Enkapsulasi Vesikel Ekstraseluler Kecil ke dalam Cangkang Jaringan Logam-Fenolik yang Dapat Dibongkar Secara Selektif

Abstrak
Vesikel ekstraseluler kecil (sEV) adalah partikel turunan sel yang digunakan untuk komunikasi antarsel dalam organisme hidup yang telah menarik minat besar dari para peneliti untuk penggunaannya sebagai pembawa obat dan agen diagnostik. Namun, isolasi dan penyimpanan sEV menyebabkan masalah termasuk gangguan membran lipid, denaturasi protein, dan degradasi asam nukleat. Di sini, strategi fungsionalisasi permukaan dilaporkan untuk membungkus sEV tunggal ke dalam cangkang pelindung yang dapat dibongkar secara selektif yang terdiri dari jaringan logam-fenolik (MPN) yang dimodifikasi pasca-dengan poli(etilen glikol) (PEG). Cangkang MPN yang dapat dibongkar dapat dengan cepat disimpan pada sEV dalam satu langkah dan dimodifikasi pasca-dengan PEG. Lapisan ini meningkatkan stabilitas koloid sEV dan melindunginya dari kondisi penyimpanan yang keras, sementara sifat cangkang MPN yang non-kovalen dan dapat dibongkar secara selektif memungkinkan pemulihan setelah penyimpanan tanpa mengorbankan integritas dan fungsionalitas permukaannya. Telah dibuktikan bahwa berbagai pemicu, seperti penyesuaian pH, kelasi kompetitif, dan reaksi redoks, dapat digunakan untuk membongkar cangkang MPN, sehingga menawarkan strategi yang dapat diadopsi secara luas tergantung pada aplikasi target. Pendekatan ini berpotensi mengatasi tantangan konvensional yang terkait dengan pemrosesan dan penyimpanan sEV dan dapat berkontribusi untuk mengurangi persyaratan rantai dingin dan biaya transportasi terapi dan diagnostik berbasis sEV di masa mendatang.

1 Pendahuluan
Vesikel ekstraseluler kecil (sEV), yang umumnya dikenal sebagai eksosom, adalah vesikel berskala nano dengan ukuran rata-rata 30–150 nm yang memiliki protein transmembran, dan protein sitosol serta asam nukleat yang tertutup. [ 1 , 2 ] sEV dilepaskan secara alami dari berbagai sel untuk mengirimkan muatan seluler ke sel yang berdekatan atau jauh sebagai sarana komunikasi seluler yang terlibat dalam berbagai proses fisiologis dan patologis. [ 3 , 4 ] Dibandingkan dengan liposom sintetis, asal endogen, karakteristik permukaan yang menguntungkan, dan peran dalam komunikasi biologis memberi sEV potensi tambahan untuk digunakan dalam berbagai aplikasi biomedis, seperti mendiagnosis dan mengobati penyakit. [ 4 , 5 ]

Namun, potensi penuh sEV dalam aplikasi klinis belum terwujud, sebagian karena tantangan kritis yang terkait dengan isolasi, pemurnian, dan penyimpanannya. [ 6 ] Pandemi COVID-19 telah membuktikan pentingnya rantai dingin yang efektif untuk penyimpanan dan pengiriman vaksin, terutama teknik kriopreservasi untuk vaksin berbasis mRNA. [ 7 ] Demikian pula, penyimpanan sEV biasanya memerlukan kondisi suhu rendah, antara −80 hingga 4 °C, tergantung pada komposisi dan sumber sEV. Oleh karena itu, sEV pasti akan mengalami siklus beku-cair selama transportasi rantai dingin dan penggunaan klinis. [ 6 ] Studi terbaru tentang sEV telah menyoroti tantangan pengawetan dan penyimpanan, termasuk agregasi sEV dan integritas membran yang terganggu, yang keduanya memengaruhi struktur dan isinya. [ 6 , 8 ] Oleh karena itu, pengawetan dan penyimpanan sEV yang efektif memainkan peran penting dalam menentukan ruang lingkup penggunaan klinisnya di masa mendatang.

Krioprotektan digunakan untuk melindungi sEV dari kerusakan akibat pembekuan. Meskipun dimetil sulfoksida (DMSO) efektif mencegah pembentukan kristal es, utilitas terapeutiknya dibatasi oleh sitotoksisitas dan gangguan membran. [ 9 ] Krioprotektan berbasis gula, seperti trehalosa, menstabilkan lapisan ganda lipid dengan memodulasi tekanan osmotik dan efektif mencegah agregasi dan kerusakan kriogenik. [ 10 ] Namun, Gorgens et al. melaporkan pemulihan sEV yang berkurang dari larutan trehalosa. [ 11 ] Strategi enkapsulasi berbasis polimer menggunakan hidrogel memberikan perlindungan dengan menanamkan sEV dalam matriks 3D. [ 12 , 13 ] Metode ini mempertahankan aktivitas biologis sEV dan memungkinkan pelepasan terkendali melalui sifat fisik yang dapat disesuaikan, seperti kekuatan mekanis, laju degradasi, dan porositas matriks. [ 12 ] Meskipun demikian, sistem hidrogel saat ini bergantung pada enkapsulasi multi-sEV, di mana gugusan sEV tertanam dalam jaringan polimer, dan enkapsulasi tersebut bersifat ireversibel. [ 13 ] Metode enkapsulasi massal ini tidak hanya menghambat ketersediaan permukaan tetapi juga menimbulkan ketidakstabilan akibat pembengkakan hidrogel atau degradasi enzimatik. [ 12 ]

Rekayasa permukaan sEV memungkinkan kontrol atas fungsi yang diinginkan, seperti penargetan spesifik sel, [ 14 ] penghindaran dari sistem imun, [ 15 ] dan pelabelan dan pelacakan. [ 16 ] Modifikasi permukaan dengan poli(etilen glikol) (PEG) sangat menjanjikan dan digunakan secara luas untuk farmasi, seperti vaksin berbasis mRNA, [ 17 ] karena sifatnya yang rendah fouling dan kemampuan yang dilaporkan untuk membatasi rekristalisasi es selama proses pembekuan, sehingga bertindak sebagai krioprotektan yang efektif dengan mencegah kerusakan struktural. [ 18 ] Beberapa penelitian terbaru telah melaporkan PEGylation permukaan sEV untuk meningkatkan waktu sirkulasi mereka [ 19 ] dan meningkatkan penargetan sel mereka. [ 20 ] Namun, karena strategi PEGylation permukaan yang digunakan dalam penelitian sebelumnya bersifat kovalen dan ireversibel, kekhawatiran tentang imunogenisitas yang diinduksi PEG, berkurangnya fungsi protein permukaan sEV, dan berkurangnya interaksi dengan permukaan sel target tidak dapat dihindari. [ 21 ]

Jaringan logam-fenolik (MPN) adalah rakitan supramolekul yang terdiri dari ion logam, yang berkoordinasi secara non-kovalen dengan ligan fenolik, dan pengendapannya sebagai pelapis sederhana, cepat, dan digunakan secara luas untuk berbagai platform multifungsi. [ 22 , 23 ] Ion besi (Fe 3+ ) umumnya digunakan sebagai logam karena interaksinya yang kuat dengan polifenol dan toksisitasnya yang rendah. Asam tanat (TA), polifenol alami yang kaya akan gugus katekol dan galoil, dapat membentuk banyak interaksi dengan protein [ 24 ] dan lipid [ 25 ] melalui ikatan hidrogen, interaksi elektrostatik penumpukan π–π, dan koordinasi logam. [ 24 ] Sifat-sifat ini memungkinkan TA untuk mengikat permukaan dan berkoordinasi dengan Fe 3+ secara bersamaan, yang memungkinkan MPN untuk membungkus permukaan sEV. Kami sebelumnya telah menunjukkan bahwa pelapis MPN dapat diendapkan pada berbagai permukaan, seperti alga hijau, [ 26 ] rambut, [ 27 ] dan tekstil, [ 28 ] sementara yang lain telah melaporkan pelapisan sEV dengan MPN menggunakan perangkat mikrofluida. [ 29 ] Pelapis MPN juga telah terbukti melindungi sel dan sEV terhadap stresor mematikan seperti radiasi UV, spesies oksigen reaktif, dan suhu tinggi, di mana MPN dapat didegradasi secara selektif untuk memungkinkan pemulihan fungsi biologis. [ 29 − 32 ] Selain itu, TA berfungsi sebagai pengikat silang, yang memungkinkan fungsionalisasi dengan polimer, termasuk PEG, melalui reaksi dengan berbagai nukleofil seperti tiol, amina, dan gugus amida melalui reaksi basa Schiff dan adisi Michael. [ 33 ] Namun, kesenjangan signifikan dalam penelitian ini adalah penerapan MPN untuk memfasilitasi PEGylation permukaan sEV melalui reaksi sekunder. Teknik ini belum pernah diterapkan sebelumnya pada sEV dan menawarkan metode untuk meningkatkan fungsionalitas dan stabilitas nanopartikel yang berasal dari sel.

Di sini, kami meningkatkan stabilitas sEV dengan cangkang MPN PEGylated yang dapat dibongkar secara selektif dengan pemicu yang relevan secara biologis dan ringan ( Gambar 1 ). Pertama, lapisan pelapis MPN dibentuk pada permukaan sEV individu melalui perakitan satu langkah kompleks TA-Fe III , diikuti oleh PEGylation permukaan MPN melalui reaksi penambahan Michael antara TA dan PEG-thiol. [ 33 ] Khususnya, cangkang dapat dibongkar secara selektif dari permukaan sEV dalam kondisi ringan menggunakan kelasi, reduksi ion logam, atau oksidasi katekol dan galol. Misalnya, etilendiamintetraasetat (EDTA) mengkelat Fe 3+ untuk membentuk kompleks yang larut, [ 34 ] asam askorbat (AA) mereduksi Fe 3+ menjadi Fe 2+ , [ 35 , 36 ] dan hidrogen peroksida (H 2 O 2 ) mengoksidasi dan menghidrolisis TA, [ 36 ] semuanya mengakibatkan pembongkaran lapisan MPN, yang pada gilirannya menyebabkan penghilangan lapisan PEG. Yang penting, teknik enkapsulasi ini sangat meningkatkan stabilitas penyimpanan sEV sambil mempertahankan integritas strukturalnya dan menegakkan bioaktivitasnya bahkan dalam kondisi penyimpanan yang keras. Pendekatan yang mudah, cepat, dan berbiaya rendah ini mengatasi tantangan stabilitas utama sEV dan dapat berkontribusi untuk mengurangi persyaratan rantai dingin dan biaya transportasi terapi dan diagnostik berbasis sEV di masa mendatang.

Gambar 1
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Ilustrasi skema enkapsulasi sEV dalam lapisan MPN dan PEGilasi permukaan berikutnya untuk melindungi sEV selama penyimpanan, diikuti oleh pembongkaran lapisan MPN yang dimodifikasi untuk menghasilkan sEV fungsional.

2 Hasil dan Pembahasan
sEV diisolasi dari supernatan kultur sel menggunakan kolom kromatografi pengecualian ukuran seperti yang dijelaskan di bagian eksperimen. Untuk mengonfirmasi keberhasilan isolasi dan enkapsulasi sEV, distribusi ukuran sEV polos, sEV berlapis MPN (sEV@MPN), dan sEV terPEG@MPN (sEV@MPN@PEG) diukur menggunakan hamburan cahaya dinamis (DLS), yang disajikan pada Gambar 2a . Secara khusus, distribusi ukuran tertimbang intensitas mengungkapkan bahwa sEV polos menunjukkan diameter hidrodinamik rata-rata ≈71 ± 10 nm, yang konsisten dengan ukuran sEV khas yang dilaporkan dalam literatur. [ 4 ] Setelah pelapisan MPN, diameter rata-rata meningkat menjadi 94 ± 6 nm, yang menunjukkan modifikasi permukaan yang berhasil dan ketebalan lapisan ≈10 nm. Selanjutnya, PEGylation sekunder dilakukan pada sEVs@MPN menggunakan thiol-PEG (PEG-SH, 2 kDa) melalui penambahan thiol-Michael, [ 26 ] dan diameter rata-rata meningkat menjadi 136 ± 9 nm, yang menunjukkan penjangkaran rantai PEG yang efektif ke permukaan MPN. Khususnya, distribusi DLS yang tertimbang intensitas dan jumlah (Gambar 2a ; Gambar S1 , Informasi Pendukung) tetap monomodal, yang menunjukkan populasi ukuran seragam tanpa agregasi yang terdeteksi. Langkah-langkah fungsionalisasi permukaan juga dipantau oleh perubahan potensi zeta (Gambar 2b ), di mana terlihat bahwa potensi zeta rata-rata menurun dari −18,2 ± 5,0 menjadi −30,3 ± 3,4 mV setelah pelapisan MPN karena gugus galloyl bermuatan negatif di TA. Karena rantai PEG dapat melindungi muatan permukaan bawaan MPN, [ 37 ] potensi zeta kemudian bergeser kembali ke arah netral setelah PEGilasi (−12,4 ± 3,1 mV), yang mengonfirmasi keberhasilan PEGilasi permukaan.

Gambar 2
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Sifat fisikokimia sEV polos dan sEV terbungkus. a) Distribusi ukuran dan b) potensi zeta sEV polos, sEV@MPN dan sEV@MPN@PEG. c) Gambar kriogenik TEM sEV polos (i), sEV@MPN (ii), dan sEV@MPN@PEG (iii). Gambar TEM sEV polos (iv), sEV@MPN (v), dan sEV@MPN@PEG (vi). d) Spektrum FTIR sEV dan sEV terbungkus.
Lebih jauh lagi, morfologi dan ukuran sEV polos dan sEV berkapsul diamati dengan mikroskop elektron transmisi (TEM) dan mikroskop elektron transmisi kriogenik (cryo-TEM) (Gambar 2c ). Gambar cryo-TEM menunjukkan bahwa sEV polos berbentuk bulat dengan diameter rata-rata berkisar 50–100 nm, dan gambar TEM dari sEV tunggal menunjukkan bentuk piringan, yang disebabkan oleh sedikit penyusutan yang terjadi selama pengeringan. Permukaan sEVs@MPN tampak lebih kasar dibandingkan dengan sEV polos, dan lapisan sangat tipis yang mengelilingi permukaan sEV menandakan lapisan MPN. Setelah PEGilasi, lapisan PEG dari sEVs@MPN@PEG tampak dan menyerupai selubung yang menutupi permukaan sEV.

Spektroskopi Fourier-transform infrared (ATR-FTIR) refleksi total yang dilemahkan dilakukan untuk mengkarakterisasi komposisi molekuler dan atribut struktural sEV sebelum dan setelah enkapsulasi (Gambar 2d ). Secara khusus, spektrum FTIR sEV polos menunjukkan pita lebar yang berpusat pada ≈3100–3500 cm −1 , yang disebabkan oleh vibrasi peregangan N─H dan O─H yang konsisten dengan pita amida A protein. [ 38 , 39 ] Puncak pada 2850 dan 2931 cm −1 ditetapkan sebagai vibrasi peregangan C─H, yang secara khusus berasal dari gugus CH 2 dan CH 3 lipid. Puncak pada 1732 cm −1 dikaitkan dengan vibrasi peregangan gugus karbonil ester yang terdapat dalam lipid. [ 38 , 40 ] Tiga daerah spektral berbeda pada 1651, 1547, dan 1237 cm −1 berasal dari protein: amida I (peregangan C═O), amida II (pembelokan N─H dan peregangan C─N), dan amida III (pembelokan bidang N─H yang digabungkan dengan peregangan C─N dan C─H), masing-masing. [ 39 ] Pita pada 1045 cm −1 dikaitkan dengan peregangan fosfodiester dalam fosfolipid, dan vibrasi peregangan ester C─O─C dalam karbohidrat dan asam nukleat. [ 40 , 41 ] Setelah enkapsulasi oleh MPN, tanda tangan kimia intrinsik sEV sebagian besar tetap tidak berubah. Namun, intensitas puncak yang ditingkatkan diamati pada daerah tertentu, seperti pada 3400 cm −1 (gugus hidroksi), 1650 cm −1 (gugus ester), dan 1039 cm −1 (gugus karbonil), yang sesuai dengan gugus hidroksi, ester, dan karbonil fenolik dari TA dalam lapisan pelapis MPN. Selain itu, puncak yang berbeda diamati pada 1333, 900, dan 752 cm −1 setelah pelapisan MPN, yang dapat dikaitkan dengan getaran tekukan C─O aromatik dan guntingan cincin benzena trisubstitusi (Gambar S2a , Informasi Pendukung), konsisten dengan apa yang sebelumnya dilaporkan untuk kompleks Fe/TA. [ 42 ] Setelah PEGilasi, puncak yang ditingkatkan pada 2880 cm −1 diamati, yang mewakili getaran peregangan CH 2 karakteristik PEG (Gambar S2b , Informasi Pendukung). Puncak baru muncul pada 1346 dan 1191 cm −1 yang sesuai dengan gugus karbonil dan eter dari PEG, [ 43 , 44 ] yang mengkonfirmasi keberhasilan PEGilasi sEVs@MPN.

PEG dengan berat molekul (BM) yang berbeda digunakan pada langkah sekunder untuk menemukan kondisi PEGilasi yang optimum. Secara khusus, PEG 2, 6, dan 10 kDa (PEG 2K, PEG 6K, PEG 10K) digunakan dan ketebalan cangkang meningkat dengan meningkatnya BM seperti yang terlihat pada TEM ( Gambar 3a ). Demikian pula, hasil DLS menunjukkan bahwa diameter hidrodinamik meningkat dengan meningkatnya BM (Gambar 3b ). Selain itu, kerapatan lapisan PEG dengan berbagai BM dinilai menggunakan keseimbangan kristal kuarsa (QCM), di mana kami mengamati bahwa peningkatan BM PEG mengakibatkan penurunan kerapatan massa (Gambar 3c ). Kepadatan pencangkokan rantai PEG kemudian dihitung dari kerapatan massa (lihat Gambar S3 , Informasi Pendukung), dan hasilnya mengungkapkan tren penurunan yang konsisten dalam kerapatan pencangkokan dengan meningkatnya BM (Gambar 3d ). Tren terbalik ini kemungkinan besar terjadi karena halangan sterik yang melekat pada rantai PEG yang lebih panjang, yang menghambat efisiensi pelapisannya. Selain itu, kerapatan cangkok PEG 2K adalah yang tertinggi, mencapai saturasi pada sekitar 0,7 rantai nm −2 , sebanding dengan kerapatan cangkok tinggi yang terlihat pada fosfolipid terkonjugasi biotin-PEG yang dilaporkan oleh Takai et al. [ 45 ] Karena kerapatan cangkoknya yang tinggi, PEG 2K digunakan untuk penelitian selanjutnya.

Gambar 3
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
sEVs@MPN@PEG dibuat menggunakan PEG dengan MW yang berbeda. a) Gambar TEM dari sEVs yang difungsionalkan dengan PEG MW yang berbeda: (i) PEG 2K; (ii) PEG 6K; (iii) PEG 10K. b) Distribusi ukuran sEVs@MPN@PEG dengan MW PEG yang berbeda. c) Kepadatan massa lapisan pelapis PEG yang dibuat menggunakan MW PEG yang berbeda. d) Kepadatan pencangkokan rantai PEG menggunakan MW PEG yang berbeda.
Berikutnya, stabilitas penyimpanan sEV yang dienkapsulasi dinilai secara sistematis menggunakan beberapa siklus beku-cair (F/T) yang umumnya mampu memecah membran lipid. [ 46 ] sEV polos sebelum menjalani siklus F/T menunjukkan homogenitas yang tinggi, dengan indeks polidispersitas (PDI) sebesar 0,22, seperti yang terlihat oleh DLS ( Gambar 4a ; Tabel S1 , Informasi Pendukung). Untuk sEV polos, distribusi ukuran yang dibobot intensitas mengungkapkan serpihan kecil (≈10 nm) dan agregat besar (≈5000 nm) setelah 5 siklus F/T (PDI = 0,61) dan 10 siklus F/T (PDI = 0,4). Sebaliknya, sEV yang dienkapsulasi menunjukkan peningkatan stabilitas koloid, dengan distribusi ukuran yang konsisten dan monodispersi, bahkan setelah 10 siklus F/T (PDI = 0,21) (Gambar 4b ; Tabel S1 , Informasi Pendukung), mencapai efektivitas yang sebanding dalam mencegah agregasi dan fusi sEV dengan yang sebelumnya dilaporkan untuk trehalosa setelah 4 siklus F/T. [ 10 ] sEVs@MPN@PEG10K stabil setelah 5 siklus F/T (PDI = 0,35) tetapi mengalami ketidakstabilan struktural setelah 10 siklus F/T (PDI = 0,61), dengan munculnya serpihan kecil dan agregat besar (Gambar S4 dan Tabel S2 , Informasi Pendukung). Ini menunjukkan bahwa kepadatan cangkang yang lebih rendah, kemungkinan karena rantai PEG yang lebih panjang, melemahkan stabilisasi sterik. Penelitian sebelumnya melaporkan bahwa formulasi berbasis lipid fungsionalisasi PEG2K mencapai kepadatan ikatan silang yang lebih tinggi melalui interaksi van der Waals yang optimal antara rantai yang lebih pendek dan lipid, menghasilkan stabilitas yang lebih besar daripada MW lipid PEGylated lainnya. [ 47 ] Morfologi sEV polos dan sEV berkapsul dengan dan tanpa siklus F/T (w/o) diamati dengan TEM, dan sEV polos menunjukkan gangguan membran dan agregasi yang jelas setelah siklus F/T (Gambar 4c ). Sebaliknya, sEV@MPN@PEG mempertahankan integritas strukturalnya setelah menjalani jumlah siklus F/T yang sama (Gambar 4d ).

Gambar 4
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
Stabilitas penyimpanan sEV yang dienkapsulasi. a,b) Distribusi ukuran sEV polos dan sEV@MPN@PEG2K setelah 0, 5, dan 10 siklus F/T. c,d) Gambar TEM sEV polos dan sEV@MPN@PEG2K setelah berbagai siklus F/T. e,f) Spektrum FTIR sEV polos dan sEV@MPN@PEG2K setelah berbagai siklus F/T. g) Tingkat mRNA relatif yang diprofilkan oleh RT-qPCR: analisis komparatif lima gen dalam sEV dan sEV yang dienkapsulasi sebelum dan setelah 5 siklus F/T. Batang galat menunjukkan galat standar rata-rata (SEM) berdasarkan n = 5 replikasi. Analisis statistik dilakukan menggunakan ANOVA dua arah, dengan tingkat signifikansi ditunjukkan sebagai berikut: *** p < 0,001, ** p < 0,01, * p < 0,05, dan ns (tidak signifikan) untuk p ≥ 0,05.
Konformasi protein dalam sEV tanpa siklus F/T dinilai menggunakan spektroskopi ATR-FTIR, karena tekanan mekanis dari pembentukan kristal es, akan menyebabkan protein tidak terlipat atau beragregasi dan hilangnya aktivitas biologis. [ 48 ] Gangguan struktur sekunder dan tersier ini mengubah pola absorbansi ikatan amida dalam protein, [ 49 , 50 ] dan spektrum FTIR secara khusus mengungkapkan pergeseran bilangan gelombang sEV polos dari 1651 ke 1588 cm −1 setelah 5 dan 10 siklus F/T (Gambar 4e ). Pergeseran ini terjadi terutama pada pita amida I (1600–1700 cm −1 ), yang sebagian besar terkait dengan vibrasi peregangan C═O dan sangat sensitif terhadap perubahan struktur sekunder protein. [ 49 ] Selain itu, pita amida II, yang terletak pada 1547 cm −1 , dan muncul dari pembengkokan N─H dan peregangan C─N, menunjukkan transisi dari puncak yang tajam menjadi puncak yang melebar. Pergeseran spektral dan pelebaran ini merupakan indikasi perubahan konformasi pada protein, seperti yang diakibatkan oleh denaturasi. [ 50 ] Sebaliknya, sEVs@MPN@PEG menunjukkan spektrum FTIR yang tidak berubah meskipun menjalani siklus F/T (Gambar 4f ). Hasil ini menunjukkan bahwa lapisan pelapis dapat secara efektif mempertahankan integritas protein sEVs selama siklus F/T.

Selain itu, reaksi berantai polimerase transkripsi balik kuantitatif (RT-qPCR) digunakan untuk menganalisis RNA pembawa (mRNA) dari lima gen: gliseraldehid-3-fosfat dehidrogenase (GAPDH), tetraspanin CD63, CD81, CD9, dan molekul adhesi sel epitel (EpCAM), dalam sEV polos dan berlapis (Gambar 4g ). Dengan menggunakan tingkat mRNA relatif dari sEV polos yang tidak diobati sebagai garis dasar, diamati bahwa sEV yang tidak diobati@MPN@PEG mempertahankan tingkat mRNA relatif yang sama dengan sEV polos yang tidak diobati, yang menunjukkan bahwa proses fungsionalisasi tidak menyebabkan kebocoran atau kerusakan pada mRNA. Sementara tingkat mRNA relatif dalam sEV polos menurun setelah 5 siklus F/T, mereka dipertahankan dalam sEV@MPN@PEG menjalani 5 siklus F/T, kemungkinan karena sEV polos secara struktural rentan selama siklus F/T dan mRNA yang dienkapsulasi dapat lolos ke lingkungan sekitar dan terdegradasi. [ 51 ] Sebaliknya, sEV dengan nanoshell MPN PEGylated melindungi mRNA yang dienkapsulasi bahkan setelah beberapa siklus F/T. Sebaliknya, Klinke II et al. melaporkan bahwa meskipun DMSO mempertahankan ukuran dan morfologi sEV selama penyimpanan suhu rendah dan pencairan, ia gagal melindungi RNA sEV. [ 52 ] Konsisten dengan hipotesis kami, sEV@MPN@PEG secara efektif mempertahankan ekspresi mRNA setelah siklus F/T berulang, menyoroti kemampuan perlindungan shell MPN@PEG terhadap degradasi RNA. Hal ini mungkin karena sifat mekanik membran lipid bilayer ditingkatkan secara signifikan oleh lapisan MPN, [ 53 ] yang memungkinkan integritas struktural sEVs@MPN@PEG dipertahankan selama siklus F/T. Yang penting, enkapsulasi ini sendiri tidak menyebabkan kebocoran atau kerusakan mRNA yang terdeteksi, seperti yang ditunjukkan oleh tingkat mRNA yang sebanding sebelum dan sesudah perawatan.

Trehalosa adalah krioprotektan non-permeasi yang banyak digunakan untuk sEV. [ 6 , 10 ] Trehalosa membentuk jaringan ikatan hidrogen di sekitar biomolekul, menstabilkannya dan mencegah pembentukan kristal es dengan mengganggu struktur tetrahedral air. [ 7 , 54 ] Namun, viskositasnya yang tinggi, kelarutan terbatas, dan mobilitas molekuler yang rendah membuatnya sulit dihilangkan sebelum penggunaan sEV. [ 54 ] Sebaliknya, cangkang MPN@PEG tidak hanya melindungi sEV selama siklus F/T tetapi juga dapat dibongkar secara selektif dari permukaan sEV karena sifat kompleks MPN yang dapat dibongkar. Misalnya, MPN dapat dibongkar oleh rangsangan eksternal tertentu, seperti pH, [ 31 , 55 ] kelator kompetitif, [ 34 , 56 ] dan agen redoks. [ 35 , 36 ] Untuk membongkar cangkang MPN@PEG, kami memilih suatu khelator (EDTA), suatu agen pereduksi (AA), dan suatu agen pengoksidasi (H 2 O 2 ) dan mempelajari pembongkaran pada pH yang berbeda ( Gambar 5a ). EDTA, suatu khelator logam dengan afinitas yang lebih kuat terhadap logam daripada TA, membongkar MPN dengan membentuk kompleks EDTA-Fe III yang larut . [ 34 , 56 ] AA, suatu reduktor biokompatibel, mereduksi Fe 3+ menjadi Fe 2+ dalam kompleks TA-Fe III dalam kondisi fisiologis, [ 35 ] yang mengarah pada pembongkaran MPN yang cepat. H 2 O 2 adalah oksidan alami yang diproduksi selama metabolisme sel dan dapat bereaksi dengan Fe 3+ /Fe 2+ dalam reaksi Fenton untuk menghasilkan radikal hidroksil (HO•), dan dapat mengoksidasi dan menghidrolisis TA, [ 36 ] dengan demikian mendegradasi kompleks MPN. Pembongkaran cepat lapisan pelapis diamati pada pH 4,0 untuk ketiga reagen, yang menyebabkan degradasi hampir lengkap dalam waktu 5 jam. Di antara ini, EDTA memiliki laju pembongkaran tertinggi, menyelesaikan proses dalam 2 jam. Pada pH 5,0, laju pembongkaran umumnya terhambat, namun, H 2 O 2 masih menghasilkan pembongkaran 90%. Lebih jauh, dalam kondisi fisiologis (pH 7,4), pembongkaran bahkan lebih lambat, meskipun AA dan H 2 O 2menghasilkan pembongkaran di atas 85% setelah ≈10 jam. Laju pembongkaran AA lebih tinggi pada pH 7,4 dibandingkan dengan pH 5 karena pada pH netral natrium askorbat sebagian besar bersifat monoanionik, menunjukkan efek antioksidan yang lebih kuat dan laju reduksi Fe 3+ yang lebih tinggi daripada bentuk terprotonasi pada pH yang lebih rendah (Gambar 5b ).

Gambar 5
Buka di penampil gambar
Presentasi PowerPoint
a) Ilustrasi skema pembongkaran lapisan MPN yang membungkus menggunakan tiga reagen berbeda (EDTA, AA, dan H 2 O 2 ). b) Efisiensi pembongkaran diukur dengan melapisi kepingan QCM dan memaparkan kepingan tersebut pada tiga reagen berbeda pada pH berbeda (4, 5, 7,4). c) Kadar mRNA relatif yang diprofilkan oleh RT-qPCR: analisis komparatif lima gen dalam sEV polos, sEV@MPN@PEG, dan sEV setelah pembongkaran pelapisan. Batang galat menunjukkan SEM dari n = 3 replikasi. d) Analisis western blot ekspresi β-aktin (ACTB) dan CD9 dalam sEV polos, sEV@MPN, sEV@MPN@PEG, dan sEV setelah pembongkaran pelapisan, berturut-turut. e) Percobaan migrasi sel MCF-7 yang diobati dengan PBS (kelompok kontrol), sEV polos, sEV@MPN, sEV@MPN@PEG, atau sEV@MPN@PEG yang dibongkar, setelah digores. Skala batang: 100 µm.
Untuk mengevaluasi integritas struktural sEV setelah pembongkaran cangkang MPN@PEG, kami menganalisis distribusi ukuran dan morfologi mereka menggunakan DLS dan TEM. Hasil DLS mengungkapkan bahwa diameter hidrodinamik tetap monodispersi (Gambar S5 , Informasi Pendukung), yang menunjukkan tidak adanya serpihan kecil dan agregat besar. Secara konsisten, gambar TEM menunjukkan pelepasan lengkap cangkang MPN@PEG sambil mempertahankan bentuk bulat keseluruhan dan integritas struktural sEV (Gambar S6 , Informasi Pendukung). Secara kolektif, hasil ini menunjukkan bahwa proses pembongkaran cangkang MPN-PEG tidak menyebabkan gangguan struktural atau agregasi besar.

RT-qPCR digunakan untuk menganalisis profil mRNA dari sEV polos dan terbungkus sebelum dan setelah pembongkaran cangkang (Gambar 5c ). Dengan menggunakan tingkat mRNA relatif dari sEV polos sebagai dasar, kami menemukan bahwa sEV terbungkus dan yang mengalami pembongkaran menunjukkan tingkat mRNA relatif yang sebanding dengan sEV polos asli. Demikian pula, uji Western blot dilakukan untuk menilai efek pembongkaran lapisan enkapsulasi pada protein sEV (Gambar 5d ). Dengan menggunakan β-aktin (ACTB, protein struktural internal) dan CD9 (penanda permukaan) sebagai protein representatif, kami membandingkan ekspresinya dalam sEV polos dan terbungkus sebelum dan setelah pembongkaran cangkang. ACTB menunjukkan ekspresi yang stabil di semua sampel, yang mengonfirmasi bahwa proses enkapsulasi dan pembongkaran tidak memengaruhi protein bagian dalam sEV. Ekspresi CD9 lebih rendah pada sEV yang dienkapsulasi dibandingkan pada sEV polos, kemungkinan karena efek pelindung dari lapisan enkapsulasi. Namun, setelah pembongkaran, ekspresi CD9 kembali ke tingkat yang sebanding dengan EV polos. Hal ini menunjukkan bahwa pembongkaran lapisan enkapsulasi tidak mengubah profil mRNA dan protein sEV, dan karena itu tidak menghambat bioaktivitasnya.

sEV telah dilaporkan menginduksi migrasi sel, [ 57 ] dan bioaktivitas dari sampel sEV yang berbeda karenanya dievaluasi menggunakan uji penyembuhan luka (Gambar 5e ). Sel yang diobati dengan sEV polos sembuh secara signifikan lebih cepat (80% pemulihan setelah 24 jam) dibandingkan dengan sel dalam kelompok kontrol (33%, Gambar S7 , Informasi Pendukung). Menariknya, sEVs@MPN menunjukkan penyembuhan yang sebanding dengan kontrol (masing-masing 38% vs 33%), sedangkan sEVs@MPN@PEG menunjukkan penyembuhan yang bahkan lebih sedikit (6%), yang menunjukkan bahwa keberadaan PEG pada permukaan sEV dapat merusak fungsi biologis dan menghalangi adhesi ke area yang tergores. Namun, setelah lapisan permukaan dibongkar, tingkat penyembuhan meningkat secara signifikan hingga 56%. Hasil ini menunjukkan bahwa enkapsulasi sEV ke dalam nanoshell membatasi bioaktivitasnya, yang dapat dipulihkan dengan pembongkaran nanoshell secara selektif.

3 Perspektif Masa Depan
Strategi enkapsulasi reversibel ini menggunakan nanoshell MPN PEGylated untuk sEV merupakan proses satu langkah yang mudah dan sangat sesuai dengan aplikasi praktis serta menjanjikan skalabilitas yang signifikan dalam produksi massal di masa mendatang. Di luar aplikasi saat ini, strategi ini dapat menawarkan berbagai cara untuk penelitian dan pengembangan translasi di masa mendatang, terutama dengan mengurangi ketergantungan pada logistik rantai dingin melalui penyimpanan dan pengangkutan terapi pada suhu sekitar, yang sangat bermanfaat di lingkungan perawatan kesehatan terpencil atau terbatas sumber daya.

Perluasan teknologi enkapsulasi ini ke nanopartikel terapeutik dan diagnostik lainnya, seperti nanopartikel lipid, [ 25 ] misel polimer, [ 58 ] dan nanopartikel metalik, [ 59 ] dapat meningkatkan stabilitas dan pengiriman yang ditargetkan. “Nanoarmor” fenolik logam terbukti melindungi bakteri probiotik dari antibiotik, meningkatkan kemanjuran dalam perawatan gastrointestinal. [ 60 ] Penelitian lebih lanjut tentang sEVs@MPN@PEG berkontribusi untuk memperdalam pemahaman kita tentang interaksi biologisnya, karena sEV yang terPEGilasi telah dikaitkan dengan penginduksian antibodi IgM anti-PEG melalui mekanisme yang bergantung pada sel T. [ 61 ]

Meskipun ada kemajuan ini, beberapa tantangan utama masih belum terselesaikan. Pertama, proses enkapsulasi sEV saat ini biasanya terbatas pada eksperimen skala laboratorium. Kedua, MPN hanya mengalami evaluasi toksisitas yang terbatas, terutama berfokus pada toksisitas jangka pendek, dengan penilaian toksisitas jangka panjang yang tidak memadai. Terakhir, pembongkaran MPN yang inheren dalam kondisi asam dapat mempercepat degradasi dan pelepasan ion logam prematur, yang dapat membatasi aplikasi di masa mendatang.

Penelitian di masa mendatang harus memprioritaskan integrasi sEV yang dienkapsulasi dengan ligan penargetan tertentu, seperti antibodi atau peptida, untuk meningkatkan ketepatan pengirimannya ke populasi sel tertentu. Selain itu, penyelidikan sistematis terhadap penyerapan seluler, pengangkutan intraseluler, dan interaksi biologis sEV@MPN, sEV@MPN@PEG, dan sEV setelah pembongkaran cangkang sangat penting untuk menjelaskan perilaku mekanistiknya, yang memfasilitasi pengoptimalannya untuk aplikasi terapeutik dan diagnostik.

4 Kesimpulan
Kami telah mengembangkan metode yang sederhana dan cepat untuk enkapsulasi sEV menjadi nanoshell MPN pelindung yang dapat dimodifikasi lebih lanjut melalui reaksi sekunder dengan PEG. Lapisan MPN@PEG meningkatkan stabilitas penyimpanan sEV dan dapat dibongkar secara selektif menggunakan berbagai pemicu seperti penyesuaian pH, kelasi kompetitif, dan reaksi redoks, yang memungkinkan pemulihan bioaktivitas sEV. Strategi enkapsulasi reversibel ini akan memperluas penerapan sEV dengan mengurangi persyaratan rantai dingin dan biaya transportasi dan karenanya akan memungkinkan terapi dan aplikasi diagnostik berbasis sEV di masa mendatang.

5 Bagian Eksperimen
Bahan
Semua bahan kimia digunakan sebagaimana mestinya. Good’s Buffer 3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) dibeli dari Dojindo Laboratories. Asam tanat, besi (III) klorida heksahidrat (FeCl3.6H2O ) , asam etilendiamintetraasetat (EDTA), asam L -askorbat, garam natrium asam L-askorbat, larutan natrium hidroksida (1 M), hidrogen klorida, dan hidrogen peroksida dibeli dari Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation. Polietilen glikol berujung tiol (PEG-SH) (Mn = 10000) diperoleh dari NOF Corp. PEG-SH (Mn = 2000, 6000) dibeli dari Sigma-Aldrich. Kolom kromatografi eksklusi ukuran 35 nm asli qEV dibeli dari Izon Science. Perangkat sentrifugal Nanosep dibeli dari Pall Corporation. Filter sentrifugal Amicon Ultra dibeli dari Sigma-Aldrich. Filter 0,22 µm dibeli dari Merck Millipore Ltd. Medium esensial minimum (EMEM) dan salin buffer fosfat (PBS) Eagle dibeli dari Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation. Salin buffer fosfat tanpa kalsium dan magnesium (DPBS), penisilin-streptomisin (P/S), dan serum sapi janin (FBS) Dulbecco dibeli dari Thermo Fisher Scientific, Inc. Tabung ultracentrifuge (50 tabung Ultra Clear 14 × 89 mm) dibeli dari Beckman Coulter. Semua primer dibeli dari FASMAC Co., Ltd. ISOGEN dibeli dari NIPPON GENE Co., Ltd. Kit reagen DNase I dan PrimeScript RT rekombinan (waktu nyata sempurna) dibeli dari Takara Bio, Inc. Agencourt RNAClean XP dibeli dari Beckman Coulter, Inc. LightCycler 480 SYBER Green I Master dibeli dari Roche Diagnostics Jepang. EzApply (buffer sampel), EzStandard Prestain nBlue, dan e-PAGEL (E-R1020L) dibeli dari ATTO, Jepang. Tris-Glycine SDS Buffer (TG-SDS) dibeli dari Takara Bio, Inc. Polyoxyethylene (20) Sorbitan Monolaurate dan susu skim dibeli dari Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation. Antibodi Beta Actin (Katalog # ab8227) dibeli dari Abcam. Antibodi CD9 (Katalog # SHI-EXO-M01) dibeli dari Cosmo Bio Co., Ltd. Membran PVDF iBlot Gel Transfer Stacks, Antibodi Sekunder IgG Tikus Kambing, HRP (Katalog # 62–6520), dan Antibodi Sekunder IgG Kelinci Kambing, HRP (Katalog # 62–6120) dibeli dari Invitrogen. Substrat Immobilon Western Chemiluminescent HRP dibeli dari Merck Millipore Corporation.

Proses Isolasi dan Pemurnian
Sel kanker payudara manusia MCF-7 diperoleh dari ATCC. 2 × 106 sel disemai dalam cawan Petri dengan diameter 150 mm dengan EMEM yang mengandung 1% v/v P/S dan 10% FBS dan diinkubasi dalam atmosfer yang dilembabkan yang mengandung 5% CO2 pada suhu 37 °C selama 48 jam. Ketika sel mencapai konfluensi 70–80%, sel dicuci dengan PBS dan diinkubasi dalam media kultur sel bebas serum yang dikondisikan. Setelah 24 jam, supernatan kultur sel dikumpulkan. Serangkaian langkah sentrifugasi dilakukan: pertama pada 2.000 g selama 15 menit pada suhu 4 °C untuk menghilangkan sel-sel mati dan serpihan sel, diikuti oleh sentrifugasi pada 10.000 g selama 1 jam pada suhu 4 °C untuk menghilangkan mikrovesikel besar (MV) dan protein berukuran besar. Supernatan yang telah diolah terlebih dahulu dalam jumlah besar dipekatkan hingga ≈500 µL menggunakan alat sentrifugal (100 kDa). Isolasi dan pemurnian sEV dilakukan menggunakan kolom kromatografi pengecualian ukuran sesuai dengan petunjuk pabrik pembuatnya. [ 62 ]

sEV yang dimurnikan yang digunakan untuk RT-qPCR diisolasi dengan teknik ultracentrifugasi diferensial, berdasarkan protokol yang dijelaskan oleh Théry et al. [ 1 ] Secara singkat, 100 mL supernatan kultur sel yang dikumpulkan disentrifugasi pada 2.000 g selama 15 menit pada suhu 4 °C, dan pada 10.000 g selama 1 jam pada suhu 4 °C. Sampel 100 mL yang dihasilkan kemudian dipekatkan menjadi 10 mL menggunakan perangkat sentrifugal (100 kDa). Sampel 10 mL dipindahkan ke tabung ultracentrifugasi, dan ultracentrifugasi dilakukan pada 28.000 rpm (≈100.000 g ) selama 1,5 jam pada suhu 4 °C. Akhirnya, pelet sEV yang diisolasi disuspensikan kembali dalam 200 µL PBS.

Enkapsulasi sEV
sEV diperkaya dan dipekatkan dengan perangkat sentrifugal Nanosep, dan disuspensikan kembali dalam larutan penyangga DPBS dan dibagi ke dalam volume yang sama untuk enkapsulasi hilir. Untuk pelapisan MPN pada permukaan sEV (sEVs@MPN), larutan asam tanat (TA, 40 mg mL −1 , 23,5 mM) dan FeCl3.6H2O ( Fe3 + , 5 mg mL −1 , 18,5 mM ) disiapkan dengan melarutkannya dalam H2O ultramurni ( MilliQ, Direct-Q UV3 Remote, Merck), diikuti dengan menambahkan secara berurutan 2 µL TA, 2 µL Fe3 + dan 200 µL penyangga MOPS (10 mM, pH 7,4) ke dalam suspensi 196 µL sEV dengan pengocokan selama 10 detik. Setelah pelapisan MPN, sampel disaring menggunakan filter 0,22 µm untuk menghilangkan gugusan MPN dan sEV dan dipindahkan ke perangkat sentrifugal Nanosep (300 kDa MWCO Omega, Pall Corporation), dicuci dengan H 2 O ultramurni tiga kali dengan sentrifugasi (5000 g selama 15 menit) dan siklus resuspensi. sEVs@MPN disuspensikan kembali dalam larutan buffer MOPS (10 mM, pH 7,4). sEVs terPEGilasi (sEVs@MPN@PEG), dengan konsentrasi ≈5 × 10¹¹ partikel mL −1 , diproduksi melalui reaksi adisi thiol-Michael. sEVs@MPN dimasukkan ke dalam larutan PEG-thiol 0,8 mM (PEG-SH, 2 kDa). Konsentrasi optimal PEG-SH ditentukan sebesar 0,8 mM dalam buffer MOPS 10 mM pada pH 7,4, dan campuran tersebut diinkubasi selama 2 jam (Gambar S2 , Informasi Pendukung).