Menguraikan Porositas Hidrogel: Memajukan Analisis Struktural Hidrogel untuk Aplikasi Biomedis

Abstrak
Hidrogel merupakan biomaterial penting untuk aplikasi biomedis, yang bernilai karena sifatnya yang dapat disesuaikan dan biokompatibilitasnya. Fitur utama yang memengaruhi fungsinya adalah porositas, yang mengatur sifat transportasi. Mikroskopi elektron pemindaian kriogenik (cryo-SEM) digunakan secara luas untuk mengkarakterisasi porositas secara langsung, tetapi dapat menimbulkan artefak struktural. Mengkarakterisasi porositas hidrogel secara akurat dalam keadaan aslinya masih menjadi tantangan. Di sini, kami mengkarakterisasi porositas hidrogel dalam keadaan aslinya menggunakan uji pelacakan partikel dan membandingkan hasilnya dengan cryo-SEM dalam hidrogel polietilen glikol (PEG). Kedua metode tersebut mengungkapkan adanya mikropori dalam PEG, yang kemungkinan timbul dari cacat selama polimerisasi. Uji pembengkakan kesetimbangan menunjukkan ukuran mata jaring skala nano antara rantai polimer, berbeda dari pori-pori skala mikron. Untuk mengatasi keterbatasan konvensional, kami mengembangkan pendekatan rekonstruksi pori tiga dimensi (3D) yang baru dengan memanfaatkan algoritma convex hull. Metode ini memungkinkan pengukuran volume pori, luas permukaan, kebulatan, dan distribusi ukuran. Kami menemukan bahwa cryo-SEM meremehkan diameter pori karena penggambaran dua dimensi (2D), tetapi setelah konversi 2D ke 3D, dimensi pori yang sangat mirip diperoleh. Dengan memajukan analisis porositas, karya ini memberikan wawasan untuk menyesuaikan hidrogel guna mengoptimalkan interaksi dengan sel, biomolekul, dan agen terapeutik, membuka jalan dalam pemberian obat, rekayasa jaringan, dan aplikasi biomedis lainnya.

1 Pendahuluan
Struktur lunak di alam yang tersusun dari jaringan biopolimer yang membengkak karena air diklasifikasikan sebagai hidrogel. Terdapat di mana-mana dalam sistem kehidupan, hidrogel alami ini memelihara biologi. Namun, sifat-sifatnya sulit dikendalikan, sehingga membatasi penggunaannya sebagai komponen dalam teknologi. Tantangan ini telah mendorong pengembangan analog sintetis, di mana kimia, arsitektur, dan sifat mekanisnya dapat disetel dengan tepat. [ 1 , 2 ] Kemajuan tersebut menjadikan hidrogel sintetis sebagai alat yang sangat diperlukan untuk memahami bagaimana lingkungan tiga dimensi (3D) memengaruhi proses biologis. Misalnya, kemampuan untuk mengendalikan variabel yang penting untuk meniru jaringan mengungkapkan bagaimana kekakuan lingkungan mikro tempat sel berada memengaruhi proliferasi, [ 3 ] migrasi, [ 4 ] dan diferensiasi. [ 5 ] Namun, perubahan kekakuan sering dikaitkan dengan perubahan porositas, yang juga dapat memengaruhi perilaku seluler. Porositas hidrogel secara langsung memengaruhi sifat mekanis dan transpornya, dan dengan demikian, interaksinya dengan sel dan biomolekul. [ 6 , 7 ] Misalnya, porositas mengatur transportasi nutrisi, [ 8 ] infiltrasi sel, [ 9 ] dan regenerasi jaringan. [ 10 ] Selain itu, porositas juga dapat memfasilitasi crosstalk antara sel dan pengikatan protein. [ 11 , 12 ] Dalam sistem penghantaran obat, porositas mengontrol profil pelepasan agen terapeutik. [ 13 , 14 ] Oleh karena itu, sangat penting untuk mengembangkan metode untuk melacak porositas hidrogel secara akurat.

Hidrogel terdiri dari jaringan skala nano yang dibentuk oleh hubungan polimer. Ruang antara hubungan polimer ini, disebut sebagai jaring, sangat penting dalam menentukan berbagai sifat hidrogel. Ruang yang lebih besar yang muncul dari berbagai faktor selama polimerisasi dan gelasi dikenal sebagai pori-pori. [ 15 ] Meskipun istilah “jaring” dan “pori-pori” sering digunakan secara bergantian untuk menggambarkan porositas hidrogel, keduanya berbeda secara signifikan dalam skala dan fungsi. Jaring skala nano terutama mengatur difusi pasif molekul kecil, seperti biomolekul, metabolit, dan obat terapeutik. [ 13 ] Sebaliknya, pori-pori skala mikron memengaruhi migrasi sel, karena ukuran nukleus membatasi kemampuan sel untuk melintasi matriks hidrogel. [ 9 , 16 ] Memahami perbedaan ini sangat penting untuk menyesuaikan desain hidrogel dengan aplikasi biomedis tertentu.

Berbagai teknik telah dikembangkan untuk mengkarakterisasi “porositas” dan/atau jaring hidrogel. Setiap teknik memiliki kekuatan dan keterbatasannya sendiri. Uji pembengkakan kesetimbangan adalah metode yang umum digunakan untuk mengukur ukuran jaring hidrogel secara tidak langsung menggunakan persamaan Flory–Rehner, yang menghubungkan perilaku pembengkakan hidrogel dengan struktur jaringannya. [ 17 ] Uji ini memberikan ukuran jaring rata-rata keseluruhan, bukan distribusi ukuran jaring. Teknik hamburan cahaya, khususnya hamburan neutron sudut kecil (SANS) dan hamburan sinar-X sudut kecil (SAXS) telah digunakan untuk mengukur ukuran jaring dan pori hidrogel. [ 18 , 19 ] Teknik-teknik ini menghubungkan jarak internal dalam jaringan hidrogel dengan intensitas radiasi yang tersebar saat melewati sampel. Teknik-teknik ini dapat menyelidiki rentang yang luas, dari skala sub-nanometer hingga sub-mikron. Pencitraan mikropori hidrogel telah dicapai menggunakan mikroskopi konfokal pada gel yang telah diberi label fluoresensi. [ 18 , 20 ] Analisis panjang kord, metode analisis data yang mapan untuk mengukur porositas, dapat diaplikasikan pada hidrogel berlabel fluoresensi dengan mengukur panjang segmen dari garis berorientasi acak yang melintasi batas fase. Uji pelacakan partikel, berdasarkan difusi, adalah teknik yang mengkarakterisasi porositas aktual dengan hidrogel dalam keadaan aslinya tanpa persyaratan modifikasi kimia. Teknik ini melibatkan penanaman partikel fluoresensi dalam hidrogel dan melacak gerakannya dari waktu ke waktu. Pergerakan partikel ini dipengaruhi oleh ukuran pori hidrogel dan sifat difusi partikel melalui material. [ 18 , 21 ] Ini umumnya digunakan dalam mikro-reologi untuk menentukan sifat viskoelastis lokal. Lebih jauh, teknik ini dapat mengukur perubahan waktu nyata dalam hidrogel dengan struktur dinamis. [ 21 ] Misalnya, mengukur perubahan porositas hidrogel selama remodeling yang dimediasi sel. [ 22 ] Keterbatasan teknik ini adalah hanya dapat memantau ukuran pori hidrogel yang lebih besar dari ukuran partikel yang dapat dilacak. Teknik lain yang dapat menilai porositas hidrogel dalam keadaan aslinya adalah mikroskopi gaya atom (AFM). AFM menyediakan pemetaan topografi permukaan hidrogel beresolusi tinggi, yang memungkinkan visualisasi bukaan pori dalam kondisi terhidrasi. [ 23 ]AFM juga dapat mengukur kekakuan lokal secara bersamaan dengan topografi permukaan. Namun, AFM terbatas pada pencitraan tingkat permukaan dan area pemindaian kecil, yang mungkin tidak mencerminkan struktur pori internal secara penuh. [ 24 ]

Teknik mikroskop elektron menawarkan visualisasi langsung dari struktur pori hidrogel. Mikroskopi elektron pemindaian lingkungan adalah pendekatan yang muncul yang memungkinkan pencitraan hidrogel dalam keadaan terhidrasi sebagian. Namun, mungkin tidak cocok untuk semua hidrogel. Misalnya, teknik ini menunjukkan keberhasilan yang terbatas dalam menghasilkan mikrostruktur yang jelas dari kolagen terhidrasi dan hidrogel poligliserol metakrilat. [ 25 , 26 ] Untuk menjembatani kesenjangan ini, mikroskop elektron pemindaian kriogenik (cryo-SEM) telah menjadi alternatif yang kuat karena dapat memberikan gambar resolusi tinggi dari morfologi hidrogel, yang memungkinkan pengamatan langsung ukuran pori, bentuk, dan distribusi. Namun, pencitraan cryo-SEM memerlukan pembekuan cepat air dalam hidrogel, yang dapat merusak struktur aslinya. [ 27 ] Hal ini telah menjadi perhatian yang berkembang bagi para ilmuwan yang ingin mengkarakterisasi porositas hidrogel mereka.

Untuk mengatasi masalah ini, kami berupaya mengembangkan metode yang mampu menganalisis hidrogel dalam keadaan aslinya, tanpa artefak yang diperkenalkan oleh pengeringan atau pembekuan. Secara khusus, kami bertujuan untuk mengevaluasi keandalan ukuran pori yang diperoleh melalui pencitraan SEM dengan membandingkannya dengan pendekatan berbasis pelacakan partikel, yang mempertahankan struktur asli gel selama analisis. Menggabungkan hasil dari pengujian ini, kami menjelaskan struktur hidrogel polietilen glikol (PEG), tiruan matriks ekstraseluler yang banyak digunakan. [ 4 , 28 – 31 ] Sementara pelacakan partikel sebelumnya telah digunakan untuk memperkirakan ukuran pori rata-rata, pendekatan kami memperkenalkan metode baru untuk menganalisis data difusi yang mengukur dimensi pori pada tingkat pori tunggal daripada rata-rata massal. Untuk mendapatkan pemahaman yang lebih komprehensif tentang struktur hidrogel, kami memanfaatkan alat dari geometri komputasional, yang disebut algoritma “convex hull”, [ 32 – 36 ] yang menerjemahkan ansambel lintasan partikel menjadi garis besar pori hidrogel. Dengan menerapkan algoritma ini pada data pelacakan partikel, kami merekonstruksi struktur internal hidrogel dan mengukur metrik penting, seperti distribusi volume pori, luas permukaan, diameter, dan kebulatan. Metrik ini relevan untuk mengkarakterisasi hidrogel yang digunakan dalam berbagai aplikasi. Misalnya, volume pori dapat menunjukkan ruang yang tersedia untuk sel atau muatan terapeutik, sementara luas permukaan pori dapat berfungsi sebagai ukuran molekul bioaktif yang dapat diakses dalam sel yang terperangkap. Diameter pori adalah metrik yang biasanya digunakan untuk mengkarakterisasi ukuran pori, dan derajat dimensinya yang rendah memungkinkan perbandingan pori yang diukur dalam dua dimensi (2D) dan 3D. Kebulatan dapat mengungkapkan bagaimana morfologi sel beradaptasi dengan pori-pori atau bagaimana pori-pori beradaptasi dengan sel. Akhirnya, menggunakan pori-pori 3D dari uji pelacakan partikel, kami mensimulasikan gambar 2D pori-pori dan distribusinya untuk menunjukkan bagaimana uji pelacakan partikel dengan analisis convex hull dapat memberikan gambar analog dengan yang diperoleh dari SEM.

2 Hasil dan Pembahasan
2.1 Mikropori pada Hidrogel Timbul Akibat Cacat Pembentukan Jaring
Strategi kimia yang kami terapkan untuk mengendalikan kekakuan hidrogel melibatkan variasi berat molekul polimer. Strategi ini mau tidak mau mengubah jarak antara unit polimer ikatan silang dalam hidrogel. Polimer PEG 4 lengan dengan berat molekul 10 dan 20 kDa masing-masing bersesuaian dengan panjang lengan yang lebih pendek dan lebih panjang. Kami mengikat silang polimer PEG 4 lengan ini melalui reaksi klik maleimide-thiol untuk membuat hidrogel dengan kepadatan ikatan silang rendah (0,7 kPa) dan tinggi (1,5 kPa) dari polimer 20 dan 10 kDa, masing-masing. Secara teoritis, lengan PEG yang lebih panjang menghasilkan jarak yang lebih besar antara polimer ikatan silang daripada lengan yang lebih pendek ( Gambar 1 a ), karenanya ukuran mata jaring yang lebih besar. Kami kemudian mengkarakterisasi jarak dalam hidrogel ini menggunakan metode yang banyak digunakan: uji pembengkakan kesetimbangan dan pencitraan SEM. Karena kekakuan merupakan parameter terkontrol dan mencerminkan perubahan dalam kerapatan ikatan silang, kami menyajikan nilainya di samping ukuran jaring dan pori untuk menggambarkan perubahan struktural dengan berbagai sifat mekanis.

Gambar 1
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
a) Skema jaringan molekuler skala nano dan mikro hidrogel PEG dalam skala nano dan mikro. b) Ukuran mata jaring hidrogel PEG ditentukan oleh uji pembengkakan berdasarkan teori pembengkakan kesetimbangan Flory–Rehner. c) Distribusi diameter pori hidrogel PEG dengan nilai median 9,67 dan 11,36 µm untuk PEG 0,7 dan 1,5 kPa. Data pori dikumpulkan dari tiga sampel untuk setiap hidrogel yang ditentukan dari gambar krio-SEM hidrogel PEG: d) 0,7 kPa, dan e) 1,5 kPa. Batang skala panjangnya 100 µm. f) Kurva perpindahan kuadrat rata-rata (MSD) yang menunjukkan gerakan terbatas manik-manik (n ≥ 1000) di dalam hidrogel PEG ( n = 3) dibandingkan dengan perilaku linier difusi bebas yang disimulasikan. g) Panjang difusi dari kurva MSD dalam (f) sebagai perkiraan ukuran pori untuk PEG 0,7 dan 1,5 kPa. Uji-T: * menunjukkan 0,01 < p ≤ 0,05, ns menunjukkan tidak signifikan.
Dengan menggunakan uji pembengkakan kesetimbangan, kami menentukan bahwa ukuran mata jaring hidrogel PEG 0,7 kPa (0,99 nm) lebih besar daripada hidrogel PEG 1,5 kPa (0,88 nm) seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1b . Hasil ini konsisten dengan desain kimia yang dijelaskan di atas, yang diilustrasikan dalam jaringan molekuler skala nano pada Gambar 1a . Namun, kami mencapai nilai yang sangat berbeda dengan menggunakan SEM berukuran 9,67 µm untuk hidrogel 0,7 kPa dan 11,36 µm untuk hidrogel 1,5 kPa (Gambar 1c ). Nilai-nilai ini diperoleh dari gambar SEM, dengan gambar representatif ditunjukkan pada Gambar 1d,e . Gambar SEM ini menunjukkan pori-pori, bukan mata jaring hidrogel. Diameter terpanjang untuk setiap pori dilaporkan sebagai diameter pori. Khususnya, diameter pori dari gambar SEM dalam skala mikron, yang tiga kali lipat berbeda dari nilai skala nano dari uji pembengkakan kesetimbangan. Bahasa Indonesia: Sementara kami mengakui kekhawatiran bahwa langkah persiapan sampel untuk cryo-SEM dapat memperkenalkan artefak pada sampel, [ 23 , 26 ] kami kemudian menggunakan uji pelacakan partikel untuk mengonfirmasi keberadaan mikropori dalam hidrogel seperti yang ditunjukkan dalam pekerjaan kami sebelumnya. [ 28 ] Metode ini memungkinkan kami untuk menyelidiki mikropori hidrogel dalam keadaan aslinya. Untuk memastikan representasi akurat dari aksesibilitas pori, pemilihan ukuran partikel dipandu dengan menguji perilaku difusi partikel dengan diameter 0,2, 0,5, 1, 2, 10 µm. Partikel pada ukuran terkecil (0,2 µm) menunjukkan difusi cepat, membuatnya sulit dilacak dengan andal, sedangkan yang terbesar (10 µm) tidak dapat berdifusi dengan bebas. Berdasarkan pengamatan ini, ukuran antara (0,5–2 µm) dianggap optimal untuk pelacakan dan penyelidikan struktur mikropori yang efektif.

Kami mengkarakterisasi perilaku difusi manik-manik fluoresen 1 µm (FluoSpheres) yang dienkapsulasi dalam hidrogel. Kurva perpindahan kuadrat rata-rata (MSD) dari uji pelacakan partikel ditunjukkan pada Gambar 1f . Kurva MSD ini diturunkan dari Persamaan ( 6 ). Kurva MSD yang disimulasikan dari manik-manik mikro yang berdifusi bebas yang berdiameter 1 µm dihasilkan secara komputasional berdasarkan persamaan Stokes–Einstein (Persamaan 9 ) menggunakan variabel-variabel berikut yang sesuai dengan kondisi eksperimen: T = 300 K, η = 0,001 Pa·s, r = 0,5 × 10 −6 m. Peningkatan linear dalam MSD dari manik-manik yang berdifusi bebas secara grafis menggambarkan bahwa manik-manik yang bergerak terus-menerus memperoleh jarak dari titik awalnya seiring waktu. Sementara manik-manik bergerak yang dienkapsulasi dalam hidrogel PEG mencapai titik puncak dalam kurva MSD mereka, data empiris ini menunjukkan bahwa ada jarak maksimum yang dapat dicapai manik-manik relatif terhadap titik awal mereka di dalam hidrogel. Jarak maksimum dikaitkan dengan difusi terbatas dalam pori-pori hidrogel. Karena ukuran pori membatasi MSD, jarak maksimum ini merupakan fungsi dari dimensi pori. Manik-manik berdiameter 1 µm dan terutama terdifusi dalam pori-pori yang berdiameter lebih besar dari 1 µm. Dengan demikian pergerakan manik-manik menunjukkan adanya pori-pori dalam hidrogel yang ukurannya secara signifikan lebih besar dari 1 µm yang konsisten dengan skala panjang yang diperoleh dari gambar cryo-SEM.

Untuk memperkirakan ukuran pori, kami menghitung panjang difusi dari dataran tinggi pada kurva MSD (Persamaan 7 ), karena panjang difusi berbanding lurus dengan ukuran pori rata-rata. Ini dilakukan dengan memasang model linier di sepanjang wilayah dataran tinggi kurva MSD dan mengekstrapolasinya ke waktu nol (Gambar S1 , Informasi Pendukung). Akar kuadrat dari nilai MSD yang sesuai (y-intercept) pada waktu nol kemudian diambil sebagai panjang difusi. Panjang difusi yang dihitung untuk hidrogel 0,7 dan 1,5 kPa masing-masing adalah 17 (± 7) µm dan 19 (± 4) µm, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1g . Nilai-nilai ini memiliki besaran yang sama dan tidak berbeda secara statistik (P = 0,63), meskipun agak lebih besar daripada diameter pori yang diukur dari SEM, yaitu 9,67 µm untuk hidrogel 0,7 kPa dan 11,36 µm untuk hidrogel 1,5 kPa, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1c .

Khususnya, Gambar 1f menunjukkan bahwa kurva MSD dari PEG 0,7 kPa mencapai titik puncak pada nilai yang lebih rendah daripada PEG 1,5 kPa, yang menunjukkan bahwa pori-pori dalam PEG 0,7 kPa lebih kecil daripada dalam PEG 1,5 kPa. Dari data MSD, kami menentukan eksponen difusi yang dilambangkan sebagai n dalam Persamaan ( 8 ) ( MSD   = 6 Dt n ) untuk menggambarkan tingkat pengurungan. [ 18 ] Kemiringan persamaan linear, ketika log e (MSD) versus log e (t) diplot, mengacu pada eksponen difusi. Partikel yang tertanam dalam hidrogel PEG 0,7 kPa memiliki eksponen difusi yang lebih tinggi (0,41 ± 0,04) daripada partikel yang tertanam dalam hidrogel PEG 1,5 kPa (0,35 ± 0,06). Selain itu, kedua eksponen difusi kurang dari 1 yang menunjukkan bahwa partikel mengalami perilaku sub-difusif di daerah terbatas. Sementara itu, eksponen difusi simulasi dari manik-manik yang berdifusi bebas sama dengan 1, yang mengacu pada perilaku difusi bebas. Secara keseluruhan, kurva MSD yang dihasilkan dari uji pelacakan partikel pada Gambar 1f menguatkan pengukuran pori dari gambar cryo-SEM bahwa ukuran pori dalam PEG 0,7 kPa lebih kecil dari PEG 1,5 kPa. Karena uji pelacakan partikel memungkinkan pemeriksaan mikropori dalam keadaan asli sampel, pengukuran tambahan ini menunjukkan bahwa keberadaan mikropori dalam sampel tidak secara eksklusif merupakan artefak karena persiapan sampel dari pencitraan SEM. Keberadaan mikropori selanjutnya dikonfirmasi melalui infiltrasi partikel fluoresen 1 µm (Gambar S2 , Informasi Pendukung). Selain itu, kami sebelumnya telah menunjukkan migrasi limfosit T sitotoksik (≈10 µm) dalam hidrogel PEG yang diikat silang dengan peptida. [ 28 ] Karena limfosit T diketahui bermigrasi melalui perancah kolagen berpori melalui mekanisme yang independen secara proteolitik, [ 37 ] pori-pori skala mikron yang diamati dalam penelitian ini memberikan penjelasan yang masuk akal tentang bagaimana sel-sel ini dapat menavigasi melalui apa yang secara konvensional dianggap sebagai matriks berpori nano. Dengan nilai pori skala nano dan skala mikro, kami menyimpulkan bahwa pori-pori mikro mungkin disebabkan oleh cacat dalam pembentukan jaring seperti yang digambarkan dalam jaringan molekuler skala mikro pada Gambar 1a .

Sementara hidrogel PEG 4-lengan sering disebut sebagai “jaringan polimer ideal”, [ 38 – 40 ] penggabungan pengikat silang peptida asimetris seperti urutan yang dapat didegradasi MMP disistein (Gambar S3 , Informasi Pendukung) memperkenalkan ketidakcocokan geometri yang pasti mengarah pada ketidakhomogenan seperti pori-pori skala mikron yang diamati dalam penelitian kami. Cacat ini kemungkinan diperparah oleh ikatan silang yang tidak seragam karena gelasi cepat yang diberikan dengan reaksi adisi tipe Michael. Kehadiran mikropori telah dilaporkan sebelumnya dalam sistem berbasis PEG lainnya. [ 41 ] Tingkat mikroporositas diinginkan untuk aplikasi kami karena meniru struktur hierarkis matriks jaringan asli, yang mengandung fitur skala nano dan mikro. [ 42 ]

Karena persiapan sampelnya yang tidak merusak, pengujian pelacakan partikel merupakan pendekatan yang menarik untuk mengukur mikroporositas hidrogel. Meskipun pengujian tersebut memberikan perkiraan ukuran pori dari kurva MSD, pengujian tersebut tidak memberikan informasi tentang ukuran pori aktual dan distribusinya. Keterbatasan ini membuat kami bertanya apakah kami dapat memperluas pengujian pelacakan partikel untuk menghasilkan distribusi ukuran pori dan menjelaskan porositas hidrogel secara lebih komprehensif. Selanjutnya, kami menunjukkan bagaimana data difusi dapat digunakan dengan cara baru untuk menyelidiki informasi tambahan tentang mikrostruktur hidrogel di luar panjang difusi sebagai perkiraan ukuran pori.

2.2 Difusi Partikel dalam Mikropori dapat Menyelidiki Sifat Geometris Mikropori
Pergerakan partikel di ruang angkasa diamati dan dilacak menggunakan mikroskop dan algoritma pelacakan. Jejak representatif ditunjukkan pada Gambar 2a untuk pergerakan sepanjang bidang 2D dan pada Gambar 2d untuk pergerakan dalam ruang 3D. Ketika difusi terjadi di mikropori, tingkat pergerakan partikel dibatasi oleh dinding mikropori. Mengamati dan merekam tumbukan berulang partikel terhadap dinding di berbagai bagian mikropori memungkinkan kita untuk memperkirakan informasi geometri mikropori. Ini dicapai dengan mengabaikan dimensi waktu jejak (Gambar 2b ) dan menghubungkan koordinat posisi terluarnya. Kita kemudian dapat membuat struktur yang mewakili bentuk padat mikropori (Gambar 2c,e–g ). Dengan kata lain, ini melibatkan pembuatan bentuk cembung terkecil yang menutupi serangkaian titik, sebuah konsep matematika yang dikenal sebagai convex hull. Untuk membangun struktur ini dan mengekstrak informasi geometri dari data pelacakan partikel kami, kami meminjam alat dari geometri komputasional yang dikenal sebagai algoritma convex hull. Algoritma convex hull diimplementasikan ke koordinat posisi lintasan menggunakan python dan pustaka SciPy. [ 35 ] Struktur yang dihasilkan kemudian dapat digunakan untuk menghitung sifat geometris seperti volume, diameter, dan bentuk yang dapat menggambarkan struktur mikro hidrogel. Dari sini, kami menyebut struktur padat yang dihasilkan secara komputasional ini sebagai model geometris.

Gambar 2
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Algoritma convex hull memungkinkan pemetaan geometri geometri hidrogel. Cap waktu untuk setiap koordinat untuk ag digambarkan dalam bilah warna di sebelah kanan c. a) Jejak 2D difusi partikel. b) Jejak 2D disederhanakan menjadi koordinat posisi dan algoritma convex hull diterapkan. c) Hasil visualisasi algoritma convex hull yang diterapkan pada b. Koordinat posisi yang diidentifikasi sebagai titik sudut disorot dalam lingkaran abu-abu. Bentuk 2D yang dihasilkan ditunjukkan dengan warna biru yang darinya dimensi pori dapat diekstraksi. d–g) Algoritma convex hull juga dapat diterapkan pada koordinat posisi 3D untuk menghasilkan bentuk 3D. f) Garis abu-abu menunjukkan tepi permukaan bentuk 3D. (g) Perspektif tampilan samping f sepanjang bidang yz . h) Ilustrasi titik sudut yang diidentifikasi pada posisi x, y yang merupakan pusat manik kuning dengan radius r . Garis abu-abu putus-putus adalah perkiraan yang lebih baik dari batas pori. i) Ilustrasi representatif bentuk 2D dengan koreksi (garis putus-putus abu-abu) dan tanpa koreksi (bentuk terisi biru). Histogram diameter rongga ditentukan menggunakan dua ukuran manik yang berbeda j) tanpa koreksi dan k) dengan koreksi. Garis vertikal kuning dan biru menunjukkan diameter rongga median untuk diameter manik 2 dan 0,5 µm, masing-masing.
2.3 Dimensi Rongga Dapat Diukur dengan Menerapkan Algoritma Convex Hull pada Koordinat Posisi Partikel yang Dilacak
Kami merangkum partikel berbasis polistirena dengan diameter 0,5 dan 2 µm dalam hidrogel PEG 0,7 kPa yang sama. Kami mengamati difusi partikel di area kecil yang sama untuk menentukan apakah ukuran partikel memengaruhi model geometrik terhitung dari mikropori. Algoritma convex hull yang tersedia di pustaka SciPy mengeluarkan simpul model geometrik dari koordinat posisi. Simpul ini digunakan untuk menghitung jarak antara semua simpul menggunakan Persamaan ( 10 ) dan, jarak terpanjang (juga dikenal sebagai diameter Feret) dalam model geometrik dilaporkan sebagai diameter mikropori. Diameter mikropori hidrogel ditunjukkan pada Gambar 2j . Di sini, kami mengamati perbedaan dalam diameter terukur sebagai fungsi dari ukuran partikel; Pori-pori yang diukur menggunakan manik-manik 0,5 µm memiliki diameter median 10 (± 1) µm sedangkan diameter median menggunakan manik-manik 2 µm adalah 8 (± 3) µm. Perbedaan ini disebabkan oleh penugasan komputasional koordinat posisi partikel ke titik beratnya, bukan tepi partikel yang bersentuhan dengan dinding mikropori (Gambar 2h ). Ketidakcocokan ini meluas ke semua sisi struktur (Gambar 2i ). Dengan demikian, diameter yang dihitung dapat dikoreksi dengan menambahkan diameter partikel yang digunakan selama pengujian. Menerapkan koreksi ini menghasilkan presisi yang lebih baik dari diameter yang diukur dengan diameter median yang diukur sebesar 11 (± 1) µm dan 10 (± 3) µm untuk manik-manik 0,5 dan 2 µm, masing-masing (Gambar 2k ).

Selanjutnya, kami menguji validitas nilai terukur yang kami peroleh dari uji pelacakan partikel. Untuk mencapainya, kami membuat rongga dengan dimensi yang diketahui.

2.4 Model Geometris Menentukan Diameter Mikropori Secara Akurat
Kami membuat sumur mikro agarosa dengan diameter 9, 12, 30, 55, 175, dan 250 µm menggunakan cetakan polidimetilsiloksan (PDMS) ( Gambar 3a ). Sumur mikro yang dihasilkan berbentuk dan berukuran cetakan (Gambar 3b ) . Partikel fluoresensi kemudian dituang ke dalam sumur mikro, dan difusinya diamati dan dilacak (Gambar S4 , Informasi Pendukung). Gambar 3c menunjukkan lintasan representatif dari analisis gambar. Algoritma convex hull diterapkan pada koordinat posisi lintasan ini untuk menghitung diameter terukur seperti dijelaskan di bagian sebelumnya. Diameter terukur dari analisis ini dikorelasikan dengan diameter sebenarnya dari cetakan PDMS untuk memvalidasi pengukuran dari pelacakan partikel. Gambar 3d menunjukkan sensitivitas 0,965 dan korelasi linear yang kuat (R2 = 0,991) dengan kesalahan standar regresi yang rendah (0,005). Nilai-nilai ini menunjukkan bahwa perubahan diameter sebenarnya dalam mikrowell menyebabkan perubahan yang sama pada diameter yang diukur menggunakan uji pelacakan partikel. Secara keseluruhan, Gambar 3d menetapkan keandalan pengukuran yang diperoleh menggunakan uji pelacakan partikel.

Gambar 3
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Model berstruktur mikro dari volume terbatas menunjukkan penentuan diameter pori yang andal. a) Skema untuk membuat rongga mikro dengan dimensi yang ditentukan. Agarosa cair panas dituangkan ke cetakan polidimetilsiloksan (PDMS) untuk membuat sumur mikro agarosa. b) Gambar representatif sumur mikro agarosa 250 µm yang dihasilkan (Skala batang = 250 µm). c) Hasil representatif pelacakan partikel manik-manik fluoresen dalam sumur mikro 55 µm dengan dimensi yang ditentukan (Skala batang = 100 µm). d) Korelasi linier dari diameter yang diukur menggunakan analisis difusi partikel cangkang cembung terhadap diameter sumur mikro yang sebenarnya ( n = 4–52).
2.5 Geometri Mikropori 3D Ditentukan Menggunakan Uji Pelacakan Partikel
Dari data yang sama yang menghasilkan kurva MSD pada Gambar 1f , kami menerapkan algoritma convex hull dan menghasilkan model geometri, yang merujuk pada pori-pori 3D yang direkonstruksi secara komputasional. Gambar 1f menunjukkan bahwa kami mengumpulkan data difusi yang cukup untuk melacak pori-pori: kurva MSD partikel yang berdifusi di dalam dataran tinggi hidrogel setelah 5 menit dan kami terus mengumpulkan data difusi selama 10 menit berikutnya. Dengan data difusi ini, kami mengukur dimensi yang relevan untuk menjelaskan mikrostruktur hidrogel seperti volume pori, luas permukaan, kesferisan, dan diameter pori dengan lebih baik ( Gambar 4 a–d ). Volume pori dan luas permukaan ditentukan menggunakan fungsi bawaan di pustaka SciPy. Kemudian, kesferisan dihitung dari volume pori dan luas permukaan menggunakan Persamaan ( 11 ).

Gambar 4
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Pengukuran dimensi pori hidrogel PEG menggunakan algoritma convex hull: a) fungsi distribusi kumulatif empiris volume pori dan b) luas permukaan pori, histogram c) kesferisan, dan d) diameter pori. Garis putus-putus dengan legenda warna yang sama mewakili nilai median. Data dikumpulkan dari empat sampel setiap hidrogel PEG. e) Skema penampang gel sepanjang bidang xy (garis putus-putus biru) yang mungkin atau mungkin tidak tumpang tindih dengan diameter terpanjang pori-pori 3D yang direpresentasikan sebagai garis merah. f) Diameter pori SEM simulasi yang berasal dari pori-pori 3D empiris yang sebanding dengan nilai yang diperoleh dari data SEM empiris pada Gambar 1c .
Volume pori, luas permukaan, dan diameter hidrogel PEG 1,5 kPa lebih tinggi daripada hidrogel PEG 0,7 kPa (Gambar 4a,b,d ). Kesferisan mikropori di kedua hidrogel serupa. Nilai-nilai terukur ini mendukung mikropori dari gambar SEM (Gambar 1c–e ) dan perkiraan kurva MSD (Gambar 1f,g ). Khususnya, diameter pori median (17,62 µm dan 19,49 µm) pada Gambar 4d dan panjang difusi rata-rata (16,82 dan 19,11 µm) pada Gambar 1g sangat dekat, yang menunjukkan bahwa panjang difusi merupakan perkiraan yang cocok untuk diameter pori.

Meskipun kami memperoleh nilai skala panjang yang serupa dalam diameter mikropori dari gambar SEM dan model geometris, terdapat deviasi ≈10 µm dalam diameter mikropori terukur yang tidak sepele. Kami berhipotesis bahwa perbedaan dalam dimensi pencitraan menyebabkan deviasi dalam pori-pori terukur; gambar SEM dalam 2D ​​sedangkan model geometris dalam 3D. Selama persiapan sampel untuk SEM, hidrogel dipotong melintang untuk memperlihatkan struktur internalnya. Gambar SEM diambil dari bidang potongan melintang yang mungkin sejajar atau tidak dengan diameter terpanjang mikroporinya dalam 3D seperti yang diilustrasikan dalam Gambar 4e .

Untuk menguji hipotesis kami, kami menggunakan pori-pori yang direkonstruksi yang dihasilkan oleh algoritma convex hull (model geometris 3D) untuk mensimulasikan gambar yang mendekati informasi yang diperoleh dari SEM; yaitu proyeksi 2D yang menunjukkan rentang ukuran pori dan distribusinya. Intinya, model geometris 3D diubah menjadi model geometris 2D. Untuk mencapai ini, kami menghapus koordinat z dari setiap titik sudut dalam model geometris 3D, yang secara efektif meratakan struktur ke 2D. Selanjutnya, algoritma convex hull diterapkan kembali ke koordinat xy yang dihasilkan dari titik-titik sudut, yang menghasilkan model geometris planar 2D. Ilustrasi sederhana dari prinsip ini dapat ditemukan pada Gambar S5 (Informasi Pendukung). Model geometris 2D ini berfungsi sebagai pori-pori yang disimulasikan seperti yang diamati dalam SEM. Distribusi diameter pori dari pori-pori SEM yang disimulasikan pada Gambar 4f sangat cocok dengan diameter pori-pori SEM empiris pada Gambar 1c , yang menunjukkan keselarasan geometri pori komputasional kami dengan pengukuran SEM. Lebih jauh lagi, karena kami mampu mensimulasikan pori-pori SEM 2D empiris dari model geometri 3D kami yang diukur dalam keadaan asli hidrogel, data kami menunjukkan bahwa pada skala panjang ini, pencitraan SEM memberikan penggambaran yang akurat dari ukuran pori 2D. Selanjutnya, kami bertujuan untuk memvisualisasikan pori-pori 2D yang disimulasikan untuk mendapatkan pemahaman yang lebih baik tentang fitur strukturalnya.

2.6 Representasi Abstrak Model Geometris Datar Dihasilkan melalui Rekonstruksi Gambar Komputasional
Kami menggunakan model geometri 2D yang mensimulasikan diameter 2D pada Gambar 4f untuk merekonstruksi gambar pori pseudo-2D ( Gambar 5 ). Memplot model ini pada posisi aslinya mengungkapkan tumpang tindih spasial yang jelas antara pori-pori di kedua hidrogel (Gambar 5a,b ). Ini terjadi karena pori-pori yang mendatar dari bidang- z yang berbeda kehilangan resolusi spasial sepanjang sumbu -z , yang menyebabkan pori-pori dari lapisan yang berbeda tampak seolah-olah menempati bidang- z yang sama . Akibatnya, setiap tumpang tindih dalam koordinat xy mereka tampak sebagai tumpang tindih pada Gambar 5a,b . Tumpang tindih ini membuat sulit untuk membedakan dengan jelas bentuk dan ukuran pori-pori dari model geometri 2D.

Gambar 5
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Rekonstruksi gambar pori pseudo-2D yang diperoleh dari data pori 2D yang disimulasikan. Pori 2D yang direkonstruksi dari model geometri yang diratakan (a,b) sebagaimana adanya, dan (c,d) dengan celah 10 µm di antara pori-pori. e) Menggunakan diameter dari sebagian model geometri, lingkaran dibuat dan dipasang bersama menggunakan algoritma pengemasan lingkaran. Lingkaran-lingkaran ini berfungsi sebagai tempat penampung untuk model geometri yang diratakan. f) Model geometri yang diratakan dibatasi pada lingkaran yang sesuai. g) Lingkaran model dihilangkan. Metode pengemasan ini ditingkatkan ke data dan digunakan untuk merekonstruksi gambar pori pseudo-2D dari hidrogel h) 0,7 kPa dan i) 1,5 kPa.
Untuk memvisualisasikan pori-pori individual tanpa tumpang tindih, kami menyesuaikan posisi pori-pori untuk menghilangkan tumpang tindih sambil mempertahankan bentuk, ukuran, dan orientasi spasialnya. Mengikuti prinsip ini, kami menggunakan dua pendekatan: 1) memetakan setiap pori dengan jarak celah 10 µm di antara mereka sepanjang sumbu x (Gambar 5c,d ), dan 2) memetakan setiap pori dengan jarak celah yang bervariasi yang memaksimalkan kerapatan pengepakannya (Gambar 5h,i ). Kedua pendekatan memastikan bahwa fitur geometris pori tetap utuh meskipun kehilangan posisi aslinya.

Bahasa Indonesia: Merencanakan setiap pori dengan jarak celah tetap seperti pada Gambar 5c,d secara komputasi mudah karena tidak perlu mempertimbangkan bentuk dan orientasi setiap pori. Namun, ini tidak terjadi ketika kami memasang pori dengan jarak celah yang bervariasi untuk mengemasnya dengan rapat. Mayoritas pori adalah poligon tidak beraturan, membuat implementasi komputasi jauh lebih rumit. Untuk mencapai ini, kami menggunakan alat lain dari geometri komputasi yang dikenal sebagai algoritma pengemasan. Kami menggunakan implementasi Python (packcircles 0.14) yang dikembangkan oleh Wang et al. [ 43 ] Untuk membuat prototipe rekonstruksi gambar, kami memilih sebagian kecil data. Diameter pori model geometri 2D digunakan untuk membuat lingkaran dengan ukuran yang cocok, yang kemudian dikemas rapat menggunakan algoritma pengemasan lingkaran (Gambar 5e ). Lingkaran yang dikemas ini berfungsi sebagai tempat penampung untuk pori-pori, dengan diameter setiap lingkaran sesuai dengan pori yang diwakilinya. Sentroide setiap pori dihitung menggunakan Persamaan ( 12 ) dan ( 13 ). Kemudian, setiap centroid diposisikan ulang untuk mencocokkan koordinat pusat lingkaran placeholder. Menggunakan centroid yang diposisikan ulang sebagai titik referensi, titik sudut pori disesuaikan, menghasilkan pori-pori yang dibatasi di sekitar lingkaran yang sesuai (Gambar 5f ). Setelah itu, lingkaran placeholder dihapus untuk menunjukkan gambar pori pseudo-2D (Gambar 5g ). Algoritma ini kemudian ditingkatkan ke seluruh dataset, menghasilkan Gambar 5h,i . Sebagian dari pori-pori 3D yang dikemas ini juga divisualisasikan dalam bentuk model berputar (Film S1 , Informasi Pendukung).

Untuk memvalidasi pendekatan kami, kami membandingkan distribusi diameter pori antara pori pseudo-2D dan pori yang diperoleh dari SEM menggunakan uji Mann–Whitney U. Nilai-p adalah 0,74 untuk hidrogel 0,7 kPa dan 0,58 untuk hidrogel 1,5 kPa, yang menunjukkan tidak ada perbedaan signifikan antara distribusi ukuran pori pseudo-2D dan ukuran pori yang ditentukan dari gambar SEM 2D. Hasil ini mengonfirmasi bahwa representasi abstrak menyerupai fitur struktural pori hidrogel yang ditangkap dalam pencitraan SEM. Representasi pseudo-2D ini tidak hanya melengkapi metrik kuantitatif tetapi juga memungkinkan kami untuk memvisualisasikan struktur pori yang diperoleh dari uji pelacakan partikel terintegrasi dan algoritma convex hull, yang memajukan pemahaman kami tentang porositas hidrogel.

Meskipun metode kami menyediakan pendekatan praktis dan mudah diakses untuk memvisualisasikan dan mengukur mikropori dalam hidrogel, beberapa keterbatasan tetap ada. Pori yang lebih kecil dari ukuran partikel terkecil yang digunakan dalam pengujian mungkin tidak terdeteksi, yang berpotensi menyebabkan perkiraan porositas skala yang lebih halus menjadi terlalu rendah. Keterbatasan ini dapat diatasi dengan melengkapi metode kami dengan SANS atau SAXS, yang mampu menyelidiki skala dengan panjang yang lebih pendek. Selain itu, faktor yang membatasi difusi seperti penyerapan partikel ke jaringan polimer dapat memengaruhi kelayakan pelacakan partikel. Meskipun masalah ini dapat diatasi dengan menggunakan kimia permukaan yang tepat, probe partikel komersial yang tersedia saat ini menawarkan fungsionalitas kimia yang terbatas. Menggunakan strategi kimia untuk memodifikasi kimia permukaan partikel dapat membantu mengatasi keterbatasan ini. Upaya di masa mendatang dapat memperoleh manfaat dari pengembangan pustaka probe partikel yang lebih luas dengan sifat yang dapat disetel, serta mengintegrasikan teknik pencitraan pelengkap seperti mikroskopi resolusi super untuk meningkatkan resolusi dan memperluas rentang ukuran yang dapat dideteksi. Kemajuan ini akan membantu meningkatkan akurasi dan fleksibilitas metode, yang pada akhirnya memungkinkan pemahaman yang lebih komprehensif tentang struktur mikro hidrogel dalam aplikasi biomedis.

3 Kesimpulan
Pekerjaan kami menunjukkan bahwa berbagai teknik untuk menggambarkan porositas menangkap fitur struktural yang berbeda dalam hidrogel PEG. Dengan menggabungkan hasil dari pembengkakan keseimbangan, pencitraan krio-SEM, dan uji pelacakan partikel, kami mengkarakterisasi arsitektur 3D dari jaringan pori multiskala dalam hidrogel PEG. Khususnya, krio-SEM dan uji pelacakan partikel memberikan informasi yang konsisten tentang keberadaan mikropori dalam hidrogel ini. Mikropori ini sebagian besar tidak terpengaruh oleh variasi berat molekul polimer yang, bagaimanapun, secara efektif menyetel nanopori (jaring). Kami menyimpulkan bahwa mikropori kemungkinan terbentuk oleh cacat selama polimerisasi. Selain itu, dengan memperluas analisis pelacakan partikel melalui algoritma convex hull, kami menyajikan metrik yang sebelumnya tidak dapat diakses —seperti volume pori, luas permukaan, dan kebulatan— yang ditangkap dalam keadaan asli hidrogel. Menjelaskan geometri pori bermanfaat untuk memahami bagaimana hidrogel berinteraksi dengan sel, biomolekul, dan agen terapeutik dan dapat menjadi kunci dalam merekayasa hidrogel untuk aplikasi biomedis tertentu. Lebih jauh, perbandingan antara pori SEM 2D yang sebenarnya dan pori 2D yang disimulasikan dari model geometri 3D mengungkapkan bahwa pencitraan 2D (cryo-SEM) cenderung meremehkan diameter pori yang sebenarnya. Meskipun demikian, gambar SEM tetap memberikan gambaran akurat pori 2D dalam hidrogel PEG. Secara keseluruhan, temuan ini menyoroti pentingnya mengintegrasikan beberapa pendekatan untuk mengkarakterisasi porositas hidrogel PEG secara komprehensif.

4 Bagian Eksperimen
Bahan
Mikrosfer yang dimodifikasi karboksilat FluoSpheres dengan ukuran diameter 0,5, 1, dan 2 µm (λ ex/em = 505/515 nm, pemasok: Invitrogen) digunakan sebagai partikel fluoresen untuk uji pelacakan partikel. Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS, pemasok: Gibco) digunakan sebagai buffer di seluruh percobaan. Sumur mikro dibuat menggunakan kit elastomer silikon SYLGARD 184 (pemasok: Dow Chemicals) dan agarosa (pemasok: Sigma–Aldrich). Komponen untuk hidrogel adalah maleimida polietilen glikol (PEG) 10 kDa 4-lengan (F38 dan F119, pemasok: Inventia Life Sciences) dan pengikat silang bistiol (F177 dan F178, pemasok: Inventia Life Sciences). Semua reagen diperoleh dari vendor komersial dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut.

Perhitungan Ukuran Mesh
Ukuran mesh dihitung menggunakan persamaan Flory–Rehner menurut literatur sebelumnya. [ 44 , 45 ] Rasio pembengkakan dihitung untuk gel yang rileks ( Q mr ) dan gel yang membengkak ( Q ms ) dengan menyiapkan 200 mL setiap gel yang ditimbang, dibiarkan membengkak selama 24 jam, dan kemudian ditimbang lagi. Gel yang rileks mengacu pada gel dalam keadaan awalnya segera setelah ikatan silang, sedangkan gel yang membengkak mengacu pada gel yang telah menyerap pelarut dan telah mencapai keseimbangan pembengkakan. Sampel kemudian dikeringkan dalam keadaan beku-kering dan ditimbang lagi. Berat basah dan berat kering setiap sampel diaplikasikan pada Persamaan ( 1 ):

Rasio pembengkakan volumetrik ( Q v ) menggambarkan peningkatan volume relatif terhadap volume kering jaringan polimer dan dapat diperoleh dari rasio pembengkakan massa ( Q m ). Q v kemudian dihitung menggunakan Persamaan ( 2 ):

dimana densitas polimer ( r p ) untuk PEG diambil sebesar 1,125 g cm −3 . Densitas pelarut ( r s ) diambil sebesar 1,011 g cm −3 untuk PBS. Fraksi volume polimer yang direlaksasi ( υ 2r ) dan fraksi volume polimer kesetimbangan ( υ 2s ) dihitung menggunakan Persamaan ( 3 ):

Persamaan Flory–Rehner (Persamaan 4 ) kemudian diterapkan untuk menghitung berat molekul antara ikatan silang ( M c ) dimana M c adalah berat molekul rata-rata polimer sebelum ikatan silang,mathematical equationadalah volume spesifik polimer (diambil sebagai kebalikan dari densitas), V 1 adalah volume molar pelarut (18 mL mol −1 untuk air), dan X 1 adalah interaksi polimer-pelarut (0,426 untuk PEG [ 46 ] ):

Terakhir, ukuran mesh (ξ) dihitung menggunakan Persamaan ( 5 ), di mana M r adalah berat molekul unit berulang, l adalah panjang ikatan sepanjang tulang punggung polimer (0,15 nm untuk ikatan C─C), dan C n adalah rasio karakteristik Flory (4 untuk PEG [ 46 ] ):

Pencitraan Mikroskop Elektron Pemindaian
Struktur morfologi hidrogel PEG divisualisasikan menggunakan mikroskop elektron pemindaian (SEM) JEOL JSM-6490LV seperti yang dijelaskan sebelumnya. [ 28 ] Secara singkat, hidrogel diinkubasi dalam DPBS selama 24 jam. Tempat sampel diisi dengan hidrogel dengan ≈0,5 mm hidrogel menonjol dari alasnya. Kemudian, direndam dalam nitrogen cair selama 40–45 detik, menyebabkan hidrogel membeku dengan cepat dalam bentuk terhidrasinya dan hidrogel yang menonjol itu retak untuk memperlihatkan penampang melintangnya, memperlihatkan struktur hidrogel internal untuk pencitraan. Sampel yang retak segera ditempatkan di dalam ruang SEM, divakum, dan divisualisasikan dalam waktu 5–10 menit untuk meminimalkan sublimasi air beku dalam hidrogel. Mikrograf SEM dikumpulkan dari sinyal elektron sekunder pada 15 kV. Diameter pori hidrogel dari mikrograf diukur menggunakan ImageJ. Gambar tersebut dikonvolusikan dengan kernel konvolusi 5 × 5 untuk menyorot serat dari latar belakang. Pori-pori dengan luas kurang dari 10 µm 2 dikecualikan dalam kumpulan data setelah pemeriksaan visual pori-pori terkecil yang terdeteksi.

Uji Pelacakan Partikel Tunggal dalam Sumur Mikro
Cetakan polidimetilsiloksan (PDMS) diproduksi dengan pencetakan replika yang memadukan PDMS dan pengikat silang pada rasio 10:1 dan pengawetan campuran yang telah didegaskan dalam cetakan induk SU-8 pada suhu 60 °C selama minimal 2 jam. Cetakan SU-8 secara khusus didesain untuk percobaan menggunakan perangkat lunak CAD dan direalisasikan dengan proses litografi lunak. Desainnya terdiri dari bentuk melingkar dengan diameter yang berbeda ( x , y , z mikron) dan kedalaman 45 µm. Setelah polimerisasi PDMS, PDMS dikupas dan digunakan sebagai cetakan kedua untuk membuat sumur mikro dengan diameter yang bervariasi. Setengah gram agarosa ditambahkan ke 10 mL DPBS untuk memperoleh larutan agarosa 5%. Untuk melarutkan agarosa sepenuhnya dalam DPBS, campuran tersebut dipanaskan dalam oven gelombang mikro selama 10–15 detik. Larutan kental panas yang dihasilkan dipindahkan dan disimpan di atas pelat panas pada suhu 80 °C untuk menjaga larutan tetap hangat dan menghindari pembentukan gel prematur. Larutan agarosa panas (300–500 µL) dituangkan ke atas cetakan PDMS. Cawan petri 35 mm kemudian segera diletakkan di atas cetakan PDMS yang ditutupi dengan agarosa panas. Agarosa panas yang ditekan dalam pengaturan didinginkan hingga suhu ruangan selama 5 menit. Kemudian, cetakan PDMS dengan hati-hati dilepaskan dari cawan petri. Struktur yang dihasilkan pada cawan petri berfungsi sebagai sumur mikro dengan dimensi yang diketahui. Setelah 24 jam, partikel fluoresen 1 µm yang diencerkan dengan DPBS (1:1000) ditambahkan ke dalam sumur mikro ini dan difusi partikel diamati dengan Zeiss CellDiscoverer 7 900 menggunakan lensa objektif udara Plan-Apochromat 20×/0,7 (panjang gelombang eksitasi = 470 nm, panjang gelombang emisi = 510–540 nm) dengan ukuran piksel 0,46 µm. Gambar dikumpulkan setiap 5 detik.

Uji Pelacakan Partikel Tunggal dalam Hidrogel PEG
Partikel fluoresen dicampur dengan pengikat silang (rasio volume 1:1000). Dalam pelat 96 sumur, PEG maleimide 4 lengan (5 µL) ditambahkan dengan hati-hati ke atas pengikat silang peptida bistiol yang dicampur dengan partikel fluoresen (5 µL). Hidrogel dibiarkan terbentuk selama 5 menit dan DPBS (200 µL) ditambahkan untuk merendam hidrogel. Hidrogel yang dihasilkan dengan partikel tertanam diinkubasi selama 24 jam hingga pembengkakan selesai. Setelah itu, difusi partikel diamati dengan Zeiss CellDiscoverer 7 900 menggunakan objektif udara Plan-Apochromat 20×/0,7 (panjang gelombang eksitasi = 470 nm, panjang gelombang emisi = 510–540 nm) dengan ukuran piksel 0,46 µm. Tumpukan gambar 3D (kedalaman total: 20 µm) dikumpulkan setiap 5 detik dengan ukuran langkah z 1 µm.

Data dan Analisis Statistik Pelacakan Partikel
Pelacakan partikel dilakukan menggunakan Imaris 9.5.1 (Bitplane). Algoritma pelacakan yang digunakan adalah gerak Brown dengan jarak celah maksimum 20 µm dan ukuran celah maksimum 1 titik waktu. Untuk manik-manik yang dilacak, perpindahan kuadrat rata-rata (MSD) dihitung dari koordinat posisi dari waktu ke waktu. [ 47 ] MSD pada waktu t mengacu pada kuadrat rata-rata perpindahan yang ditempuh oleh manik-manik relatif terhadap titik awalnya pada waktu 0, dinormalisasi ke jumlah manik-manik (Persamaan 6 ):

dimana N adalah jumlah manik, x , y , dan z adalah koordinat posisi manik ke -i pada waktu 0 atau waktu t . Dari kurva MSD, nilai MSD yang sesuai dengan plateau digunakan untuk menghitung panjang difusi seperti yang ditunjukkan pada Persamaan ( 7 ):

Ketergantungan waktu jeda 3D dari kurva MSD [ 18 ] dijelaskan oleh Persamaan ( 8 ):

di mana D merujuk pada koefisien difusi efektif dan n merujuk pada eksponen difusi.
Koefisien difusi dapat dihitung menggunakan persamaan Stokes–Einstein seperti yang ditunjukkan pada Persamaan ( 9 ):

di mana D merujuk pada koefisien difusi, k b merujuk pada konstanta Boltzmann (1,38 × 10 −23  J·K −1 ), T merujuk pada suhu dalam Kelvin, η merujuk pada viskositas medium tempat pelacak berdifusi, dan r merujuk pada jari-jari partikel fluoresensi (pelacak).
Koordinat posisi dan MSD partikel yang terdeteksi dari waktu ke waktu dianalisis dalam buku catatan Jupyter (Python 3.11.5 dengan pustaka berikut: pandas 2.0.3, SciPy 1.11.1, statannot 0.2.3, Matplotlib 3.7.2, Seaborn 0.12.2). Pustaka Pandas digunakan untuk menangani dan melakukan operasi pada koordinat posisi. Pustaka SciPy digunakan untuk menghitung informasi geometri. Pustaka statannot digunakan untuk menentukan signifikansi statistik antar kelompok. Pustaka Matplotlib dan Seaborn digunakan untuk memvisualisasikan data. Algoritma convex hull diekspor dari pustaka Python SciPy. [ 35 ] Kemudian, diterapkan pada koordinat posisi yang dikelompokkan menurut Track ID. Track ID adalah pengidentifikasi unik suatu partikel. Volume, luas permukaan, dan titik sudut convex hull yang dihasilkan dikumpulkan. Dari pengukuran ini, diameter, dan kebulatan dihitung. Diameter lambung cembung didasarkan pada jarak terpanjang antara titik sudut di lambung cembung dan dihitung menggunakan Persamaan ( 10 ).

di mana x, y, z adalah koordinat posisi partikel tertentu; i dan j merujuk pada waktu ke – i dan ke -j saat koordinat diamati. Kebulatan dihitung menggunakan Persamaan ( 11 ).

Kode yang dibuat khusus untuk mengekstrak diameter, luas permukaan, dan volume dari data difusi menggunakan algoritma convex hull tersedia di https://github.com/ktolen/geometric-models . Kode ini dirancang untuk pengguna dari semua tingkat keterampilan, termasuk mereka yang memiliki sedikit atau tidak memiliki pengalaman pemrograman.

Simulasi Data Pori SEM 2D dari Pori Empiris 3D
Pori-pori 3D empiris yang dihasilkan dari algoritma convex hull dipilih secara acak menggunakan kode yang dibuat khusus di mana total volume pori-pori untuk setiap sampel gel (0,7 dan 1,5 kPa) sama dengan atau sedikit kurang dari 300.000 µm 3 untuk menormalkan volume sampel. Pori-pori 3D yang dipilih secara acak ini diubah menjadi bentuk 2D dengan menghilangkan koordinat z dari setiap titik sudut pori 3D, yang secara efektif meratakannya ke bidang xy . Bentuk 2D ini berfungsi sebagai pori-pori SEM yang disimulasikan. Kemudian, jarak antara setiap titik sudut dalam pori SEM yang disimulasikan dihitung. Untuk setiap pori yang disimulasikan, jarak terpanjang dipilih untuk mewakili diameter pori SEM. Perbedaan resolusi gambar antara gambar krio dan gambar fluoresensi dinormalisasi dengan menentukan diameter terkecil dalam gambar krio-EM dan menyaring diameter yang lebih kecil dari diameter terkecil dalam gambar krio dari data yang disimulasikan.

Untuk membuat representasi abstrak dari pori-pori yang disimulasikan ini, centroid untuk setiap pori dihitung menggunakan Persamaan ( 12 ) dan 13. Persamaan ini digunakan untuk menghitung centroid dari poligon tertutup.

di mana C x dan C y merujuk pada koordinat centroid; x dan y merujuk pada koordinat titik sudut. A merujuk pada area pori, n merujuk pada jumlah titik sudut, dan i merujuk pada titik sudut ke -i . Urutan titik sudut untuk perhitungan harus dilakukan dalam urutan berlawanan arah jarum jam dengan elemen pertama dan terakhir memiliki koordinat yang sama.

Analisis Statistik
Semua data numerik dan analisis statistik dilakukan di Jupyter Notebook menggunakan Python (versi 3.11.5). Pemrosesan data dilakukan dengan Pandas (versi 2.0.3) dan SciPy (versi 1.11.1), yang juga digunakan untuk menilai kenormalan melalui uji D’Agostino-Pearson. Perbandingan statistik dilakukan menggunakan pustaka Statannot (versi 0.2.3), menerapkan uji T tak berpasangan atau uji Mann–Whitney U dengan koreksi Bonferroni. Perbedaan statistik ditentukan berdasarkan nilai- p , di mana * menunjukkan 0,01 < nilai p ≤ 0,05, dan ns menunjukkan tidak signifikan. Semua pengukuran dilakukan dengan setidaknya tiga kali replikasi. Visualisasi data dilakukan menggunakan Matplotlib (versi 3.7.2) dan Seaborn (versi 0.12.2).