dan Epi proColon®, khusus untuk kanker kolorektal. 143 Sebuah studi oleh Bruch et al. menciptakan biosensor mikrofluida untuk mendeteksi mikroRNA (miR-19b) dalam sampel serum dari anak-anak yang menderita medulloblastoma, tumor otak agresif. 144 Mereka menggabungkan teknologi CRISPR/Cas13a dengan sensor mikrofluida dan pembacaan elektrokimia untuk mendeteksi miRNA dengan sensitivitas dan selektivitas tinggi. Mereka memperoleh batas deteksi 10 pM dengan sampel kurang dari 1 μL, tanpa amplifikasi asam nukleat. Namun, saat ini belum ada sistem khusus GBM yang telah disetujui untuk identifikasi ctDNA atau ctRNA. Peningkatan sistem mikrofluida dapat menjadi kemajuan penting dalam pendeteksian molekul-molekul ini, dan kombinasi asam nukleat yang bersirkulasi dengan sistem pada chip dapat membuka jalan baru untuk mengisolasi dan menganalisis molekul-molekul ini secara molekuler dalam GBM.

4.4 Trombosit yang dididik tumor dalam model mikrofluida
Trombosit darah memainkan peran penting sebagai penanggap lokal dan sistemik selama tumorigenesis dan metastasis. 145 , 146 Ketika terpapar sel tumor, trombosit mengalami pendidikan yang diinduksi tumor, yang menyebabkan perilaku trombosit berubah. Proses ini, yang dikenal sebagai pembentukan trombosit yang dididik tumor, menghasilkan trombosit yang memperoleh tanda molekuler khusus tumor, termasuk protein dan RNA, yang mencerminkan karakteristik tumor. 147 – 149 Karena kemampuannya untuk menangkap informasi biologis utama dari tumor, TEP muncul sebagai biomarker non-invasif yang menjanjikan untuk biopsi cair, yang menawarkan wawasan berharga tentang diagnosis dan perkembangan kanker.

Pada tahun 2011, Nilsson et al. mengidentifikasi EGFRvIII sebagai biomarker RNA terkait kanker pada glioma. 150 Kemudian, Marx et al. mengamati peningkatan ekspresi CD63 dan ekspresi P-selectin pada trombosit yang bersirkulasi pada pasien GBM. 151 Best et al. melakukan pengurutan RNA untuk mengidentifikasi profil RNA yang disambung secara diferensial pada trombosit dari berbagai pasien dan mampu memprediksi individu yang sehat dan pasien GBM (di antara jenis kanker lainnya) dengan akurasi 96%, juga mengidentifikasi lokasi tumor primer dengan akurasi 71%. 152 Selain itu, mereka menetapkan bahwa 100–500 pg. dari total RNA trombosit cukup untuk diagnostik berbasis TEP. Sol et al. menganalisis profil RNA yang disambung TEP dan mengonfirmasi bahwa sampel dari pasien GBM mengandung profil TEP yang berbeda dibandingkan dengan mereka yang mengalami metastasis otak. Selain itu, mereka menemukan bahwa sidik jari TEP GBM tampak menurun setelah reseksi bedah tetapi muncul kembali selama perkembangan tumor, yang menunjukkan bahwa hal ini dapat menjadi metode yang berguna untuk membedakan perkembangan sejati dari perkembangan semu. 145

Mengenai perangkat mikrofluida, saat ini tidak ada perangkat yang difokuskan pada deteksi TEP dalam GBM. Mengenai kanker lainnya, Hao et al. mengembangkan sistem mikrofluida rekayasa mikro pada tahun 2021 yang memungkinkan perfusi trombosit manusia yang stabil. Sistem ini menciptakan model untuk memprediksi respons trombosit sebelum atau selama kemoterapi dengan doksorubisin. 153 Li et al. mendeskripsikan perangkat mikrofluida mirip kromatografi yang mengorelasikan status aktivasi trombosit dengan perkembangan tumor, yang menunjukkan potensi sensitif dan prediktif untuk kejadian trombotik pada pasien kanker, sehingga memandu pengobatan antitrombosis yang tepat waktu. 154 Di sisi lain, Ghosh et al. mengembangkan perangkat yang disebut aTME-Chip pada tahun 2024 untuk mempelajari fungsi TEP dalam lingkungan mikro tumor ovarium. 155 Dengan menggunakan perangkat ini, mereka mengamati bahwa TEP mempercepat angiogenesis tumor. Lebih jauh, limbah dari perangkat tersebut memungkinkan analisis perubahan ekspresi sitokin yang didorong oleh mekanisme trombosit.

4.5 Senyawa organik volatil dalam model mikrofluida
Selain molekul-molekul yang disebutkan di atas, ada sekelompok metabolit yang berpotensi dapat digunakan sebagai biomarker cair, yang disebut VOC. Seperti yang dijelaskan oleh WHO, 156 mereka adalah bahan kimia organik yang memiliki titik didih awal kurang dari atau sama dengan 250°C yang diukur pada tekanan atmosfer standar 101,3 kPa.157,158 VOC memiliki kemampuan untuk melewati BBB, menjadikannya kandidat yang ideal untuk menyelidiki perubahan dalam otak melalui biopsi darah.33 Seluruh rangkaian VOC yang dihasilkan oleh suatu organisme disebut “volatilome” dan studinya dikenal sebagai “volatolomik.” 159 Molekul – molekul ini diproduksi melalui metabolisme seluler dan dilepaskan ke dalam aliran darah , di mana mereka dapat dideteksi secara langsung, atau melalui paru-paru, urin, atau kulit.160,161

VOC diklasifikasikan ke dalam lima kelompok fungsional kimia: aldehida, keton, alkohol, hidrokarbon, dan senyawa aromatik. 159 , 162 Mereka memberikan wawasan tentang proses biokimia yang dipicu oleh stres oksidatif, peradangan, apoptosis, atau nekrosis. VOC yang terkait dengan penyakit dapat terjadi akibat serangkaian reaksi yang terjadi saat tubuh merespons kerusakan. Hal ini dapat menghasilkan metabolit baru atau mengubah kadar metabolit yang sudah ada. Misalnya, konversi sel normal menjadi sel kanker terkait dengan perubahan metabolisme yang berbeda, seperti efek Warburg. 163 – 167 Dalam beberapa tahun terakhir, VOC spesifik tumor semakin banyak diperkenalkan sebagai penanda tumor, dan bahkan protokol standar untuk pengumpulan dan analisis telah dikembangkan. 159 – 161 , 168 – 171

Dalam metode analitis yang telah dijelaskan untuk mendeteksi VOC, sistem spektrometri massa kromatografi gas mikroekstraksi fase padat (SPME-GC–MS) lebih disukai untuk memfasilitasi identifikasi dan kuantifikasi senyawa ini. Namun, metode lain yang tidak didasarkan pada spektrometri massa sedang dikembangkan secara paralel, seperti perangkat hidung elektronik (enose), 172 , 173 bio-sniffer 174 dan spektrometri mobilitas ion asimetris. 160 , 175 Perangkat hidung elektronik tidak cukup sensitif untuk mendeteksi VOC napas dalam kisaran ppb rendah, dapat dipengaruhi oleh kondisi sekitar (misalnya, kelembapan dan suhu), dan memiliki masa pakai terbatas. 172 Spektrometri mobilitas ion menghadirkan kompromi yang menarik antara teknik analitis klasik, meskipun masih dalam tahap pengembangan awal dan belum diadopsi secara luas dalam uji klinis. 160

Sejumlah artikel telah dipublikasikan tentang studi VOC; sebagian besar difokuskan pada analisis napas untuk mendeteksi kanker paru-paru 160 , 168 , 172 , 176 – 180 atau jenis kanker lain seperti kanker kolorektal, payudara, atau prostat. 170 , 171 Namun, VOC yang dipancarkan oleh napas adalah campuran kompleks dari unsur-unsur yang dipengaruhi oleh polutan eksternal, yang menunjukkan hilangnya informasi yang signifikan. Sebaliknya, deteksi VOC dalam sampel darah adalah metode yang lebih selektif untuk mengecualikan molekul dari sumber eksternal. Sejauh ini, tidak banyak informasi tentang karakterisasi VOC dalam darah dari pasien GBM. Namun, beberapa penelitian telah menunjukkan adanya metabolit ini pada pasien GBM dengan hasil yang tidak menguntungkan. 181 VOC ini terkait dengan jalur pentosa fosfat dan efek Warburg. Lebih jauh lagi, profil lipid pasien yang mengalami hasil yang tidak menguntungkan mengungkapkan heterogenitas yang lebih tinggi dalam kelimpahan lipid. Studi lain oleh Baranovičová dkk. mempelajari perubahan metabolit plasma darah basal pada pasien dengan tumor GBM primer, serta korelasinya dengan tingkat tumor. Mereka menemukan peningkatan signifikan dalam metabolit glikolitik seperti glukosa dan piruvat, dan kadar beberapa metabolit seperti tirosin dan fenilalanin berkorelasi secara eksklusif dengan tingkat tumor yang lebih tinggi, yang juga dikenal sebagai glioblastoma. 182

Dalam hal pendekatan mikrofluida untuk glioblastoma, hingga saat ini belum ada penelitian yang menggunakan perangkat mikrofluida untuk mendeteksi VOC secara langsung dalam sampel darah atau serum GBM. Satu-satunya penelitian oleh Bayona et al. mengembangkan teknologi mikrofluida organ-on-chip untuk menciptakan kembali lingkungan mikro tumor GBM dan mendeteksi serta menganalisis VOC yang dihasilkan. Pendekatan ini menggabungkan teknologi mikrofluida dengan sistem SPME-GC–MS. Dengan demikian, mereka dapat melihat peningkatan yang signifikan dalam beberapa aldehida, fenol, dan senyawa nitrogen, yang berkorelasi dengan yang diamati pada pasien. 76 Sebuah penelitian terkini, meskipun tidak difokuskan pada GBM, telah mengembangkan perangkat mikrofluida yang dapat membedakan dan mengklasifikasikan enam jenis aldehida gas yang berbeda dalam kisaran 100 bagian per triliun dengan efisiensi 81%. 183 Perangkat ini mengintegrasikan platform konsentrator bersama dengan deteksi hamburan Raman yang ditingkatkan permukaan yang andal dan berpotensi dapat diterapkan untuk mempelajari VOC pada pasien GBM. Oleh karena itu, deteksi VOC dengan penggunaan mikrofluida dapat sangat relevan dalam diagnosis dan pemantauan tumor pada tahap awal (Gambar 3 ).

GAMBAR 3
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Protokol skematis potensi penggunaan VOC di masa depan sebagai biomarker cair pada glioblastoma.

5 KESIMPULAN DAN PERSPEKTIF MASA DEPAN
Diagnosis dini tumor otak, khususnya glioblastoma, masih menjadi tantangan yang signifikan karena tumor tidak dapat diakses dan sifat gejalanya yang tidak spesifik, yang sering tumpang tindih dengan kondisi yang lebih jinak. Akibatnya, GBM biasanya didiagnosis pada stadium lanjut, membatasi pilihan pengobatan dan memperburuk prognosis. Ada kebutuhan untuk mengembangkan metode diagnostik yang kurang invasif, dan yang terpenting, yang memungkinkan pemantauan pasien secara berkala atau bahkan skrining populasi berisiko untuk deteksi dini. Biopsi cair telah muncul sebagai metode yang menjanjikan untuk diagnosis GBM, karena hanya memerlukan sampel darah dan biomarker GBM yang berkarakterisasi dengan baik untuk diterapkan. Meskipun menjanjikan, mendeteksi biomarker yang relevan dalam darah, seperti CTC, EV, cfNAss, atau VOC, tetap menjadi tantangan karena konsentrasinya yang rendah dan keterbatasan teknik isolasi saat ini. Dalam hal ini, teknologi mikrofluida, dengan kapasitasnya untuk manipulasi cairan presisi tinggi pada skala mikro-nano, menawarkan solusi yang menjanjikan dengan meningkatkan efisiensi, selektivitas, dan sensitivitas deteksi biomarker dalam biopsi cair. Kemampuan untuk mengendalikan volume cairan kecil secara tepat meningkatkan akurasi diagnostik dan memberikan peluang untuk pemantauan perkembangan penyakit secara real-time, yang pada akhirnya dapat berkontribusi pada manajemen pasien yang lebih baik.

Seperti yang dibahas dalam tinjauan ini, beberapa perangkat telah dikembangkan untuk mendeteksi glioblastoma, terutama yang menargetkan CTC dan EV. Namun, bidang ini masih belum banyak dieksplorasi, dan molekul berbasis darah lainnya dapat memainkan peran penting dalam meningkatkan deteksi GBM. Meskipun ada kemajuan terkini, rendahnya kelimpahan biomarker dan terbatasnya sensitivitas platform saat ini menghadirkan kendala utama. Peningkatan parameter ini sangat penting untuk keandalan uji biopsi cair, terutama untuk mendeteksi biomarker dengan kelimpahan rendah. Lebih jauh lagi, pengembangan protokol standar untuk isolasi biomarker, fabrikasi platform, dan analisis data sangat penting untuk memastikan konsistensi dan reproduktifitas teknologi mikrofluida di berbagai laboratorium dan lingkungan klinis. Tidak adanya protokol tersebut tetap menjadi hambatan signifikan terhadap adopsi teknologi ini secara lebih luas. Selain itu, biaya yang terkait dengan pengembangan dan komersialisasi perangkat mikrofluida, terutama yang mengintegrasikan kemampuan canggih seperti pemantauan waktu nyata dan multiplexing, tinggi. Mengoptimalkan sistem ini agar hemat biaya tanpa mengorbankan kinerja akan menjadi kunci untuk adopsi klinis yang luas.

Untuk mengatasi tantangan ini, inovasi interdisipliner diperlukan. Kombinasi biopsi cair berbasis mikrofluida dengan teknologi baru lainnya, seperti pengurutan generasi berikutnya, pencitraan canggih, dan pendekatan multi-omik, dapat memberikan gambaran yang lebih komprehensif tentang GBM, memfasilitasi deteksi dini dan perawatan yang lebih personal. Sistem lab-on-a-chip menunjukkan janji khusus untuk aplikasi POC, yang memungkinkan perangkat portabel yang memfasilitasi pemantauan GBM secara real-time dan non-invasif. Pendekatan ini dapat memungkinkan penilaian pasien yang sering tanpa perlu prosedur invasif. Integrasi mikrofluida berbasis tetesan dapat lebih meningkatkan sensitivitas deteksi dengan meningkatkan isolasi biomarker dan memungkinkan analisis throughput tinggi. Selain itu, kecerdasan buatan dapat merevolusi analisis data, memungkinkan interpretasi yang lebih akurat dari kumpulan data yang kompleks dan meningkatkan kinerja diagnostik. Faktanya, pembelajaran mesin telah digunakan untuk meningkatkan penilaian CTC 184 dan deteksi kanker dini. 185

Seiring dengan semakin sensitif dan canggihnya platform mikrofluida, platform tersebut dapat meningkatkan tingkat deteksi dini dan memungkinkan pendekatan diagnostik yang lebih personal, sehingga menghasilkan terapi yang lebih tepat sasaran. Selain itu, pengembangan perangkat POC portabel dapat menjadikan pemantauan non-invasif secara real-time sebagai opsi yang layak bagi pasien GBM. Secara bersamaan, kombinasi mikrofluida dan biopsi cair sangat menjanjikan untuk meningkatkan diagnosis dini, manajemen pasien, dan hasil keseluruhan bagi pasien yang menderita glioblastoma.