Partikel Asam Salisilat Polimer Berbentuk Batang Mengatur Migrasi Transendotel Neutrofil dalam Peradangan Akut

Abstrak
Peradangan neutrofilik hadir dalam banyak patologi dengan angka kematian tinggi, termasuk sepsis, trombosis vena dalam, dan cedera paru akut (ALI). Oleh karena itu, pengaturan perekrutan neutrofil menjadi pendekatan terapeutik yang menarik untuk peradangan yang dimediasi neutrofil. Di sini, dampak partikel polimer berbasis asam salisilat dalam mengatur perekrutan neutrofil secara in vivo dan in vitro, khususnya menyelidiki dampak penargetan neutrofil melalui fagositosis yang digerakkan oleh geometri partikel dieksplorasi. Ditemukan bahwa partikel polimer berbentuk batang dapat meningkatkan penargetan neutrofil dalam model ALI murine, secara efektif mencegah infiltrasi neutrofil ke paru-paru tikus dibandingkan dengan partikel bulat dengan volume yang sama. Ditunjukkan bahwa sifat memanjang dari pembawa polimer mengurangi kemampuan transmigrasi neutrofil melintasi penghalang endotel secara in vivo dan in vitro, yang berkontribusi pada efektivitas terapeutiknya. Data ini merupakan pekerjaan awal dalam mengembangkan penargetan neutrofil aktif yang dimediasi partikel non-bulat untuk kondisi yang dipengaruhi oleh cedera neutrofilik.

1 Pendahuluan
Neutrofil merupakan 50–70% dari populasi sel darah putih yang beredar di tubuh manusia. Meskipun neutrofil adalah sel yang berumur pendek, mereka memainkan peran yang mendasar, sebagai penanggap pertama dalam peradangan. [ 1 , 2 ] Dalam invasi atau cedera patogenik, neutrofil ditangkap dari sirkulasi setelah merasakan rangsangan inflamasi dan melekat pada endotelium yang meradang karena interaksi pengikatan ligan sel endotel-neutrofil, yang menyebabkan keluarnya mereka dengan cepat dari aliran darah. [ 1 , 3 ] Setelah neutrofil melewati penghalang vaskular, mereka melakukan fungsi efektor yang berbeda untuk mengelola dan menahan peradangan, termasuk menghilangkan patogen yang menyerang melalui fagositosis, pelepasan granula, dan sekresi perangkap ekstraseluler neutrofil (NET) untuk menjebak dan membunuh mikroorganisme. [ 1 , 4 , 5 ]

Sementara aksi neutrofilik merupakan aspek penting dari respons imun bawaan, neutrofil yang diaktifkan juga dapat memperkuat fungsi perekrutan dan efektornya, yang menyebabkan akumulasi neutrofil yang tidak terkendali dan cedera jaringan di tempat yang meradang. [ 1 , 2 ] Memang, fungsi neutrofil yang tidak terbatas hadir dalam patogenesis berbagai macam penyakit, termasuk sindrom gangguan pernapasan akut (ARDS), [ 6 ] sepsis, [ 7 ] stroke iskemik, [ 8 ] dan trombosis vaskular. [ 9 , 10 ] Oleh karena itu, upaya penelitian telah mengeksplorasi pengekangan respons neutrofil bawaan untuk mengendalikan kerusakan jaringan yang dimediasi oleh neutrofil. Namun, pendekatan potensial ini memiliki hasil yang terbatas karena kompleksitas dan heterogenitas setiap kondisi. [ 1 ] Misalnya, pengobatan farmakologis dengan sivelestat, penghambat elastase neutrofil yang digunakan untuk mengelola peradangan paru pada ARDS, telah menunjukkan kemanjuran klinis yang terbatas atau beragam. [ 11 – 13 ] Demikian pula, terapi anti-perekat yang mengganggu perekrutan leukosit gagal menunjukkan manfaat klinis pada berbagai patologi yang didorong oleh neutrofil pada manusia. [ 14 – 16 ]

Sebagai alternatif, penelitian terbaru telah mengeksplorasi penargetan leukosit dengan pembawa obat partikulat untuk memodulasi fungsi sel imun yang menyusup. [ 2 , 17 ] Secara khusus, para peneliti telah menerapkan partikel untuk menghambat interaksi neutrofil dengan endotelium untuk mengendalikan akumulasi neutrofil di area yang meradang akut dan mencegah kerusakan organ lebih lanjut. [ 18 – 26 ] Misalnya, penelitian sebelumnya melaporkan bahwa internalisasi nanopartikel albumin yang dimuat piceatannol oleh neutrofil yang diaktifkan mengurangi jumlah sel yang menempel pada venula yang meradang dan mencegah transmigrasi leukosit. [ 21 ] Demikian pula, beberapa penelitian terbaru telah mengungkapkan bahwa fagositosis pembawa polimer bebas muatan oleh neutrofil yang diaktifkan juga dapat membatasi pergerakan leukosit ke area yang meradang dan menunjukkan bahwa manfaat terapeutik partikel melampaui kandungan obat yang dimuat. [ 18 , 19 , 22 , 23 ] Khususnya, semua pendekatan yang disebutkan di atas mengandalkan fagositosis partikel neutrofil untuk mengurangi respons inflamasi.

Penelitian terbaru oleh Safari dkk. mempelajari kemampuan neutrofil primer manusia untuk menginternalisasi partikel polimer memanjang. Berbeda dengan fagosit lain seperti makrofag dan monosit, neutrofil menunjukkan peningkatan internalisasi partikel berbentuk batang dibandingkan dengan pembawa berbentuk bola dengan volume yang sama. [ 27 ] Penyimpangan dari literatur ini mengilhami kami untuk menyelidiki dampak partikel memanjang pada penargetan neutrofil melalui mekanisme fagositosis. Dengan demikian, kami berhipotesis bahwa partikel berbentuk batang dapat berfungsi sebagai pembawa partikulat untuk meningkatkan penargetan neutrofil yang diaktifkan dalam peradangan akut.

Untuk menguji hipotesis ini, kami membuat partikel polimer berbasis asam salisilat (Poly-SA) yang bebas muatan, antiinflamasi, dan dapat terurai secara hayati. Polimer Poly-SA adalah polimer poli(anhidrida-ester) turunan salisilat yang dirancang untuk pelepasan asam salisilat yang terkendali. [ 28 , 29 ] Asam salisilat memberikan sifat antiinflamasi dengan menghambat transkripsi siklooksigenase-2, sehingga mengurangi pembentukan prostaglandin pro-inflamasi. [ 30 , 31 ] Baru-baru ini, pembawa partikulat yang dibuat dengan polimer Poly-SA telah terbukti memodulasi respons inflamasi neutrofil setelah fagositosis partikel. Partikel Poly-SA secara efektif telah memblokir transmigrasi neutrofil dalam model tikus bakteri ARDS, [ 19 ] mengurangi adhesi agregat neutrofil-trombosit dalam model tikus tromboinflamasi, [ 22 ] dan mengurangi perkembangan dan pembentukan NET. [ 32 ] Dalam penelitian ini, kami membuat partikel Poly-SA berbentuk bulat dengan ukuran 500 nm, 1 µm, dan 2 µm dan meregangkannya dengan panas untuk membentuk partikel Poly-SA memanjang dengan aspect ratio (AR) 6. Dengan menggunakan model cedera paru akut (ALI) murine, kami membandingkan kemampuan batang dan bola Poly-SA untuk memodulasi transmigrasi neutrofil ke lokasi peradangan. Kami mengamati perbedaan dalam kemanjuran pemblokiran infiltrasi neutrofil berdasarkan bentuk partikel. Lebih jauh, kami menunjukkan bahwa kemampuan transmigrasi neutrofil bermuatan partikel melintasi penghalang endotel yang meradang dapat dicegah berdasarkan bentuk pembawa.

2 Hasil
2.1 Neutrofil Tikus dan Manusia Mudah Memfagositosis Bola dan Batang Poli-SA dengan Berbagai Ukuran
Penelitian sebelumnya melaporkan bahwa neutrofil dapat memfagositosis partikel polimer berbentuk batang lebih efisien daripada bola dengan volume yang sama, dan penyerapan partikel berbentuk batang ini membaik dengan peningkatan AR (AR ≥ 5). [ 26 , 27 ] Jadi, pertama-tama kami mengonfirmasi penyerapan neutrofil tikus terhadap batang Poly-SA AR tinggi dan bola Poly-SA. Dengan menggunakan teknik peregangan film yang dijelaskan sebelumnya, kami memanfaatkan bola Poly-SA 500 nm, 1 µm, dan 2 µm untuk membuat partikel Poly-SA berbentuk batang AR 6 ( Gambar 1A ). [ 27 , 33 ] Sumbu mayor dan minor untuk setiap jenis batang Poly-SA tercantum dalam Tabel S1 (Informasi Pendukung).

Gambar 1
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Penyerapan ex vivo bola-bola Poly-SA dan batang-batang AR6 oleh neutrofil tikus. A) Gambar mikroskop elektron pemindaian (SEM) bola-bola polimer Poly-SA berukuran 500 nm, 1 µm, dan 2 µm dan batang-batang AR6 turunan yang dibuat melalui teknik peregangan panas. Batang skala (batang putih) adalah 1 µm untuk bola-bola dan batang-batang. B) Persentase neutrofil tikus yang menyerap bola-bola Poly-SA berlabel rhodamin dan batang-batang AR6 dengan diameter bola ekivalen 500 nm, 1 µm, dan 2 µm. Darah tikus diperoleh melalui tusukan jantung, dan konsentrasi partikel ditetapkan pada 107 partikel mL −1 dari darah tikus utuh yang dikumpulkan untuk semua jenis dan ukuran partikel. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan analisis varians satu arah (ANOVA) dengan uji-ulang Tukey dan interval kepercayaan 95% untuk (B). Tidak adanya simbol/nilai menunjukkan tidak adanya signifikansi statistik. Lingkaran dalam (B) mewakili sampel darah tikus yang dikumpulkan secara individual yang diobati dengan partikel ( n = 4).
Kami memperoleh darah tikus segar yang dikumpulkan melalui tusukan jantung dari sedikitnya lima tikus BALB/c yang sehat dan menginkubasi darah tikus dengan bola atau batang Poly-SA berlabel rhodamine selama 2 jam pada suhu 37 °C dan 5% CO 2 . Kami mengidentifikasi neutrofil tikus menggunakan flow cytometry sebagai sel CD11b + Ly6G + dan selanjutnya membedakannya dengan plot hamburan cahaya dan mendeteksi neutrofil tikus positif partikel dengan sinyal positif untuk rhodamine (Gambar S1 , Informasi Pendukung). Kami menemukan bahwa persentase neutrofil tikus yang menginternalisasi batang Poly-SA AR 6 500 nm, 1 µm, dan 2 µm secara signifikan lebih tinggi daripada neutrofil yang memfagositosis bola dengan volume yang setara (Gambar 1B ). Secara khusus, asosiasi neutrofil tikus dengan batang Poly-SA 500 nm meningkat sebesar 36% relatif terhadap bola 500 nm. Demikian pula, batang Poly-SA berukuran 1 µm dan 2 µm menunjukkan peningkatan internalisasi partikel sebesar 26% dan 35% dibandingkan dengan bola masing-masing.

Kami juga mengamati bahwa neutrofil tikus umumnya lebih terkait dengan batang dan bola Poly-SA 500 nm dan 1 µm daripada partikel 2 µm, seperti yang ditunjukkan oleh persentase sel positif partikel yang lebih tinggi (Gambar 1B ). Hasil 500 nm sangat menarik karena nanopartikel menimbulkan risiko lebih rendah untuk menyebabkan oklusi pada kapiler yang lebih kecil. [ 2 ] Oleh karena itu, kami menyelidiki potensi terapeutik pembawa Poly-SA berukuran nano karena hanya pembawa berukuran mikro yang telah digunakan sebelumnya. [ 19 , 22 , 32 ] Pekerjaan sebelumnya menunjukkan bahwa pelepasan asam salisilat dari mikropartikel Poly-SA di dalam sel membantu menjinakkan aktivasi neutrofil selama peradangan. [ 19 , 32 ] Namun, tidak jelas apakah nanopartikel Poly-SA 500 nm akan memiliki efek yang sama mengingat matriks polimernya yang lebih kecil dan kandungan asam salisilat yang lebih rendah daripada partikel berukuran mikron (Gambar S2 , Informasi Pendukung). Dengan demikian, kami menyelidiki pelepasan CD62L, ciri khas aktivasi neutrofil, pada neutrofil manusia positif partikel 500 nm setelah paparan lipopolisakarida (LPS). [ 2 , 34 ] Tidak seperti partikel Poly-SA berukuran mikron, batang dan bola Poly-SA 500 nm tidak mencegah pelepasan CD62L pada neutrofil positif partikel setelah paparan LPS (Gambar S3 , Informasi Pendukung). Karena kurangnya aktivitas anti-inflamasi dari pembawa Poly-SA 500 nm pada neutrofil aktif, kami melanjutkan mengevaluasi partikel batang Poly-SA 1 µm dalam percobaan in vivo lebih lanjut, mengingat laju penyerapannya yang serupa dengan batang 500 nm.

Berikutnya, kami mengevaluasi penyerapan kompetitif batang dan bola Poly-SA 1 µm oleh monosit tikus dalam darah tikus. Kami mengidentifikasi monosit tikus sebagai CD11b + Ly6G − Ly6C + dan menentukan monosit tikus positif-partikel dengan mendeteksi sinyal positif rhodamine (Gambar S4 , Informasi Pendukung). Mirip dengan penelitian sebelumnya, kami mengamati perbedaan minimal dalam cara monosit dalam darah tikus memfagositosis bola Poly-SA versus batang (Gambar S5 , Informasi Pendukung), berbeda dengan penyerapan partikel yang terlihat pada neutrofil tikus (Gambar 1B ). Dengan demikian, hasil kami menunjukkan bahwa neutrofil tikus menunjukkan peningkatan 4,6 kali lipat dalam fagositosis pembawa yang memanjang jika dibandingkan dengan partikel berbentuk batang yang difagositosis oleh monosit tikus.

Kami juga mengevaluasi internalisasi partikel Poly-SA oleh neutrofil manusia primer. Kami mengidentifikasi neutrofil manusia menggunakan flow cytometry menggunakan sel CD11b + , membuat perbedaan lebih lanjut menggunakan panel hamburan maju dan hamburan samping, dan menentukan neutrofil manusia positif-partikel dengan sinyal positif untuk rhodamine (Gambar S6A , Informasi Pendukung). Kami menemukan bahwa neutrofil manusia menunjukkan asosiasi partikel yang setara dengan bola dan batang Poly-SA dari setiap ukuran (Gambar S6B , Informasi Pendukung). Untuk menyelidiki apakah tingkat fagositosis yang sama yang diamati disebabkan oleh internalisasi partikel yang dimaksimalkan pada skala waktu yang dipilih (yaitu, 2 jam), kami kemudian mengevaluasi laju penyerapan partikel Poly-SA dalam darah manusia. Kami menginkubasi seluruh darah manusia dengan bola dan batang Poly-SA 1 µm dan mencatat persentase neutrofil positif-partikel pada 15, 30, 60, dan 120 menit setelah penambahan partikel. Anehnya, neutrofil manusia primer memfagositosis batang dan bola Poly-SA 1 µm pada tingkat yang sama, tanpa perbedaan signifikan yang diamati antara bola dan batang pada titik waktu mana pun (Gambar S7 , Informasi Pendukung). Kami berhipotesis bahwa persentase penyerapan partikel batang dan bola Poly-SA yang serupa dalam darah manusia dapat disebabkan oleh heterogenitas ukuran partikel Poly-SA dan variasi pada setiap donor manusia.

Meskipun persentase neutrofil manusia yang menginternalisasi batang dan bola sama, batang Poly-SA masih menunjukkan selektivitas terhadap neutrofil. Kami mengulangi uji penyerapan partikel dengan monosit THP-1 dan menemukan penurunan 77% dalam fagositosis batang Poly-SA dibandingkan partikel bola, mirip dengan tren yang diamati pada monosit tikus (Gambar S8 , Informasi Pendukung).

2.2 Partikel dan Bola Poli-SA Berbentuk Batang dengan Volume yang Sama Mengatur Akumulasi Neutrofil di Ruang Alveolar Tikus dengan Cedera Paru yang Diinduksi LPS
Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa pembawa berbentuk bola yang difagositosis oleh neutrofil yang bersirkulasi mengganggu kemampuan sel untuk berinteraksi dengan endotelium yang meradang, sehingga mengurangi transmigrasi neutrofil. [ 2 , 18 , 19 , 21 ] Mengingat neutrofil lebih menyukai dan lebih banyak menyerap pembawa yang memanjang daripada yang berbentuk bola, kami berhipotesis bahwa penggunaan partikel berbentuk batang dapat meningkatkan penyumbatan pergerakan neutrofil ke tempat peradangan. Untuk menguji hipotesis ini, kami menggunakan model ALI tikus untuk mengevaluasi dampak partikel memanjang Poly-SA pada transmigrasi neutrofil selama peradangan akut.

Tikus BALB/c menerima LPS secara orotrakeal untuk menginduksi peningkatan molekul adhesi leukosit pada endotelium paru, yang menyebabkan perekrutan neutrofil ke wilayah udara. [ 6 , 35 , 36 ] Satu jam setelah pemberian LPS, kami menyuntikkan tikus dengan ≈20 mg k −1 g bola atau batang Poly-SA 1 µm (4 × 108 partikel per tikus) melalui vena ekor dan menilai migrasi neutrofil ke paru-paru yang meradang 2 jam setelah injeksi partikel. Gambar 2A menunjukkan skema untuk prosedur ini, di mana kami mengumpulkan cairan lavage bronkoalveolar (BALF) dan darah utuh dari tikus untuk menentukan jumlah neutrofil yang bertransmigrasi ke wilayah udara dan neutrofil yang bersirkulasi dalam darah.

Gambar 2
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Karakterisasi akumulasi neutrofil dalam BALF setelah pemberian partikel Poly-SA dalam model cedera paru-paru tikus yang diinduksi LPS. A) Diagram jadwal pemberian dosis instillasi LPS dan injeksi intravena partikel Poly-SA pada tikus BALB/c. B) Jumlah rata-rata total sel darah putih (WBC), C) distribusi populasi neutrofil, dan D) jumlah sel neutrofil dalam BALF setelah pengobatan partikel. E) Konsentrasi neutrofil dalam darah tikus setelah instillasi LPS dan pemberian partikel Poly-SA. Darah tikus dikumpulkan melalui tusukan jantung. Jumlah total WBC dan persentase sel leukosit untuk darah tikus dan BALF ditentukan masing-masing menggunakan hemasitometer dan flow cytometry. Analisis statistik dilakukan dengan ANOVA satu arah dengan uji LSD Fisher dan interval kepercayaan 95%. Lingkaran mewakili replikasi biologis yang diperoleh dari kelompok tikus ( n   ≥ 11). Gambar 2A dibuat dengan BioRender ( https://BioRender.com/x54j031 ).
Untuk menilai transmigrasi neutrofil, kami mengevaluasi jumlah total leukosit di BALF, persentase neutrofil di BALF, dan total neutrofil yang ditransmigrasikan BALF (Gambar 2B–D ). Tikus yang hanya menerima LPS menunjukkan peningkatan signifikan dalam infiltrat BALF dibandingkan dengan kontrol sehat, yang menunjukkan peradangan paru-paru. Namun, kami mengamati bahwa injeksi intravena batang dan bola Poly-SA 1 µm secara signifikan mengurangi jumlah total leukosit di BALF. Tikus yang diobati dengan batang Poly-SA menunjukkan penurunan 42% dalam jumlah total leukosit di BALF relatif terhadap tikus yang hanya menerima LPS. Sebaliknya, tikus yang diobati dengan bola Poly-SA menunjukkan penurunan 22% leukosit BALF (Gambar 2B ).

Pengurangan leukosit dalam BALF tikus yang diobati dengan partikel secara langsung berkorelasi dengan penurunan komposisi BALF dan jumlah neutrofil (Gambar 2C,D ). Tikus BALB/c yang menerima batang Poly-SA 1 µm menunjukkan pengurangan yang signifikan dalam jumlah neutrofil yang ditransmigrasi, dengan penurunan 59% dibandingkan dengan tikus LPS saja dan sesuai dengan 50% dari sel BALF yang dikumpulkan. Tikus yang diobati dengan bola Poly-SA 1 µm juga secara signifikan mengurangi akumulasi neutrofil yang ditransmigrasi di wilayah udara ALI tetapi pada tingkat yang lebih rendah, dengan penurunan 33% dari kelompok LPS saja dan meliputi 59% dari sel BALF. Dengan demikian, batang Poly-SA 1 µm mencegah akumulasi neutrofil di ruang alveolar lebih efektif daripada bola, yang mewakili perbedaan 48% dalam jumlah neutrofil rata-rata antara kedua kelompok (Gambar 2D ). Hasilnya menunjukkan bahwa batang Poly-SA mungkin mengungguli bola karena fagositosis partikel batang yang ditingkatkan dan selektif.

Berikutnya, kami berusaha mengevaluasi konsentrasi neutrofil dalam darah karena penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa jumlah leukosit yang bersirkulasi dapat bervariasi setelah perawatan partikel karena leukosit darah berpisah dari lokasi cedera. [ 18 , 23 , 24 ] Seperti yang digambarkan dalam Gambar 2E , instilasi LPS lokal di paru-paru secara signifikan meningkatkan neutrofil yang bersirkulasi dalam darah tikus yang hanya diberi LPS dibandingkan dengan kontrol yang sehat. Perawatan tikus yang terluka karena LPS dengan partikel Poly-SA menurunkan jumlah neutrofil yang bersirkulasi sebesar 61% untuk batang Poly-SA dan 53% untuk bola Poly-SA dibandingkan dengan kelompok tikus LPS. Kami tidak mengamati variasi statistik dalam konsentrasi neutrofil dalam darah antara tikus yang dirawat dengan batang Poly-SA dan bola. Penekanan neutrofil yang bersirkulasi setelah injeksi partikel ini konsisten dengan penelitian sebelumnya yang menggunakan pembawa polimer dalam ALI. [ 18 ]

2.3 Neutrofil Tikus yang Berhubungan dengan Partikel Poli-SA Berbentuk Batang Terakumulasi di Jaringan Paru Tikus yang Mengalami LPS
Penelitian sebelumnya telah menentukan bahwa neutrofil yang memfagositosis pembawa berbentuk bola dapat mengalihkan sel-sel tersebut dari lokasi cedera dan mengumpulkannya di organ-organ seperti hati dan limpa selama peradangan. [ 18 , 23 , 24 ] Namun, informasi terbatas tentang biodistribusi tingkat seluler dari partikel non-bola diketahui. Oleh karena itu, kami menyelidiki bagaimana partikel memanjang mempengaruhi distribusi neutrofil di antara berbagai organ model tikus ALI kami. Tikus BALB/c menerima LPS dan diobati dengan batang atau bola Poly-SA berlabel Cy5.5 (1 µm) seperti yang dijelaskan sebelumnya di atas. Kami mengevaluasi distribusi neutrofil positif partikel 2 jam setelah pengobatan partikel menggunakan suspensi sel tunggal yang dikumpulkan dari paru-paru, hati, limpa, darah, dan BALF tikus ALI. Kami mengidentifikasi neutrofil positif partikel di organ-organ tersebut dengan sinyal positif Cy5.5.

Pertama, kami menemukan bahwa neutrofil tikus yang bersirkulasi lebih banyak berasosiasi dengan batang Poly-SA 1 µm daripada dengan bola Poly-SA dengan volume yang sama secara in vivo, seperti yang ditunjukkan oleh jumlah sel yang secara signifikan lebih tinggi ( Gambar 3A ) dan persentase neutrofil darah (Gambar S9A , Informasi Pendukung) yang berasosiasi dengan batang relatif terhadap bola. Hasil in vivo melengkapi hasil ex vivo yang ditunjukkan pada Gambar 1B . Memang, peningkatan lipat dalam fagositosis neutrofil partikel memanjang dibandingkan dengan bola lebih besar secara in vivo daripada secara ex vivo. Batang Poly-SA (1 µm) menunjukkan peningkatan tiga kali lipat dalam persentase neutrofil positif partikel di atas bola 1 µm secara in vivo (Gambar S9A , Informasi Pendukung) dibandingkan dengan peningkatan 1,3 kali lipat untuk pengujian ex vivo (Gambar 1B ).

Gambar 3
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Akumulasi partikel neutrofil dalam darah, BALF, limpa, hati, dan paru-paru dalam model cedera paru tikus yang diinduksi LPS. Populasi neutrofil tikus CD45 + CD11b + Ly6G + yang dikaitkan dengan batang atau bola Poly-SA dalam ALI A) darah, B) BALF, C) limpa, D) hati, dan E) paru-paru. Gambar fluoresensi neutrofil tikus yang diperoleh dari jaringan paru-paru tikus yang diobati dengan F) bola Poly-SA dan G) batang Poly-SA. Gambar mewakili data dari panel (E). Neutrofil tikus ditunjukkan dengan warna merah, dan bola dan batang Poly-SA ditunjukkan dengan warna cyan. Kami melihat peningkatan jumlah neutrofil yang dikaitkan dengan batang Poly-SA dibandingkan dengan bola dengan volume yang sama di jaringan paru-paru, seperti yang terlihat pada panel close-up. Skala batang untuk (F,G) adalah 20 µm. Analisis statistik dilakukan untuk panel A hingga E dengan uji t -Student yang tidak berpasangan . Lingkaran mewakili replikasi biologis yang diperoleh dari organ tikus ( n = 5).
Menariknya, kami menemukan bahwa neutrofil partikel-positif dapat bertransmigrasi dari darah ke wilayah udara pada tikus yang kekurangan LPS, ditunjukkan oleh sinyal partikel positif dalam populasi neutrofil BALF. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3B , ≈2500 neutrofil BALF bersifat positif-bola, dan ≈1500 bersifat positif-batang. Angka-angka ini sesuai dengan ≈15% neutrofil BALF dari tikus yang diobati dengan bola Poly-SA bersifat positif-partikel, sementara ≈8% neutrofil BALF yang diperoleh dari tikus yang diobati dengan batang bersifat positif-partikel (Gambar S9B , Informasi Pendukung). Jumlah neutrofil partikel-positif dan persentase sel partikel-positif antara kelompok batang dan bola dalam BALF tidak signifikan secara statistik.

Lebih jauh, kami mengevaluasi distribusi neutrofil partikel-positif di limpa, hati, dan paru-paru. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3C , tikus ALI yang disuntik dengan bola Poly-SA memiliki ≈450.000 neutrofil partikel-positif per gram limpa. Sementara itu, tikus yang diobati dengan batang Poly-SA memiliki ≈300.000 neutrofil partikel-positif per gram organ. Hitungan mentah neutrofil partikel-positif ini tidak signifikan dan mewakili ≈30% dari total neutrofil yang diperoleh dari partikel limpa tikus ALI untuk perawatan batang dan bola (Gambar S9C , Informasi Pendukung). Jumlah total neutrofil yang diperoleh dari semua organ dan digunakan untuk menghitung nilai persentase partikel positif tercantum dalam Gambar S10 (Informasi Pendukung).

Berlawanan dengan data limpa, kami menemukan peningkatan signifikan dalam neutrofil positif-sfera yang terakumulasi di hati dibandingkan dengan sel-sel batang-positif. Secara khusus, kami memulihkan ≈2200 neutrofil positif-partikel per gram hati tikus ALI yang diobati dengan sfera Poly-SA dibandingkan dengan ≈1200 sel positif-partikel per gram hati untuk tikus yang diobati dengan batang Poly-SA (Gambar 3D ). Kami mengonfirmasi hasil ini menggunakan irisan histologis imunofluoresensi dari sampel hati dari tikus yang diobati dengan Poly-SA, di mana kami mengamati lebih banyak ko-lokalisasi neutrofil Ly6G + (kuning) dan partikel Cy5.5-Poly-SA (merah) pada tikus yang diobati dengan sfera 1 µm dibandingkan dengan batang (Gambar S11 , Informasi Pendukung). Temuan ini konsisten dengan pekerjaan sebelumnya yang menunjukkan bahwa neutrofil yang terkait dengan partikel polimer sfera ditemukan di hati selama peradangan paru-paru yang diinduksi LPS. [ 18 , 19 ] Jumlah partikel positif ini, meskipun signifikan, setara dengan ≈25% dari total neutrofil yang diperoleh dari jaringan hati yang terkait dengan batang atau bola Poly-SA (Gambar S9D , Informasi Pendukung).

Tidak seperti hati, kami menemukan lebih banyak neutrofil total dan partikel-positif terakumulasi di jaringan paru-paru tikus yang diobati dengan batang Poly-SA (Gambar 3E ). Khususnya, tikus ALI yang diobati dengan batang Poly-SA memiliki jumlah neutrofil partikel-positif yang secara signifikan lebih tinggi (≈310.000) per gram jaringan paru-paru dibandingkan dengan tikus yang diobati dengan bola Poly-SA (≈140.000), yang mewakili 54% lebih banyak akumulasi neutrofil partikel-positif di jaringan paru-paru tikus yang diobati dengan batang dibandingkan dengan yang diobati dengan bola. Kami mengonfirmasi temuan ini menggunakan gambar mikroskop fluoresensi neutrofil yang diperoleh dari jaringan paru-paru (Gambar 3F,G ) dan dengan memeriksa gambar imunofluoresensi dari seluruh bagian paru-paru. Potongan jaringan menunjukkan akumulasi yang lebih besar dari neutrofil batang-positif di jaringan paru-paru, seperti yang ditunjukkan oleh peningkatan ko-lokalisasi neutrofil Ly6G + (kuning) dan partikel Cy5.5-Poly-SA (merah) pada tikus yang diobati dengan batang Poly-SA dibandingkan dengan yang diobati dengan bola (Gambar S12 , Informasi Pendukung). Sekitar 18% neutrofil yang diperoleh dari jaringan paru-paru dikaitkan dengan batang atau bola Poly-SA (Gambar S9E , Informasi Pendukung). Namun, kami menemukan peningkatan yang signifikan dalam jumlah total neutrofil per massa jaringan paru-paru tikus ALI yang disuntik dengan batang Poly-SA dibandingkan dengan yang disuntik dengan bola (Gambar S10C , Informasi Pendukung).

Karena hasil yang diperoleh dari distribusi jaringan neutrofil positif-partikel, kami bertanya-tanya apakah hitungan neutrofil yang lebih tinggi yang terkait dengan batang Poly-SA di jaringan paru-paru disebabkan oleh batang yang terakumulasi di paru-paru. Seperti yang disajikan dalam Gambar S13 (Informasi Pendukung), hasil biodistribusi partikel kami menunjukkan bahwa partikel Poly-SA yang memanjang dan bulat sebagian besar terlokalisasi di hati dan limpa segera setelah 30 menit setelah injeksi partikel, mirip dengan pekerjaan sebelumnya menggunakan mikropartikel polimer. [ 18 , 19 , 22 , 37 , 38 ] Selain itu, hanya ≈10% dari fluoresensi partikel yang dipulihkan 2 jam setelah injeksi partikel berasal dari jaringan paru-paru untuk tikus yang diobati dengan batang dan bola Poly-SA.

Sementara mengobati tikus yang kekurangan LPS dengan batang Poly-SA mengakibatkan penurunan infiltrasi neutrofil ke dalam ruang udara (Gambar 2D ), kami bertanya-tanya apakah akumulasi neutrofil positif batang di jaringan paru-paru berpotensi disebabkan oleh peningkatan sinyal pro-inflamasi dari ruang alveolar. Namun, hasil kami menunjukkan bahwa tikus batang Poly-SA memiliki perbedaan minimal dalam sinyal sitokin di BALF dibandingkan dengan tikus yang diobati dengan bola dan tikus yang hanya diberi LPS (kecuali untuk IL-6) (Gambar S14 , Informasi Pendukung).

Singkatnya, kami mengamati bahwa neutrofil yang memfagositosis partikel Poly-SA berbentuk batang dalam model peradangan paru yang diinduksi LPS cenderung tetap berada di jaringan paru daripada berpindah ke hati dan limpa seperti neutrofil berbentuk bulat. Meskipun demikian, akumulasi neutrofil positif batang di jaringan paru tidak menyebabkan infiltrasi neutrofil yang lebih besar ke ruang alveolar (Gambar 2D , dan 3E ).

2.4 Neutrofil yang Memfagositosis Partikel Poli-SA Berbentuk Batang Kecil Kemungkinannya Bertransmigrasi Melintasi Lapisan Endotel
Mengingat retensi neutrofil batang-positif di jaringan paru-paru dan fraksi lebih rendah dari neutrofil batang-positif yang ditemukan di BALF model peradangan paru-paru kami (Gambar 3 ; Gambar S9 , Informasi Pendukung), kami mempertanyakan apakah motilitas neutrofil dari darah ke wilayah udara berpotensi terhambat setelah fagositosis partikel yang memanjang. Untuk menjawab pertanyaan ini, kami menggunakan model transmigrasi neutrofil in vitro. Kami menilai kemampuan migrasi neutrofil yang dimuat partikel melintasi lapisan sel endotel yang konfluen secara in vitro menggunakan lapisan tunggal sel endotel vena umbilikalis manusia (HUVEC) yang dikultur pada sisipan permeabel. Setelah lapisan tunggal HUVEC sepenuhnya menyatu, kami mengisolasi neutrofil manusia dari darah utuh dan menginkubasinya dengan bola Poly-SA berlabel rhodamine B dengan diameter yang bervariasi (500 nm, 1 µm, dan 2 µm) atau batang Poly-SA AR 6 yang sesuai selama 1 jam untuk memungkinkan terjadinya fagositosis. Neutrofil manusia digunakan untuk menyamai penggunaan sel endotel manusia, yang lebih mudah diperoleh daripada sel tikus.

Neutrofil diinkubasi dengan partikel Poly-SA pada rasio partikel-ke-neutrofil sebesar 16:1 untuk partikel 2 dan 1 µm, dan 80:1 untuk partikel 500 nm. Rasio ini ditentukan secara empiris dan dikuantifikasi menggunakan flow cytometry untuk memaksimalkan persentase neutrofil positif-partikel. Dengan rasio partikel-ke-sel ini, kami menargetkan setidaknya 80% populasi neutrofil dengan bola atau batang untuk setiap jenis partikel (Gambar S15A , Informasi Pendukung). Gambar mikroskopi konfokal ( Gambar 4A,B ; Gambar S15B , Informasi Pendukung) menunjukkan bahwa neutrofil manusia yang terisolasi dengan mudah menginternalisasi batang dan bola Poly-SA. Selain itu, kami mengamati fagositosis sekitar 10 partikel per sel untuk batang dan bola berukuran 500 nm, sekitar 6 partikel per sel untuk batang dan bola berukuran 1 µm, sekitar 4 partikel per sel untuk batang berukuran 2 µm, dan sekitar 7 partikel per sel untuk bola berukuran 2 µm (Gambar 4C ).

Gambar 4
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Transmigrasi Neutrofil Manusia melintasi Lapisan Tunggal HUVEC setelah Penyerapan Partikel Poly-SA. Neutrofil manusia yang terisolasi diinkubasi dengan partikel Poly-SA berlabel rhodamin selama 1 jam pada suhu 37 °C dan 5% CO 2 sebelum ditempatkan pada lapisan tunggal HUVEC. Gambar mikroskopi konfokal dari neutrofil manusia yang terisolasi yang diinkubasi dengan A) bola Poly-SA 1 µm berlabel rhodamin dan B) batang Poly-SA 1 µm AR 6. Partikel diberi label merah (Rhodamine B), dan neutrofil diberi label hijau (Alexa Fluor 488 – Wheat Germ Agglutinin). Skala batang adalah 10 µm. Gambar menunjukkan proyeksi intensitas maksimum. C) Distribusi penyerapan partikel Poly-SA per neutrofil manusia yang terisolasi. Gambar mikroskopi konfokal dari sedikitnya 80 neutrofil per kelompok partikel digunakan untuk menentukan jumlah partikel per sel. Neutrofil yang diobati dengan partikel dibiarkan bertransmigrasi melintasi lapisan tunggal HUVEC dan gradien IL-8 selama 1,5 jam pada suhu 37 °C dan 5% CO2 sebelum pengumpulan sel di kompartemen bawah. Neutrofil yang dikumpulkan diwarnai dengan anti-human CD11b untuk menentukan D) jumlah total neutrofil yang bertransmigrasi dan E) persentase neutrofil yang bertransmigrasi positif partikel menggunakan flow cytometry. F) Plot flow cytometry representatif yang menunjukkan persentase neutrofil yang terkait dengan bola Poly-SA atau batang Poly-SA (AR6) setelah transmigrasi. Signifikansi statistik antara kelompok ditentukan dengan (C,D) ANOVA satu arah dengan uji pasca Tukey dan E) uji t Student yang tidak berpasangan . Lingkaran mewakili data yang dikumpulkan dari donor darah yang sehat ( n = 6).
Neutrofil yang telah diobati sebelumnya dengan partikel Poly-SA ditambahkan ke ruang atas sisipan permeabel, dan IL-8, yang bertindak sebagai agen inflamasi, ditambahkan ke ruang bawah untuk merekrut neutrofil selama 1,5 jam. Seperti yang diharapkan, neutrofil yang tidak diobati bermigrasi melintasi lapisan tunggal HUVEC yang konfluen selama gradien IL-8 (Gambar 4D ). Sebaliknya, kami mengamati bahwa neutrofil yang telah diobati sebelumnya dengan partikel Poly-SA dari semua ukuran dan bentuk menunjukkan transmigrasi yang berkurang. Secara khusus, neutrofil yang diinkubasi dengan bola Poly-SA menunjukkan penurunan transmigrasi yang signifikan dibandingkan dengan sel yang tidak diobati, yang sesuai dengan pengurangan sebesar 49%, 56%, dan 91% untuk bola Poly-SA 500 nm, 1 µm, dan 2 µm, masing-masing. Demikian pula, neutrofil yang diinkubasi terlebih dahulu dengan batang Poly-SA menunjukkan pengurangan migrasi sebesar 68%, 72%, dan 98% dibandingkan dengan neutrofil yang tidak diobati untuk batang Poly-SA AR 6 berukuran 500 nm, 1 µm, dan 2 µm, masing-masing. Kami menganggap bahwa migrasi neutrofil yang berkurang setelah internalisasi partikel mungkin disebabkan oleh toksisitas partikel. Dengan demikian, kami menganalisis viabilitas neutrofil yang diisolasi setelah penyerapan partikel untuk setiap kelompok partikel. Konsisten dengan pekerjaan kami sebelumnya, [ 22 , 32 ] kami mengamati toksisitas sel minimal setelah pengobatan partikel Poly-SA, dengan viabilitas neutrofil lebih dari 88% setelah pemberian dosis partikel kami (Gambar S16 , Informasi Pendukung).

Ketika mempertimbangkan persentase sel partikel-positif di antara kumpulan neutrofil yang ditransmigrasi, kami menemukan bahwa neutrofil yang membawa batang Poly-SA dari semua ukuran lebih kecil kemungkinannya untuk bertransmigrasi daripada neutrofil yang dimuat dengan bola (Gambar 4E,F ). Untuk neutrofil yang diobati sebelumnya dengan batang Poly-SA 500 nm, 1 µm, dan 2 µm, kami menemukan bahwa ≈75%, ≈67%, dan ≈40% dari sel yang ditransmigrasi adalah batang-positif, masing-masing. Namun, ≈98%, ≈93%, dan ≈91% dari neutrofil yang ditransmigrasi dari kelompok yang diobati bola secara sesuai terkait dengan bola Poly-SA 500 nm, 1 µm, dan 2 µm. Hal ini menunjukkan bahwa transmigrasi neutrofil bermuatan batang melintasi lapisan endotel menurun sebesar 23% (500 nm), 28% (1 µm), dan 56% (2 µm) dibandingkan dengan neutrofil yang membawa bola-bola dengan volume yang sama. Hasil ini penting karena persentase sel positif partikel dan jumlah partikel yang diinternalisasi oleh neutrofil serupa untuk batang dan bola antara setiap ukuran yang diuji (kecuali untuk partikel 2 µm). Oleh karena itu, perbedaan yang diamati dalam transmigrasi mungkin disebabkan oleh bentuk partikel daripada variasi dalam penargetan yang dimediasi partikel.

Sejauh ini, kami hanya menggunakan polimer Poly-SA dalam model cedera paru in vivo dan transmigrasi in vitro kami. Dalam kedua contoh, kami mengamati bahwa partikel Poly-SA yang memanjang mengubah transmigrasi neutrofil di tempat peradangan relatif terhadap bola-bola dengan volume yang sama, kemungkinan karena efek bentuk partikel. Untuk memastikan temuan kami konsisten meskipun bahan partikelnya, kami membuat bola-bola poli(laktat- ko- asam glikolat) (PLGA) biodegradable 2 µm dan meregangkannya menjadi batang 2 µm. Kami memilih PLGA karena merupakan polimer yang dipelajari dengan baik dan bahan standar emas yang digunakan dalam teknologi medis yang disetujui oleh Badan Pengawas Obat Federal Amerika Serikat. [ 2 , 39 ] Tabel S2 (Informasi Pendukung) menunjukkan karakterisasi bola dan batang PLGA.

Mirip dengan partikel Poly-SA, internalisasi bola dan batang PLGA 2 µm secara signifikan mengurangi jumlah neutrofil yang ditransmigrasi dalam model transmigrasi in vitro kami. Kami mengamati bahwa untuk neutrofil yang diobati sebelumnya dengan batang PLGA, hanya ≈20% dari kumpulan neutrofil yang ditransmigrasi yang positif partikel, sedangkan ≈71% dari neutrofil yang ditransmigrasi dalam kelompok yang diobati dengan bola dikaitkan dengan bola PLGA (Gambar S17 , Informasi Pendukung). Dalam kasus ini, transmigrasi neutrofil yang dimuat batang PLGA menurun sebesar 73% dibandingkan dengan neutrofil yang membawa bola PLGA 2 µm. Hasil ini menunjukkan bahwa migrasi neutrofil yang berkurang yang diamati mungkin didominasi oleh bentuk partikel dan tidak berdasarkan pada bahan polimer itu sendiri.

Model transmigrasi in vitro kami mendukung temuan sebelumnya, yang menunjukkan bahwa fagositosis partikel polimerik mengganggu kemampuan neutrofil untuk bertransmigrasi selama peradangan. Lebih jauh, model ini menyoroti bahwa bentuk partikel, baik bulat atau memanjang, memengaruhi kecenderungan transmigrasi neutrofil secara berbeda.

2.5 Neutrofil yang Diisi Batang Menunjukkan Penurunan Polimerisasi Aktin Setelah Stimulasi IL-8
Kami mempertanyakan apakah motilitas yang berkurang dari neutrofil bermuatan batang melintasi lapisan endotel berpotensi karena perubahan deformasi sel, persyaratan penting untuk penyebaran dan migrasi sel dalam menanggapi gradien kemotaktik. [ 40 , 41 ] Karena polimerisasi aktin diperlukan untuk perubahan morfologi ini, [ 42 , 43 ] kami mengevaluasi distribusi dan polimerisasi aktin pada neutrofil bermuatan partikel setelah paparan stimulasi kemoatraktan. Mirip dengan model transmigrasi in vitro kami, kami mengisolasi neutrofil manusia dari darah utuh dan menginkubasinya dengan batang Poly-SA AR 6 berlabel Rhodamine B (500 nm, 1 µm, dan 2 µm) dan bola dengan volume yang sama selama 1 jam untuk memfasilitasi penyerapan partikel. Neutrofil yang diobati sebelumnya dengan partikel Poly-SA kemudian distimulasi dalam suspensi dengan IL-8, dan kami mewarnai dan mengukur kandungan F-aktin ( Gambar 5A ).

Gambar 5
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Karakterisasi F-aktin dalam Neutrofil Manusia yang Diisi Partikel Setelah Stimulasi IL-8. A) Ilustrasi yang menunjukkan alur kerja untuk menilai F-aktin dalam neutrofil manusia yang diobati dengan Poly-SA setelah stimulasi IL-8. B) Gambar mikroskopi konfokal dari neutrofil manusia terisolasi yang distimulasi dengan atau tanpa IL-8 selama 60 detik dalam suspensi. Neutrofil difiksasi, dipermeabilisasi, dan diwarnai untuk F-aktin (ActinGreen 488 ReadyProbes). Stimulasi IL-8 menginduksi polimerisasi aktin yang cepat, sebagaimana dibuktikan oleh pembentukan aktin kortikal (hijau) dan peningkatan keseluruhan sinyal F-aktin sebagaimana diukur dengan flow cytometry. Batang skala menunjukkan 5 µm (untuk gambar close-up) dan 20 µm. C) Kandungan F-aktin dari neutrofil yang diobati dengan batang dan bola Poly-SA (AR6), diikuti oleh stimulasi IL-8, direpresentasikan sebagai intensitas fluoresensi rata-rata (MFI). D) Gambar mikroskopi konfokal yang menunjukkan distribusi F-aktin dalam neutrofil yang diobati dengan batang dan bola Poly-SA, diikuti oleh stimulus IL-8. Partikel Poly-SA ditunjukkan dengan warna merah (Rhodamine B), dan F-aktin dalam warna hijau. Skala batang adalah 5 µm. Signifikansi statistik antara kelompok dinilai menggunakan One-way Repeated Measures ANOVA diikuti oleh uji pasca Fisher’s LSD untuk (C). Lingkaran mewakili masing-masing donor darah sehat ( n = 6), dan garis merah horizontal menunjukkan data rata-rata dan galat standar rata-rata (SEM) dalam (C). Lingkaran putih menunjukkan kontrol donor IL-8 saja yang sama di semua ukuran partikel. Gambar 5A dibuat dengan BioRender (https://BioRender.com/c28z131).
Neutrofil yang terpapar rangsangan IL-8 menunjukkan polimerisasi aktin yang cepat, dibuktikan dengan pembentukan jaringan cincin aktin yang kontras dengan neutrofil yang tidak terstimulasi, seperti yang diamati dalam gambar mikroskopi konfokal. Selain itu, analisis flow cytometry menyoroti peningkatan kandungan F-aktin secara keseluruhan pada neutrofil yang diaktifkan IL-8 relatif terhadap sel yang tidak terstimulasi (Gambar 5B ). Menariknya, kami mengamati bahwa neutrofil yang diobati terlebih dahulu dengan bola Poly-SA dari semua ukuran menunjukkan kandungan F-aktin yang berkurang setelah paparan IL-8. Neutrofil yang dimuat bola yang diaktifkan menunjukkan pengurangan yang signifikan dalam kandungan F-aktin total relatif terhadap kontrol tanpa partikel yang terstimulasi IL-8, yang sesuai dengan penurunan sebesar 24%, 18%, dan 31% untuk bola Poly-SA 500 nm, 1 µm, dan 2 µm, masing-masing. Demikian pula, neutrofil bermuatan batang yang diaktifkan menunjukkan pengurangan kandungan F-aktin sebesar 43%, 22%, dan 42% dibandingkan dengan neutrofil tanpa partikel yang terstimulasi untuk batang AR 6 Poly-SA berukuran 500 nm, 1 µm, dan 2 µm, masing-masing (Gambar 5C ). Khususnya, neutrofil bermuatan batang secara konsisten memiliki kandungan F-aktin yang jauh lebih sedikit daripada neutrofil yang membawa bola berukuran setara (Gambar 5C,D ). F-aktin dalam neutrofil yang diobati terlebih dahulu dengan batang Poly-SA berukuran 500 nm, 1 µm, dan 2 µm setelah stimulasi dengan IL-8 menurun secara signifikan sebesar 24%, 5%, dan 16% dibandingkan dengan neutrofil aktif yang membawa bola dengan volume yang sama, masing-masing.

Gambar 5D dan Gambar S18 (Informasi Pendukung) mencatat perbedaan dalam distribusi F-aktin dan intensitas sinyal antara neutrofil yang diaktifkan IL-8 yang sebelumnya diobati dengan bola Poly-SA dibandingkan dengan batang. Neutrofil yang dimuat bola terstimulasi biasanya menunjukkan struktur cincin F-aktin yang seragam dan terang. Sebaliknya, neutrofil yang dimuat batang menunjukkan F-aktin yang tersebar dan redup, terutama pada sel yang diobati dengan 500 nm dan 2 µm.

Akhirnya, kami tidak menemukan perbedaan statistik dalam kandungan F-aktin di antara neutrofil tak terstimulasi yang diobati dengan batang, bola, atau tanpa partikel di semua ukuran pembawa yang diperiksa (Gambar S19 , Informasi Pendukung). Kami juga menilai kadar F-aktin dalam neutrofil terstimulasi IL-8 yang dimuat dengan partikel PLGA. Temuan kami mengungkapkan bahwa neutrofil yang mengandung batang PLGA 2 µm menunjukkan pengurangan 30% dalam kandungan F-aktin dibandingkan dengan neutrofil terstimulasi dengan bola PLGA 2 µm (Gambar S20 , Informasi Pendukung). Temuan kami menunjukkan bahwa perbedaan yang diamati dalam polimerisasi aktin antara neutrofil yang dimuat batang dan bola setelah paparan IL-8 terutama dipengaruhi oleh bentuk partikel daripada pengukuran aktin dasar atau bahan polimer.

3 Diskusi
Pembawa obat partikulat yang diberikan secara intravena biasanya mengalami pembersihan cepat dari aliran darah dan terakumulasi dalam organ sistem retikuloendotelial (RES) seperti hati dan limpa, tempat makrofag fagosit sangat efisien dalam membersihkan pembawa dari tubuh. [ 2 ] Waktu sirkulasi yang singkat dan pembersihan fagositosis yang cepat dari pembawa partikulat sering kali membatasi kemanjuran terapi berbasis partikel yang dimaksudkan untuk mencapai jaringan dan jenis sel selain dari RES. [ 2 , 44 ] Oleh karena itu, para peneliti telah mempertimbangkan dengan cermat desain partikel untuk meningkatkan penargetan jaringan dan sel yang diinginkan. Geometri partikel telah menjadi parameter penting dalam desain pembawa partikulat karena memengaruhi berbagai interaksi biologis, termasuk fagositosis partikel, [ 27 , 45 ] marginasi partikel, [ 33 , 38 , 46 ] dan waktu sirkulasi. [ 47 , 48 ] Geometri partikel juga dapat digunakan untuk memengaruhi jalur mekanotransduksi dan perilaku sel untuk rekayasa jaringan dan aplikasi pengobatan regeneratif. Penambahan mikrostruktur, seperti batang mikro, ke perancah atau jaringan infark memengaruhi proliferasi dan fenotipe fibroblas, sehingga memodulasi respons fibrotik. [ 49 , 50 ] Selain itu, dimensi mikrostruktur ini juga memengaruhi diferensiasi fibroblas, dengan serat mikro dengan rasio aspek tinggi mengurangi proliferasi miofibroblas dan, oleh karena itu, enkapsulasi fibrotik yang mengelilingi mikrostruktur. [ 51 ]

Literatur terbaru mengungkapkan bahwa modifikasi geometri partikel – dari bulat ke memanjang – dapat meningkatkan penargetan neutrofil melalui fagositosis dan menawarkan hasil yang menjanjikan untuk mengobati peradangan neutrofil. [ 27 ] Sejauh pengetahuan kami, penelitian ini secara unik menyelidiki dampak partikel berbentuk batang Poly-SA anti-inflamasi bebas muatan pada transmigrasi neutrofil ke area peradangan relatif terhadap partikel bulat in vivo dan in vitro.

Menariknya, data kami mengungkap perbedaan antara penyerapan neutrofil manusia dan tikus terhadap batang dan bola Poly-SA. Pekerjaan kami menunjukkan bahwa neutrofil tikus secara signifikan memfagositosis lebih banyak batang Poly-SA dari semua ukuran daripada pembawa bola yang sesuai. Sebaliknya, neutrofil manusia primer memfagositosis batang dan bola Poly-SA pada tingkat yang sama. Meskipun kemampuan penargetan kedua jenis partikel serupa, kami menunjukkan bahwa menargetkan neutrofil manusia dengan partikel Poly-SA yang memanjang masih menawarkan keuntungan dibandingkan bola karena interaksi fagosit lain yang berkurang dengan pembawa yang memanjang, seperti yang diamati dengan monosit model manusia, sel THP-1. Demikian pula, pekerjaan kami menunjukkan bahwa penyerapan neutrofil terhadap partikel yang memanjang dapat ditingkatkan dalam kondisi aliran masuk. Mengingat penargetan dinding pembuluh darah yang lebih baik dari partikel non-bulat dibandingkan dengan partikel bulat, [ 46 , 52 ] kami berhipotesis bahwa penargetan neutrofil yang lebih baik secara in vivo disebabkan oleh pembawa yang memanjang yang mungkin lebih banyak berinteraksi dengan aliran masuk neutrofil yang dibatasi karena mereka terlokalisasi di ruang yang sama, yang mengarah pada fagositosis partikel. Demikian pula, hasil kami sejalan dengan penelitian sebelumnya yang menunjukkan penyerapan batang polistirena 500 nm di atas bola 500 nm lebih besar secara in vivo daripada secara eks vivo. [ 27 ]

Pemberian bola dan batang Poly-SA secara intravena menghasilkan pengurangan yang signifikan dari pergerakan neutrofil ke ruang udara paru-paru tikus; namun, batang Poly-SA 1 µm mengungguli bola Poly-SA dengan volume yang sama. Kami berspekulasi bahwa perbedaan yang diamati dalam memblokir pergerakan neutrofil in vivo antara batang dan bola Poly-SA terutama didorong oleh geometri partikel, meningkatkan fagositosis neutrofil batang daripada perbedaan dalam kinerja terapeutik. Manfaat anti-inflamasi tambahan dari bola Poly-SA telah dikaitkan dengan kemampuan partikel untuk mengubah ekspresi permukaan neutrofil dari molekul inflamasi, misalnya, CD62-L, setelah fagositosis partikel. [ 19 ] Karena batang Poly-SA 1 µm berasal dari bola Poly-SA 1 µm dan mengandung kandungan asam salisilat yang sama, kami berharap bahwa partikel Poly-SA yang memanjang dan bulat akan bekerja dengan cara yang sama dalam mencegah aktivasi neutrofil. Selain itu, penelitian kami sebelumnya menunjukkan bahwa aspirin bebas tidak menghentikan migrasi neutrofil ke rongga udara paru-paru yang terinfeksi oleh endotoksin atau bakteri, dan juga tidak mengubah adhesi agregat neutrofil-platelet ke endotelium yang meradang selama tromboinflamasi. [ 19 , 22 ] Hal ini menyoroti pentingnya fagositosis partikel oleh neutrofil aktif dalam mengubah perilaku sel secara efisien dari “dalam ke luar.”

Literatur menunjukkan bahwa geometri partikel memengaruhi biodistribusi pembawa. Partikel non-bulat seperti filomisel, silika, atau nanopartikel emas umumnya menunjukkan akumulasi hati yang berkurang dan terkumpul di organ lain, seperti paru-paru dan limpa. [ 48 , 53 – 55 ] Namun, studi terbatas telah menilai biodistribusi tingkat seluler dari partikel non-bulat. [ 27 , 56 ] Pekerjaan sebelumnya telah menunjukkan bahwa neutrofil positif-partikel ditemukan di hati tikus ALI ketika diobati dengan bola polimer 500 nm dan 2 µm. [ 18 ] Namun, hasil kami mengungkapkan bahwa neutrofil yang memfagositosis batang Poly-SA 1 µm terlokalisasi di jaringan paru-paru tikus ALI. Sebaliknya, neutrofil yang menginternalisasi bola Poly-SA 1 µm ditemukan di hati. Secara potensial, neutrofil dapat memfagositosis partikel yang telah ditangkap dalam organ yang dikumpulkan dalam penelitian ini. Akan tetapi, jika fagositosis terjadi karena akumulasi partikel, kami memperkirakan peningkatan neutrofil batang positif di semua organ yang ditemukan, terutama di hati dan limpa, karena peningkatan penyerapan partikel memanjang oleh neutrofil. Kami berspekulasi bahwa akumulasi neutrofil batang positif di jaringan paru-paru kemungkinan besar bukan karena fagositosis partikel di lokasi (paru-paru) tetapi neutrofil yang menginternalisasi partikel memanjang dalam sirkulasi untuk kemudian ditahan di jaringan paru-paru. Dengan demikian, data kami menunjukkan geometri partikel dapat memengaruhi biodistribusi neutrofil partikel positif pada tikus ALI.

Kami menyelidiki apakah fagositosis neutrofil terhadap partikel non-bulat mempengaruhi motilitas sel di lokasi peradangan, dengan harapan dapat menjelaskan akumulasi neutrofil batang-positif di paru-paru yang meradang. Pekerjaan sebelumnya oleh Habibi et al. menjelaskan bahwa sifat partikel dapat mempengaruhi kemampuan transmigrasi monosit THP-1 yang dimuat nanopartikel melintasi model sawar darah-otak. Penelitian ini menyinggung massa total partikel yang diambil oleh sel dan sifat mekanis partikel tersebut yang mempengaruhi pergerakan sel dan perilaku migrasinya melintasi sawar. [ 57 ] Hasil in vitro kami mengungkapkan bahwa neutrofil yang dimuat batang lebih kecil kemungkinannya untuk bertransmigrasi melalui lapisan tunggal endotel daripada neutrofil yang diobati dengan bola dengan volume yang sama. Hasil kami menyiratkan bahwa geometri partikel merupakan faktor pendorong berkurangnya kemampuan transmigrasi neutrofil yang diberi muatan batang dibandingkan dengan muatan bola karena persentase sel positif partikel dan tingkat fagositosis (misalnya, jumlah partikel di dalam sel) sama antara sel yang diberi muatan batang dan bola. Demikian pula, kami menemukan bahwa berkurangnya kemampuan transmigrasi neutrofil yang diberi muatan batang tidak bergantung pada bahan partikel.

Dalam penelitian in vitro kami, kami menunjukkan bahwa neutrofil yang dimuat batang memiliki kandungan F-aktin yang berkurang dibandingkan dengan neutrofil yang dimuat bola atau yang tidak diberi perlakuan partikel setelah stimulasi dengan IL-8. Penurunan kadar aktin yang lebih besar ini pada neutrofil yang dimuat batang setelah stimulasi dibandingkan pada sel yang dimuat bola dapat menjelaskan motilitasnya yang rendah di tempat peradangan, karena sel-sel ini kemungkinan memiliki polaritas yang berkurang dan pembentukan tonjolan yang diperlukan untuk memulai proses migrasi. [ 42 , 43 ] Misalnya, neutrofil manusia primer yang kekurangan megakarioblastik leukemia 1 (MKL1) menunjukkan gangguan yang jelas dalam polimerisasi aktin, yang mengakibatkan kurangnya penyebaran neutrofil dan migrasi transendotelial. [ 58 ] Selain itu, bentuk sel dan distribusi F-aktin memengaruhi pergerakan neutrofil selama kemotaksis, dengan polarisasi neutrofil yang penting untuk migrasi sel. [ 59 , 60 ]

Kami juga menemukan neutrofil yang mengandung bola-bola Poly-SA memiliki kadar F-aktin yang berkurang dibandingkan dengan sel-sel yang tidak diobati setelah aktivasi IL-8. Karena penataan ulang sitoskeleton aktin yang tepat sangat penting bagi banyak fungsi neutrofil, termasuk pembentukan NET, [ 61 ] temuan ini dibangun atas penelitian kami sebelumnya yang menunjukkan bahwa neutrofil yang diobati dengan bola-bola Poly-SA menunjukkan penurunan pembentukan NET setelah stimulasi dengan LPS atau PMA. [ 32 ] Penurunan pembentukan NET neutrofil dikaitkan dengan penyerapan bola-bola Poly-SA dan fosforilasi kinase terminal-N c-Jun (p-JNK) penghambat asam salisilat yang dilepaskan intraseluler. Dampak bola-bola Poly-SA pada NET ini selanjutnya dikonfirmasi secara in vivo, di mana tikus yang diobati dengan Poly-SA memiliki penurunan yang nyata dalam plasma CitH3, komponen NET yang terkenal, dibandingkan tanpa pengobatan dalam model tikus DVT.

Mekanisme lain juga dapat berkontribusi pada retensi dan penurunan motilitas neutrofil bermuatan batang melintasi lapisan endotel. Satu mekanisme berhubungan dengan kekakuan sel; fagositosis partikel AR tinggi dapat meningkatkan kekakuan sel dibandingkan dengan partikel bulat dengan volume yang sama, mengurangi deformabilitas sel, persyaratan penting untuk migrasi neutrofil. [ 62 ] Zak et al. menunjukkan bahwa neutrofil menjadi lebih kaku setelah fagositosis partikel bulat, [ 63 ] tetapi tidak ada perbandingan langsung yang dibuat dengan partikel non-bulat. Demikian pula, penelitian sebelumnya telah melaporkan bahwa sekuestrasi leukosit sebagian disebabkan oleh peningkatan kekakuan neutrofil yang dipicu oleh mediator inflamasi, yang secara sementara mengurangi deformabilitas sel dan, dengan demikian, meningkatkan retensi neutrofil di tempat cedera. [ 64 ] Akibatnya, kami berharap untuk mengamati jumlah tinggi neutrofil batang-positif di tempat migrasi, seperti yang terlihat di jaringan paru-paru tikus kami yang tertantang LPS. Meskipun kekakuan neutrofil umumnya dikaitkan dengan perakitan F-aktin, [ 65 – 67 ] temuan kami mengungkapkan polimerisasi aktin yang terganggu pada sel yang dimuat batang setelah paparan stimulus. Namun, migrasi sel yang efektif bergantung sebagian pada dinamika aktin, yang melibatkan polimerisasi dan depolymerisasi aktin. Jadi, penting untuk dicatat bahwa percobaan kami tidak memperhitungkan kinetika aktin dalam kondisi fisiologis, seperti penyebaran sel dan deformasi melalui kapiler sempit atau celah endotel. Lebih jauh, kami tidak mempertimbangkan efek tersinkronisasi dari paparan kemoatraktan dan penyerapan partikel pada kinetika aktin.

Mekanisme kedua berhubungan dengan pemblokiran akses melintasi lapisan endotel; neutrofil bermuatan batang tidak dapat secara fisik melewati penghalang endotel karena partikel merupakan penghalang padat, yang menyebabkan retensi neutrofil positif batang di lokasi cedera. Telah dilaporkan bahwa diameter celah endotel berkisar antara 0,2 hingga 1,4 µm di venula setelah terpapar rangsangan inflamasi. [ 68 , 69 ] Namun, partikel berbentuk batang memiliki sumbu utama 6 µm (batang 2 µm), 4 µm (batang 1 µm), dan 2 µm (batang 500 nm). Oleh karena itu, partikel yang memanjang mungkin merupakan penghalang padat yang mencegah neutrofil bermuatan batang melewati celah endotel. Memang, data kami menunjukkan bahwa dimensi sumbu utama, dan tidak harus volume partikel, memodulasi kemampuan neutrofil bermuatan partikel untuk menembus penghalang endotel.

Penelitian kami menunjukkan bahwa pembawa polimer memanjang merupakan sistem partikulat yang menjanjikan untuk penargetan neutrofil aktif yang dimediasi partikel. Hasil kami menunjukkan dampak partikel berbentuk batang dalam memblokir secara efektif pergerakan neutrofil ke jaringan yang meradang karena penyerapan neutrofil yang lebih baik dan preferensial dari pembawa yang memanjang. Lebih jauh, kami menunjukkan bahwa geometri partikel memengaruhi fungsi neutrofil di luar fagositosis, yang mengungkapkan bahwa internalisasi partikel memanjang oleh neutrofil dapat memodulasi motilitas sel melintasi penghalang vaskular karena polimerisasi aktin yang terhambat. Memahami mekanisme yang dengannya partikel berbentuk memengaruhi motilitas neutrofil sangat penting untuk teknik yang mengandalkan tumpangan neutrofil atau pengiriman kargo yang dimediasi neutrofil melintasi penghalang vaskular, khususnya untuk menargetkan lokasi penyakit dan lingkungan mikro tumor. [ 26 , 70 – 72 ] Memang, temuan kami mengarah pada studi yang lebih rinci tentang kemampuan migrasi neutrofil yang dimuat partikel dalam struktur yang lebih kompleks yang menggabungkan lingkungan mikro 3D dan aliran darah agar lebih menyerupai daerah vaskular. Demikian pula, kumpulan rasio aspek, bahan partikel, ukuran, dan elastisitas dapat dievaluasi sebagai parameter unik dalam desain partikel yang dapat memodulasi kemampuan migrasi neutrofil.

4 Bagian Eksperimen
Persetujuan Studi
Darah manusia diperoleh dari donor yang sehat, termasuk donor wanita dan pria berusia 18-30 tahun. Tidak ada perbedaan jenis kelamin yang dipertimbangkan dalam penelitian ini. Persetujuan tertulis dan informasi diperoleh dari setiap donor sebelum pengambilan darah mengikuti protokol #HUM00013973, yang disetujui oleh University of Michigan Internal Review Board (UM-IRB). Semua peserta diberi kompensasi berupa uang untuk setiap donor darah.

Tali pusat manusia dikumpulkan dari Rumah Sakit Anak Mott, Ann Arbor, berdasarkan protokol UM-IRB (# HUM00026898).

Studi hewan dilakukan menurut Pedoman Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium dari National Institute of Health dan protokol (#PRO00010572) yang disetujui oleh Institutional Animal Care and Use Committee dari University of Michigan. Tikus jantan BALB/c berusia 7–8 minggu dibeli dari Jackson Laboratories dan dipelihara dalam kondisi bebas patogen di University of Michigan, Ann Arbor.

Pembuatan Partikel Bulat Berbasis Poli(Anhidrida-Ester) atau Asam Salisilat (Poli-SA)
Partikel bulat Poly-SA dibuat menggunakan teknik penguapan pelarut emulsi. Semua partikel Poly-SA dibuat dengan polimer Poly-SA 8–15 kDa dengan penghubung asam adipat. Untuk partikel berukuran 500 nm, fase minyak terdiri dari 10 mg polimer Poly-SA yang dilarutkan dalam 20 mL diklorometana. Fase minyak diemulsi menjadi fase air 75 mL dari 2% poli(vinil alkohol) (PVA, Sigma-Aldrich) pada 6000 rpm menggunakan mixer overhead (Caframo). Untuk partikel berukuran 1 µm, 20 mg polimer Poly-SA dilarutkan dalam 20 mL diklorometana dan diemulsi menjadi 75 mL PVA 1% pada 4250 rpm. Untuk partikel 2 µm, 40 mg polimer Poly-SA dilarutkan dalam 10 mL diklorometana dan diemulsi dalam 75 mL PVA 1% pada 4250 rpm. Semua jenis partikel diaduk selama 2 jam untuk memungkinkan penguapan pelarut. Partikel Poly-SA dicuci dengan air deionisasi dan dipulihkan melalui sentrifugasi. Partikel bulat Poly-SA dikeringkan dalam suhu beku dan disimpan pada suhu -40 °C hingga digunakan lebih lanjut.

Partikel Poly-SA berlabel fluoresensi dibuat seperti yang disebutkan di atas, kecuali fase minyak mengandung Rhodamine B (≈0,05 mg per mg polimer Poly-SA, Sigma-Aldrich) atau polimer Poly-SA berlabel Cy5.5 (≈0,01 mg polimer berlabel Cy5.5 per mg polimer Poly-SA). Polimer berlabel Cy5.5 dibuat seperti yang dijelaskan sebelumnya. [ 19 ]

Morfologi dan ukuran partikel ditentukan melalui mikroskop elektron pemindaian (SEM) dan ImageJ. Ukuran partikel rata-rata ditentukan dengan mengukur diameter sedikitnya 100 partikel. Muatan permukaan bola Poly-SA ditentukan menggunakan Zetasizer (Malvern Zetasizer Nano ZS), dan pengukuran dilakukan dalam air deionisasi.

Pembuatan Partikel Berbentuk Batang Poly-SA
Partikel bulat Poly-SA diregangkan menjadi partikel berbentuk batang dalam satu dimensi menggunakan protokol peregangan lapisan film panas. Lapisan film partikel disiapkan dengan mencampur 3 mg bola Poly-SA 500 nm, 1 µm, atau 2 µm dalam 10 mL PVA 7%. Larutan partikel/PVA dituangkan ke dalam pelat sumur tunggal (Nunc OmniTray) dan dikeringkan pada suhu 60 °C selama ≈3 jam. Lapisan film partikel dipotong menjadi bagian-bagian berukuran 1,7 cm × 5 cm dan diregangkan pada suhu 120 °C menggunakan pompa suntik. AR partikel Poly-SA disesuaikan dengan memodifikasi total volume tarikan pompa. Semua bola Poly-SA diregangkan menjadi AR tetap 6.

Partikel Poly-SA berbentuk batang yang dihasilkan diperoleh dengan melarutkan film dalam air deionisasi dan disentrifugasi pada 4000 rpm selama 15 menit. Tiga hingga empat kali pencucian dengan air deionisasi dilakukan untuk menghilangkan kelebihan PVA dari permukaan partikel.

Dimensi partikel berbentuk batang ditentukan dari gambar SEM, dan AR diukur menggunakan ImageJ. AR ditentukan dengan mengukur panjang sumbu mayor dan minor batang (AR = Sumbu Mayor/Sumbu Minor) dari sedikitnya 100 partikel representatif. Muatan permukaan batang Poly-SA ditentukan menggunakan Zetasizer.

Pembuatan Partikel Bulat PLGA
Bola-bola PLGA (2 µm) diformulasikan menggunakan metode penguapan pelarut emulsi. Polimer PLGA (berujung asam, laktida: glikolida 50:50, berat molekul 24–38 kDa, Sigma-Aldrich) dilarutkan dalam diklorometana pada konsentrasi 2 mg mL −1 (fase minyak). Dua puluh mililiter fase minyak diemulsi dalam 90 mL PVA 1% pada 2600 rpm selama 2 jam menggunakan mixer overhead (Caframo). Partikel PLGA dipulihkan melalui sentrifugasi setelah pencucian berulang dengan air deionisasi pada 4000 rpm selama 7 menit. Partikel PLGA dikeringkan dalam suhu beku dan disimpan pada suhu −40 °C hingga digunakan.

Partikel PLGA berlabel fluoresensi dibuat seperti yang disebutkan di atas, kecuali fase minyak mengandung Rhodamine B (≈0,05 mg per mg polimer PLGA, Sigma-Aldrich). Ukuran partikel ditentukan melalui SEM dan ImageJ. Ukuran rata-rata yang dilaporkan diperoleh dengan mengukur diameter sedikitnya 100 partikel. Muatan permukaan bola PLGA diukur menggunakan Zetasizer.

Pembuatan Partikel Berbentuk Batang PLGA
Bola-bola PLGA (2 µm) diregangkan menggunakan teknik peregangan lapisan film panas. Bola-bola PLGA (3 mg) dicampur dalam 10 mL PVA 7% dan dituangkan ke dalam pelat sumur tunggal. Campuran partikel/PVA dikeringkan pada suhu 60 °C selama ≈3 jam sebelum diregangkan. Lapisan film partikel dipotong menjadi bagian-bagian berukuran 1,7 cm × 5 cm dan diregangkan pada suhu 120 °C menggunakan pompa suntik. Semua bola PLGA diregangkan hingga rasio aspek tetap. Partikel PLGA berbentuk batang diambil melalui sentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm selama 15 menit.

Dimensi partikel berbentuk batang ditentukan dari gambar SEM dan ImageJ. AR ditentukan dengan mengukur sedikitnya 100 partikel representatif. Muatan permukaan batang PLGA diukur menggunakan Zetasizer.

Pelepasan Asam Salisilat Kumulatif dari Bola dan Batang Poli-SA
Bola dan batang Poly-SA non-fluoresensi disuspensikan kembali dalam 1× PBS-/- hingga konsentrasi akhir 109 partikel mL −1 . Larutan partikel diputar selama 10 hari pada suhu 37 °C, dan media degradasi dikumpulkan pada interval tertentu. Pengukuran absorbansi diperoleh pada λ = 295 nm melalui spektroskopi UV–vis. Estimasi asam salisilat yang dilepaskan dari partikel dihitung terhadap kurva kalibrasi 9 titik dari konsentrasi asam salisilat yang diketahui. Semua standar juga disiapkan dalam 1× PBS-/-.

Penyerapan Batang dan Bola Poli-SA secara Ex Vivo oleh Neutrofil Manusia
Darah manusia utuh diperoleh melalui venipuncture dan segera diantikoagulasi dengan heparin. Untuk penyerapan Poly-SA rods dan spheres, partikel berlabel Rhodamine B ditambahkan ke 100 µL darah manusia utuh hingga konsentrasi akhir 10 7 partikel mL −1 . Sampel diinkubasi pada 37 °C dan 5% CO 2 selama 2 jam. Setelah 2 jam, sampel diletakkan di atas es dan diwarnai dengan anti-human CD11b (0,05 µg sampel −1 , Brilliant Violet 421, BioLegend) dan anti-human CD62L (0,05 µg sampel −1 , APC/Cy7, BioLegend) selama 30 menit. Setelah itu, 2 mL larutan Lyse/Fix 1-langkah (eBiosciences) ditambahkan ke setiap sampel selama 30 menit. Leukosit tetap yang dihasilkan diambil melalui sentrifugasi pada 500 rcf selama 5 menit dan dicuci dengan buffer penyortiran sel teraktivasi fluoresensi (FACS) (1X PBS-/- dengan 2% serum sapi janin yang diinaktivasi panas (FBS)). Persentase neutrofil positif partikel dihitung melalui flow cytometry (Attune CytPix).

Untuk menilai ekspresi CD62L pada neutrofil manusia, sampel diperlakukan dengan LPS (0,01 µg sampel −1 , Sigma-Aldrich) selama 30 menit pada suhu 37 °C dan 5% CO 2 sebelum penambahan partikel. Kemudian, 10 7 partikel mL −1 darah ditambahkan dan diinkubasi hingga 2 jam pada suhu 37 °C dan 5% CO 2 . Sampel diproses dan dianalisis seperti yang disebutkan di atas.

Penyerapan Batang dan Bola Poli-SA secara Ex Vivo oleh Neutrofil dan Monosit Tikus
Darah utuh dari tikus jantan BALB/c (umur 7,8 minggu) diperoleh melalui tusukan jantung dan segera diberi antikoagulan dengan heparin. Untuk penyerapan batang dan bola Poly-SA, partikel berlabel Rhodamine B ditambahkan ke 100 µL darah utuh tikus hingga konsentrasi akhir 10 7 partikel mL −1 . Sampel diinkubasi pada 37 °C dan 5% CO 2 selama 2 jam. Setelah inkubasi, sampel diletakkan di atas es dan diwarnai dengan anti-tikus CD11b (0,25 µg sampel −1 , FITC, BioLegend), anti-tikus Ly6G (0,1 µg sampel −1 , APC, BioLegend), dan anti-tikus Ly6C (0,1 µg sampel −1 , Brilliant Violet 421, BioLegend) selama 30 menit. Selanjutnya, 2 mL larutan Lyse/Fix 1-langkah ditambahkan ke setiap sampel selama 30 menit untuk melisiskan sel darah merah dan memfiksasi leukosit. Setiap sampel dicuci dengan buffer FACS pada 500 rcf selama 5 menit. Persentase neutrofil dan monosit tikus yang positif partikel diukur melalui flow cytometry.

Penyerapan Batang dan Bola Poli-SA oleh Monosit THP-1
Monosit THP-1 (ATCC) ditumbuhkan dalam medium RPMI-1640 yang dilengkapi dengan 10% FBS pada suhu 37 °C dan 5% CO 2 . Sel dipelihara sesuai dengan petunjuk pabrik pembuatnya. Untuk penyerapan batang dan bola Poly-SA, 10 5 Monosit THP-1 diinkubasi dengan 10 6 Partikel berlabel Rhodamine B pada suhu 37 °C dan 5% CO 2 selama 2 jam. Selanjutnya, sel difiksasi dengan 2 mL paraformaldehida 4% (Thermo Scientific) selama 15 menit dan dicuci dengan buffer FACS pada 500 rcf selama 5 menit. Penyerapan partikel oleh monosit THP-1 ditentukan melalui flow cytometry.

Model Cedera Paru Akut dan Perawatan Partikel Poly-SA
Tikus jantan BALB/c dibius sebentar menggunakan isoflurana untuk memberikan LPS secara orotrakeal ke paru-paru (50 µL 0,4 mg mL −1 ). Satu jam setelah penetesan, tikus disuntik melalui vena ekor dengan 4 × 108 partikel per 100 µL PBS-/- (≈20 mg partikel kg −1 tikus). Tikus menerima bola Poly-SA 1 µm atau batang Poly-SA AR 6 1 µm. Dua jam setelah injeksi partikel, tikus di-eutanasia melalui asfiksia CO 2 dan organ diambil. Darah diambil dari setiap tikus melalui tusukan jantung, dan paru-paru dicuci dengan ≈1 mL PBS-/- tiga kali dan disimpan dalam es sampai digunakan. BALF disentrifugasi pada 500 rcf selama 5 menit untuk mengumpulkan leukosit yang ditemukan di ruang udara, dan supernatan disimpan pada suhu −80 °C untuk ELISA.

Jumlah dan komposisi leukosit dalam darah tikus dan BALF ditentukan melalui hemasitometer (Turk Blood Diluting Fluid) dan flow cytometry. Darah tikus diwarnai dengan anti-tikus CD45 (0,1 µg sampel −1 , Brilliant Violet 711, BioLegend), anti-tikus Ly6G (0,1 µg sampel −1 , APC, BioLegend), anti-tikus CD11b (0,1 µg sampel −1 , FITC, BioLegend), dan anti-tikus Ly6C (0,1 µg sampel −1 , Brilliant Violet 421, BioLegend). BALF diwarnai dengan anti-mouse CD45 (0,1 µg sampel −1 , Brilliant Violet 711, BioLegend), anti-mouse Ly6G (0,1 µg sampel −1 , APC, BioLegend), anti-mouse CD11b (0,1 µg sampel −1 , FITC, BioLegend), dan anti-mouse CD11c (0,1 µg sampel −1 , Brilliant Violet 421, BioLegend). Sebelum flow cytometry, semua sampel yang diwarnai diperlakukan dengan 2 mL 1-step Lyse/Fix untuk memfiksasi sel darah putih dan melisiskan sel darah merah. Setiap sampel dicuci dengan buffer FACS pada 500 rcf selama 5 menit sebelum flow cytometry.

Biodistribusi Bola dan Batang Poli-SA dalam Model Cedera Paru Akut
Tikus BALB/c jantan diberi LPS dan 10 8 batang atau bola Poly-SA 1 µm terkonjugasi Cy5.5 per 100 µL PBS-/- diberikan seperti yang telah dibahas sebelumnya. Tikus dieutanasia pada 30 menit atau 2 jam pascainjeksi partikel, dan organ diambil untuk menilai akumulasi partikel in vivo. Seluruh organ (paru-paru, hati, jantung, ginjal, limpa) dan darah dikumpulkan dan dipindai menggunakan Sistem Pencitraan Inframerah Odyssey CLx (LI-COR). Sampel dipindai menggunakan saluran 700 nm dengan resolusi 169 µm untuk menentukan total fluoresensi untuk setiap organ di wilayah yang diinginkan. Fluoresensi setiap organ dikurangi dari organ yang tidak diobati atau kosong untuk memperhitungkan autofluoresensi organ. Persentase fluoresensi yang diperoleh ditentukan dengan menghitung fluoresensi organ bersih dibagi dengan total fluoresensi rata-rata semua organ untuk setiap tikus.

Analisis In Vivo Distribusi Neutrofil Positif Partikel dalam Model Cedera Paru Akut setelah Perawatan Partikel Poly-SA
Seperti yang dijelaskan sebelumnya, tikus BALB/c diberi LPS dan 4 × 10 8 1 µm batang atau bola Poly-SA yang terkonjugasi Cy5.5 diberikan secara intravena. Tikus disuntik mati 2 jam setelah penyuntikan partikel dan seluruh organ (paru-paru, hati, dan limpa), darah, dan BALF dikumpulkan.

Darah tikus dan BALF diproses seperti yang telah dibahas sebelumnya. Darah tikus diwarnai dengan anti-tikus CD11b (0,1 µg sampel -1 , FITC, BioLegend), anti-tikus Ly6G (0,1 µg sampel -1 , Brilliant Violet 605, BioLegend), dan anti-tikus Ly6C (0,1 µg sampel -1 , Brilliant Violet 421, BioLegend). BALF diwarnai dengan anti-tikus CD45 (0,1 µg sampel -1 , Brilliant Violet 421, BioLegend), anti-tikus Ly6G (0,1 µg sampel -1 , FITC, BioLegend), dan anti-tikus CD11c (0,1 µg sampel -1 , PE/Cy7, BioLegend).

Seluruh organ (paru-paru, hati, dan limpa) disimpan pada media RPMI-1640 dingin hingga diproses. Paru-paru (lobus kanan), hati (lobus median), dan seluruh limpa dari setiap tikus diinkubasi dengan kolagenase (Gibco, Tipe IV) dan DNase (Millipore Sigma) selama 30 menit, dan jaringan diproses menggunakan gentleMACS. Sampel disaring dengan jaring berukuran 70 µm dan leukosit diisolasi menggunakan Lymphoprep (STEMCELL Technologies). Suspensi sel yang dihasilkan diwarnai dengan anti-mouse CD11b (0,1 µg sampel −1 , FITC, BioLegend), anti-mouse Ly6G (0,1 µg sampel −1 , Brilliant Violet 605, BioLegend), dan anti-mouse CD45 (0,1 µg sampel −1 , Brilliant Violet 421, BioLegend). Jumlah dan komposisi leukosit dalam jaringan ditentukan sebagai CD45 + CD11b + Ly6G + menggunakan flow cytometry.

Transmigrasi Neutrofil In Vitro setelah Penyerapan Partikel
Kemampuan transmigrasi neutrofil setelah fagositosis batang atau bola Poly-SA dievaluasi menggunakan uji migrasi sel transwell. Sisipan permeabel transwell 12-well polikarbonat (ukuran pori 3 µm, Corning) diperlakukan dengan kolagen sebelum penyemaian sel. Satu mililiter kolagen anak sapi 0,01% v/v dalam etanol 70% ditambahkan ke setiap sisipan dan dikeringkan semalaman dalam lemari biosafety steril. Setiap sisipan dicuci dengan PBS-/- dua kali, sebelum penyemaian sel pada hari berikutnya. HUVEC (80.000) disemai pada sisipan yang diperlakukan dengan kolagen dan dikultur selama 3–4 hari sebelum digunakan. HUVEC diwarnai dengan CellTrace Cell Proliferation Kit (CFSE, Invitrogen Molecular Probes) sesuai dengan indikasi produsen untuk mengonfirmasi konfluensi lapisan tunggal HUVEC. HUVEC yang baru diisolasi antara lintasan P1 hingga P3 digunakan untuk pengujian ini.

Neutrofil manusia yang diisolasi dari darah yang diheparinisasi diperoleh dengan mengikuti gradien Histopaque-1119 (Kepadatan 1,119 g mL −1 , Sigma-Aldrich) dan Ficoll-Paque (Kepadatan 1,078 g mL −1 , Cytiva). Neutrofil yang diisolasi (10 5 ) dalam 100 µL plasma heparin spesifik donor dibiarkan memfagositosis batang atau bola Poly-SA berlabel rhodamine B selama 1 jam pada suhu 37 °C dan 5% CO 2. Rasio partikel-ke-neutrofil sebesar 16:1 untuk batang dan bola 2 dan 1 µm dan 80:1 untuk batang dan bola 500 nm digunakan. Rasio partikel-ke-sel ini dipilih untuk memaksimalkan fagositosis. Setelah penyerapan partikel, neutrofil dicuci dengan media sel untuk menghilangkan kelebihan plasma sebelum ditempatkan pada sisipan permeabel. Neutrofil yang telah diberi perlakuan partikel ditambahkan ke lapisan tunggal/sisipan HUVEC dan dibiarkan bermigrasi ke kompartemen bawah karena kemotaksis IL-8 (20 ng mL −1 , BioLegend). Setelah 1,5 jam, neutrofil yang bermigrasi dikumpulkan dari kompartemen bawah dan diwarnai dengan anti-human CD11b (0,1 µg sampel −1 , APC/Cy7, BioLegend) untuk penghitungan sel menggunakan flow cytometry.

Pengujian transmigrasi neutrofil diulang tetapi dengan bola dan batang PLGA. Bola PLGA (2 µm) dan batang AR7 2 µm digunakan untuk pengujian ini, dan rasio partikel terhadap neutrofil dipilih sebesar 16:1.

Neutrofil yang diisolasi diinkubasi dengan bola atau batang pada rasio partikel-ke-sel yang ditentukan untuk menentukan tingkat fagositosis dan viabilitas neutrofil setelah penyerapan partikel. Sampel diwarnai dengan anti-human CD11b (0,1 µg sampel −1 , APC/Cy7, BioLegend) dan Fixable Viability Dye (eFluor 450, eBioscience). Neutrofil positif partikel dan viabilitas ditetapkan menggunakan flow cytometry.

Pengukuran F-Actin pada Neutrofil yang Diperlakukan dengan Partikel yang Diaktifkan IL-8
Neutrofil terisolasi dalam plasma heparin spesifik donor (10 6 mL −1 ) diinkubasi terlebih dahulu selama 1 jam dengan bola Poly-SA berlabel rhodamine atau batang AR6 pada suhu 37 °C dan 5% CO 2 seperti dijelaskan di atas. Neutrofil yang diobati dengan partikel diinkubasi dengan atau tanpa IL-8 (20 ng mL −1 , BioLegend) selama 60 detik. Neutrofil segera difiksasi, dipermeabilisasi, dan diwarnai untuk F-actin menggunakan kit IntraPrep (Beckman Coulter) mengikuti petunjuk pabrik. Singkatnya, neutrofil yang tidak terstimulasi atau neutrofil yang diaktifkan dengan IL-8 difiksasi dengan Reagen Fiksasi 1 (Formaldehida) selama 15 menit di atas es. Selanjutnya, neutrofil dicuci dalam buffer FACS pada 500 rcf selama 5 menit, diikuti oleh inkubasi selama 30 menit di atas es dengan ActinGreen 488 ReadyProbes (F-actin, Thermo Fisher Scientific) yang diencerkan 1:1000 dalam Permeability Reagent 2 (Saponine). Sel dicuci dua kali dengan buffer FACS pada 500 rcf selama 5 menit dan dianalisis menggunakan flow cytometry. Neutrofil digerbangkan berdasarkan hamburan maju dan samping, dan kandungan F-actin dinyatakan sebagai intensitas fluoresensi rata-rata (MFI) dari sedikitnya 10.000 sel.

Untuk menilai distribusi F-aktin setelah stimulasi IL-8, neutrofil dilapiskan pada pelat kaca 96-sumur berlapis poli- L -lisin 0,1% untuk perlekatan sel. Distribusi F-aktin pada neutrofil dinilai dengan mengambil gambar sel yang dilapisi menggunakan mikroskop konfokal Nikon A1S yang dilengkapi dengan lensa objektif perendaman air 40x, dengan mempertahankan intensitas laser yang sama di semua sampel. Gambar diambil setiap 0,5 µm (ketinggian-z), dan gambar yang ditampilkan dalam naskah mewakili bagian tengah.

Mikroskopi Konfokal Neutrofil yang Diobati dengan Partikel
Neutrofil diisolasi dari darah utuh dan diobati dengan bola Poly-SA berlabel rhodamine-B dan batang AR6 seperti dijelaskan di atas. Untuk mengonfirmasi internalisasi partikel, membran sel neutrofil yang diisolasi diwarnai dengan aglutinin bibit gandum (Alexa Fluor 488, 2 µg mL −1 , Fisher Scientific) dan dilapiskan pada pelat kaca 96-sumur berlapis poli- L- lisin 0,1% untuk stabilisasi sel. Jumlah partikel per sel ditentukan dengan mengambil gambar sel berlapis dengan mikroskop confocal Nikon A1S dengan objektif perendaman air 40x.

Tes ELISA
ELISA IgM, TNF-α, dan IL-6 dibeli dari Invitrogen, dan ELISA MIP-2 dan KC dibeli dari PeproTech (Fisher Scientific). Semua ELISA dilakukan sesuai dengan petunjuk produksi untuk mengukur kandungan protein dan sitokin dari sampel BALF yang dikumpulkan dalam model tikus ALI.

Histologi
Paru-paru tikus (lobus kiri) dan hati (lobus kiri) dikumpulkan setelah instilasi LPS dan perawatan partikel. Sampel-sampel dibenamkan dalam parafin dan diwarnai dengan anti-tikus Ly6G (Cy3) dan DAPI untuk pencitraan imunofluoresensi. Laboratorium Penelitian Patologi Molekuler di Universitas Michigan dibenamkan dalam parafin, dipotong, diwarnai, dan dicitrakan pada sampel-sampel tersebut.

Statistik
Kecuali dinyatakan sebaliknya, setiap grafik menggambarkan data yang diplot dengan batang rata-rata dan galat standar. Dalam percobaan yang melibatkan darah manusia, setiap titik data (diwakili oleh lingkaran) menunjukkan rata-rata dari sedikitnya dua replikasi dari donor darah independen dalam setiap kelompok eksperimen. Dalam percobaan yang melibatkan darah tikus, darah yang dikumpulkan dari sedikitnya lima tikus dikumpulkan, dan setiap titik data (diwakili oleh lingkaran) berhubungan dengan replikasi dari setiap kelompok eksperimen. Dalam percobaan degradasi partikel, data menggambarkan rata-rata dari sedikitnya dua replikasi per kelompok eksperimen. Analisis statistik data dilakukan dengan menggunakan GraphPad Prism. Uji -t Student dua sisi yang tidak berpasangan atau berpasangan, bersama dengan ANOVA satu arah atau ANOVA ukur berulang satu arah diikuti oleh LSD Fisher atau uji pasca Tukey, digunakan untuk menentukan signifikansi statistik antara kelompok eksperimen.