Elastomer Termoplastik Poli(hidroksi-oksazolidon) untuk Alat Kesehatan Kontak Darah yang Lebih Aman, Lebih Ramah Lingkungan, dan Dapat Disesuaikan

Abstrak
Elastomer termoplastik (TPE) jenis poliuretana (PU) memiliki aplikasi yang luas dalam perawatan kesehatan. Akan tetapi, bahan-bahan ini memiliki sejumlah kekurangan. Sintesisnya memerlukan penggunaan isocyanate yang beracun. Hemokompatibilitasnya masih kurang, sehingga mengakibatkan tingginya tingkat komplikasi trombotik pada sebagian besar alat yang bersentuhan dengan darah, yang selanjutnya meningkatkan risiko infeksi. Di sini, kami melaporkan persiapan yang mudah dan dapat ditingkatkan dari TPE poliuretana non-isocyanate (NIPU) yang lebih ramah lingkungan, poli(hidroksi-oksazolidon) (PHOx). Kami menunjukkan bahwa PHOx dapat diproses dengan beberapa teknik manufaktur yang relevan, yaitu pengepresan panas, pencetakan injeksi, pemintalan elektro, dan manufaktur aditif. Uji hemokompatibilitas in vitro dengan darah manusia menunjukkan kinerja yang lebih baik daripada PU kelas medis konvensional. PHOx memicu aktivasi fase kontak koagulasi yang lebih sedikit, penyerapan protein plasma yang lebih sedikit, dan adhesi trombosit yang lebih sedikit daripada PU. Adhesi Staphylococcus epidermidis juga berkurang dalam 2 jam pertama kontak dibandingkan dengan PU. PHOx tidak bersifat hemolitik maupun sitotoksik pada kontak langsung maupun tidak langsung dengan sel endotel atau fibroblas. Selain itu, implantasi subkutan PHOx pada kelinci selama satu dan empat minggu mengonfirmasi biokompatibilitas in vivo dan tidak ada degradasi material. Oleh karena itu, PHOx merupakan biomaterial yang sangat berharga dan alternatif bebas isosianat yang potensial untuk TPE berbasis PU konvensional guna memproduksi perangkat kontak darah yang dapat disesuaikan dengan hemokompatibilitas yang lebih baik.

1 Pendahuluan
Elastomer termoplastik (TPE) sangat diinginkan untuk beberapa aplikasi medis dan perawatan kesehatan karena fleksibilitas/elastisitas dan kemampuan prosesnya. [ 1 – 3 ] TPE, khususnya poliuretan termoplastik (TPU), digunakan dalam bentuk jahitan, pelapis, konektor, kateter, kabel, tabung, atau perancah. [ 4 – 6 ] Penggunaannya untuk pembuatan perangkat medis implan (MD) cukup menantang karena bahannya harus mematuhi kriteria keselamatan dan kinerja yang ketat dengan dampak kritis pada hasil pasien. Kepatuhan bahan sangat menantang untuk perangkat yang bersentuhan dengan sirkulasi darah, [ 7 – 9 ] seperti stent vaskular, cangkok vaskular, kateter intravaskular, kabel alat pacu jantung, atau katup jantung buatan. Setelah kontak dengan darah, bahan asing memang memicu respons trombotik cepat yang diprakarsai oleh penyerapan protein plasma, adhesi dan aktivasi trombosit, dan aktivasi fase kontak dari kaskade koagulasi. [ 7 , 10 ] Permukaan MD juga dapat dikolonisasi oleh bakteri atau jamur selama implantasi, yang dapat menyebabkan infeksi aliran darah yang parah dengan hasil yang buruk bagi pasien. [ 11 – 14 ] Upaya untuk merawat pasien dengan agen antitrombotik atau antibiotik jarang efektif, dan pengangkatan MD sering kali menjadi satu-satunya solusi ketika komplikasi terjadi. [ 7 ] Oleh karena itu, ketika menyangkut implantasi MD, pencegahan lebih disukai. Pendekatan pencegahan tersebut mencakup penggunaan bahan hemokompatibel [ 15 ] yang idealnya tidak mudah mengalami kolonisasi bakteri. Khususnya, karena trombosis dan infeksi merupakan proses yang saling terkait, peningkatan hemokompatibilitas bahan secara otomatis akan mengurangi komplikasi infeksi. [ 16 , 17 ] Sampai saat ini, hemokompatibilitas perangkat kontak darah berbahan TPE belum mencukupi. Meskipun antikoagulasi sistemik (misalnya, heparin), pemberian regimen antitrombotik, dan/atau modifikasi TPE (misalnya, fungsionalisasi permukaan atau pelapisan), [ 18 – 20 ] tingkat komplikasi trombotik dan infeksi terkait MD masih tinggi. [ 21 ] Oleh karena itu, ada kebutuhan mendesak untuk bahan yang lebih baik di bidang perangkat kontak darah yang dapat ditanamkan. Misalnya, kateter intravaskular termasuk di antara MD yang paling banyak ditanamkan sehingga dibutuhkan. [22 , 23 ]Biasanya terbuat dari TPE berbasis poliuretan (PU), meskipun TPE lain (misalnya, kopolimer blok TPE berbasis nilon, poliester, atau polistirena) atau polimer kelas medis non-TPE (misalnya, karet silikon, politetrafluoroetilen) juga dapat ditemukan.[ 24 ]Jaring TPE berbasis PU berserat, biasanya diproduksi dengan elektrospinning, memiliki aplikasi sebagai perancah atau cangkok pembuluh darah yang direkayasa jaringan.[ 25 , 26 ]

Meskipun digunakan secara luas, PU disintesis dari prekursor isocyanate yang sangat beracun. Poliuretan non-isocyanate (NIPU) adalah alternatif yang lebih ramah lingkungan untuk PU yang menggantikan reagen isocyanate dengan yang kurang beracun, seperti CO 2 – dan/atau prekursor yang bersumber dari hayati. [ 27 – 32 ] NIPU pertama yang dikembangkan untuk aplikasi biomedis telah menunjukkan hasil yang menjanjikan, termasuk dalam rekayasa jaringan, [ 26 , 33 – 37 ] pengiriman obat, [ 38 ] aktivitas antibakteri, [ 39 – 41 ] atau aplikasi kontak darah. [ 42 – 45 ] Di antara berbagai rute sintesis NIPU yang dilaporkan, poliadisi karbonat siklik berbasis CO 2 yang mengandung gugus eksovinilena dengan diamina baru-baru ini mendapatkan minat khusus karena kemudahan implementasi dalam kondisi ringan dan bebas katalis. [ 46 – 51 ] Selain itu, prosedur ini menyediakan NIPU, yang dalam hal ini disebut poli(hidroksi-oksazolidon) (PHOx), yang memiliki ikatan uretan siklik (oksazolidon) yang kaku dan stabil yang sangat penting untuk meningkatkan sifat mekanik dan stabilitas hidrolitik produk dibandingkan dengan elastomer NIPU atau PU konvensional yang memiliki ikatan uretan linier.

Dalam karya ini ( Skema 1 ), kami mengembangkan TPE pertama yang dapat diproses secara termal dari jenis poli(hidroksi-oksazolidon) (PHOx) yang mengganti segmen polidimetilsiloksan (PDMS) lunak dengan gugus hidroksi-oksazolidon kaku. TPE baru ini diperoleh dengan mengkopolimerkan PDMS yang difungsionalisasikan ujungnya oleh gugus amina dengan bis(alkilidena karbonat siklik) berbasis CO2 dalam kondisi bebas katalis, yang belum pernah dicapai sebelumnya. Sifat fisiko-kimia material ini dievaluasi dan menunjukkan potensinya yang besar sebagai alternatif TPE berbasis PU untuk pembuatan MD yang kontak dengan darah. Hemokompatibilitas PHOx yang dinilai dengan darah manusia lebih unggul daripada TPE PU tingkat medis yang digunakan sebagai referensi, karena PHOx meningkatkan lebih sedikit protein plasma dan adhesi trombosit, sambil memicu lebih sedikit adhesi bakteri dalam 2 jam pertama. PHOx tidak bersifat sitotoksik terhadap sel endotel vena umbilikalis manusia (HUVEC) dan fibroblas kulup manusia (HFF-1) setelah kontak langsung dan tidak langsung dengan polimer hingga 7 hari. Lebih jauh, biokompatibilitas PHOx dikonfirmasi secara in vivo setelah implantasi subkutan pada kelinci hingga 4 minggu. Kami juga menunjukkan bahwa TPE baru ini dapat diproses dengan berbagai teknik manufaktur seperti pengepresan panas, pencetakan injeksi, pemintalan elektro, serta manufaktur aditif berbasis ekstrusi, yang semuanya relevan untuk menyiapkan berbagai perangkat biomaterial, yang membuka banyak perspektif di bidang ini.

Skema 1
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Sintesis elastomer termoplastik poli(hidroksi-oksazolidon) (PHOx) (TPE) dari karbonat siklik berbasis CO 2 (bisαCC) dan diamina berbasis polidimetilsiloksana (PDMS-NH 2 ) (A). Berbagai MD yang dapat diperoleh berkat pemrosesan TPE PHOx yang mudah melalui berbagai teknik (B). Uji biologis in vitro dilakukan dengan cakram PHOx, yaitu penilaian hemokompatibilitas, uji adhesi bakteri, dan biokompatibilitas dengan fibroblas manusia dan sel endotel (C). Implantasi subkutan cakram PHOx in vivo pada kelinci selama periode 1 dan 4 minggu, diikuti oleh analisis histologis jaringan (D).

2 Hasil dan Pembahasan
2.1 Sintesis dan Karakterisasi PHOx
Silikon poli(hidroksi-oksazolidon) tersegmentasi (PHOx) disiapkan melalui poliadisi pertumbuhan bertahap dari diamina berbasis polidimetilsiloksan yang tersedia secara komersial (PDMS-NH 2 , poli(dimetilsiloksan) bis(3-aminopropil) berujung (Mn = 2.500 g mol −1 , cair) dengan monomer bis(siklik karbonat) padat yang mengandung spacer sikloheksil kaku (bisαCC) yang dilarutkan dalam CH 2 Cl 2 (Skema 1A ). Monomer ini diproduksi melalui penggandengan CO 2 yang dikatalisis dengan bis(alkohol propargilik) (1,4-dietinilsikloheksana-1,4-diol) (lihat Informasi Pendukung untuk rinciannya). [ 49 , 50 ] Setelah reaksi selama 24 jam pada 80 °C diikuti oleh penguapan pelarut dan pendinginan hingga suhu ruangan, material elastis (karet) terbentuk. diperoleh. Struktur kimianya pertama kali dianalisis dengan spektroskopi 1 H-NMR (Gambar S1 , Informasi Pendukung) dan FTIR-ATR (Gambar S2 , Informasi Pendukung) yang keduanya mengonfirmasi struktur PHOx. M n nyata sebesar 26.000 g mol −1 ditentukan dengan kromatografi permeasi gel (GPC) (Gambar S3 , Informasi Pendukung) (lihat Informasi Pendukung untuk pembahasan).

Kehadiran gugus hidroksil yang dihasilkan di samping ikatan uretan pada struktur PHOx seharusnya membawa hidrofilisitas pada material yang secara sengaja bersifat hidrofobik berdasarkan segmen PDMS ini. Oleh karena itu, pengukuran penyerapan air kesetimbangan (EWA) dilakukan pada PHOx dan membuktikan dampak terbatas dari gugus -OH ini karena penyerapan air tetap di bawah 6% ( Tabel 1 ). Pembengkakan rendah dalam air tersebut sangat diinginkan dan sesuai untuk biomaterial yang ditujukan untuk implantasi guna menghindari perubahan volume implan/prostesis yang berlebihan setelah implantasi dalam lingkungan terhidrasi, sehingga mengurangi sifat mekanis. Sesuai dengan itu, hidrofobisitas permukaan PHOx juga dikonfirmasi oleh pengukuran sudut kontak pada lembaran PHOx datar, yang menunjukkan nilai tinggi 105° yang mendekati data yang dilaporkan untuk silikon (≈110°) [ 52 , 53 ] (Tabel 1 ).

Tabel 1. Sifat fisiko-kimia dan mekanik PHOx.

Sifat mekanik PHOx ini kemudian diselidiki pada suhu kamar, pertama dalam keadaan kering, dengan uji tarik yang dilakukan dengan peralatan penganalisa mekanik dinamis (DMA) yang beroperasi dalam mode non-osilasi ( Gambar 1 A , kurva tegangan–regangan PHOx). PHOx menunjukkan sifat elastomer dengan Modulus Young (E) sebesar 2,5 MPa, tegangan putus (σ) sebesar 0,5 MPa, dan perpanjangan putus (ε) sebesar 52,6%. Selain itu, percobaan histeresis regangan dilakukan dengan menerapkan beberapa langkah tegangan berturut-turut yang menunjukkan bahwa polimer kembali ke posisi awalnya dan karena itu membuktikan perilaku elastomernya (reversibilitas). Polimer diregangkan hingga 0,35 MPa (70% dari tegangan maksimalnya) sebelum diregangkan hingga 0,00 MPa dan dilonggarkan 3 kali berturut-turut (Gambar S4 , Informasi Pendukung). Tiga siklus ketegangan berturut-turut ini menunjukkan nilai yang sangat rendah dan stabil, yaitu kurang dari 1% histeresis (diperoleh setelah 5 menit langkah isotermal dan yang bahkan sebagian dapat berasal dari kesalahan yang melekat pada mesin/pengalaman). Perilaku elastomer yang sangat menarik ini luar biasa dan diamati untuk pertama kalinya untuk jenis polimer ini, yaitu PHOx linier. Memang, yang terakhir biasanya berupa polimer yang mengalir atau jauh lebih kaku (modulus Young ≈400–800 MPa) [ 49 , 54 ] dan oleh karena itu tidak cocok untuk aplikasi biomedis yang memerlukan bahan lunak. Perilaku elastomer yang menarik ini mungkin muncul dari pemisahan fase antara segmen PDMS yang panjang dan lunak dan segmen hidroksi-oksazolidon yang pendek dan keras (siklik), yang cenderung berasosiasi sendiri kemungkinan besar melalui ikatan hidrogen, yang mengarah ke ikatan silang segmen PDMS, mirip dengan perilaku yang diamati pada PU tersegmentasi. [ 55 – 58 ] Sifat mekanik sampel terhidrasi (setelah perendaman sampel dalam air MilliQ selama 24 jam) kemudian dinilai untuk memeriksa dampak hidrasi pada potensi penggunaan PHOx sebagai implan atau prostesis, yang akan bersentuhan dengan cairan fisiologis setelah ditanamkan. Seperti yang diantisipasi, dampak pada sifat mekanik PHOx diamati, meskipun relatif kecil mengingat sifat hidrofobik segmen PDMS. Memang, nilai E, σ, dan ε menurun menjadi 1,6 MPa, 0,2 MPa, dan 23,9%, masing-masing, sebagai hasil dari efek plastisisasi air yang telah dilaporkan dalam literatur untuk bahan NIPU lainnya. [ 42 , 59 – 62 ] Karakteristik mekanik ini mirip dengan pembuluh darah karena nilai E berada dalam kisaran yang lebih tinggi untuk arteri berdiameter kecil. [ 63 ]Arteri koroner yang sehat, misalnya, dilaporkan memiliki modulus rata-rata 1,5 MPa, meskipun nilai σ dan ε sedikit lebih unggul dibandingkan dengan yang diperoleh untuk PHOx. [ 64 ] Oleh karena itu, sifat mekanis PHOx menarik dalam bidang pembuatan cangkok vaskular diameter kecil, di mana, misalnya, serat elektrospun yang mengandung poliester uretana)-urea (PEUU) dengan nilai E berkisar antara 1,4 hingga 3,9 MPa sering digunakan. [ 63 , 65 ] Aplikasi lain yang mungkin dari PHOx adalah pada pengganti katup jantung karena PHOx menampilkan sifat-sifat yang sering ditemukan pada prostesis katup. Memang, karakteristik mekanis PHOx dekat dengan daun katup asli (E = 2 MPa, σ = 0,4 MPa, ε = 30%). [ 66 , 67 ] Selain itu, PHOx dapat dibayangkan sebagai bahan untuk pembuatan kateter, meskipun kateter intravaskular berbasis PDMS memiliki perilaku mekanis yang sedikit lebih unggul (E > 4 MPa). [ 68 ]

Gambar 1
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Karakterisasi PHOx yang dihasilkan. Contoh kurva tegangan-regangan PHOx dalam keadaan kering dan terhidrasi (uji tarik) (A). Eksperimen sapuan suhu yang menunjukkan penurunan modulus penyimpanan dan kehilangan, serta viskositas kompleks terhadap suhu (B). Viskositas kompleks yang diukur pada suhu yang berbeda (sapuan frekuensi) yang menunjukkan perilaku penipisan geser PHOx (C).
Menariknya, interaksi yang mengarah pada ikatan silang PDMS dan bertanggung jawab atas perilaku elastomer yang diamati bersifat termo-reversibel. Memang, jika kalorimetri pemindaian diferensial (DSC) tidak membuktikan suhu transisi gelas maupun transisi peleburan reversibel dari material dalam rentang suhu -80 °C hingga 180 °C (Gambar S5 , Informasi Pendukung), eksperimen reologi (sapuan suhu, Gambar 1B ), di sisi lain, mengungkapkan perilaku seperti termoplastik dari PHOx. Memang, menerapkan peningkatan suhu dalam rentang 30–150 °C menyebabkan penurunan modulus penyimpanan (G’) dan kehilangan (G”) yang bersilangan pada 77 °C. Pada 30 °C, modulus penyimpanan (1,09 MPa) jelas mendominasi, modulus kehilangan rendah (0,15 MPa), yang merupakan ciri khas perilaku elastis. Nilai-nilai ini mulai menurun drastis sekitar 60 °C untuk mencapai perilaku kental di atas 80 °C. Dengan demikian, viskositas kompleks tinggi sebesar 175.762 Pa.s yang diukur pada suhu 30 °C menurun setelah pemanasan untuk mencapai quasi-plateau di bawah 100 Pa.s di atas 100 °C. Perlu dicatat bahwa dehidrasi gugus hidroksi-oksazolidon dilaporkan terjadi pada suhu berkisar antara 120 hingga 140 °C dalam keadaan padat, [ 49 , 51 ] yang menghasilkan gugus vinilen eksosiklik. Reaksi ini diamati terjadi dengan PHOx di atas 120 °C, sebagaimana dibuktikan oleh puncak pada kurva aliran panas non-reversing dalam termogram DSC termodulasi (Gambar S5 , Informasi Pendukung). Pengamatan ini juga didukung oleh analisis termogravimetri (TGA) (Gambar S6 , Informasi Pendukung) yang menunjukkan sedikit penurunan berat ≈170 °C diikuti oleh stabilitas termal yang tinggi hingga 400 °C (suhu pada penurunan berat 10% (T d,10% ) menjadi 437 °C) (Tabel 1 ).

Akibatnya, pemrosesan TPE PHOx harus dilakukan antara 80 dan 110 °C untuk menghindari modifikasi apa pun pada struktur dan propertinya. Dengan demikian, PHOx sangat cocok untuk metode manufaktur berbasis termal konvensional seperti ekstrusi dan pencetakan injeksi. Perilaku reologi PHOx pada frekuensi yang berbeda juga dianalisis melalui eksperimen sapuan frekuensi yang dilakukan pada suhu yang berbeda (Gambar 1C ). Menariknya, PHOx menunjukkan perilaku penipisan geser bersama dengan nilai viskositas kompleks yang rendah pada frekuensi tinggi (100 Hz), yang menunjukkan kesesuaiannya untuk pencetakan 3D berbasis nosel (lihat Bagian 2.2 ). [ 69 ]

Kami kemudian mengevaluasi stabilitas PHOx in vitro melalui perendaman dalam larutan penyangga fosfat (PBS) selama periode 8 minggu. Inspeksi visual tidak menemukan tanda-tanda retak, atau perubahan morfologi, sama seperti untuk spesimen PU yang digunakan sebagai referensi (Carbothane kelas medis). pH larutan PBS kemudian diukur setiap minggu (Tabel S1 , Informasi Pendukung) dan tidak menunjukkan perubahan signifikan dari waktu ke waktu, secara konsisten mendekati 7,4 untuk kedua polimer. Metode umum lainnya untuk menilai degradasi adalah dengan memantau perubahan berat polimer dari waktu ke waktu. Hasil kami tidak mengungkapkan perubahan signifikan selama periode pengujian 8 minggu (Tabel S2 , Informasi Pendukung). Berat rata-rata untuk sampel PU dan PHOx dipertahankan, menunjukkan bahwa kapasitas penyerapan air dipertahankan dari waktu ke waktu dan polimer stabil. Eksperimen uji tarik juga dilakukan pada sampel yang muncul dalam PBS selama 8 minggu untuk melihat apakah perendaman jangka panjang dalam media berair berdampak pada sifat material. Menariknya, yang terakhir mengungkapkan nilai E = 1,4 ± 0,02 MPa, σ = 0,2 ± 0,001 MPa, dan ε = 24,1 ± 1,3%, yang sangat mendekati nilai yang diperoleh 8 minggu sebelumnya. Dengan demikian, pengukuran ini juga menunjukkan stabilitas PHOx setelah direndam dalam media berair, mungkin karena sifat hidrofobik segmen PDMS yang sebagian besar merupakan bahan tersebut.

2.2 Pengolahan TPE PHOx
2.2.1 Pengepresan Panas dan Pencetakan Injeksi
Dengan mempertimbangkan perilaku termoplastik PHOx yang dibuktikan oleh studi reologi, suhu 80 °C dipilih sebagai suhu (pemrosesan ulang) untuk sampel PHOx dengan menggunakan metode manufaktur berbasis termal tradisional, yaitu pengepresan panas dan pencetakan injeksi, yang memungkinkan produksi film atau lembaran polimer, dan berbagai objek cetakan, masing-masing. Pengepresan panas (80 °C, tekanan 6 metrik ton, 10 menit) menghasilkan film elastomer transparan PHOx setebal 1 mm ( Gambar 2 A ). Polimer kental (dipanaskan pada suhu 80 °C) juga dimasukkan ke dalam cetakan berbentuk katup jantung baja tahan karat yang dipanaskan terlebih dahulu, [ 43 ] yang kemudian didinginkan (selama 2 jam pada suhu 6 °C) untuk menghasilkan prototipe prostesis katup jantung setelah dicetak (Gambar 2B ). Pengujian pemrosesan yang berhasil ini mengonfirmasi (kembali)nya PHOx dengan menggunakan teknik manufaktur industri tradisional untuk memperoleh objek dengan berbagai bentuk dan tidak memerlukan suhu tinggi (di sini, 80–85 °C), sehingga membatasi terjadinya reaksi samping.

Gambar 2
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Berbagai teknik pemrosesan PHOx. Penggunaan pengepresan panas untuk menghasilkan film (A). Pencetakan injeksi dalam cetakan logam untuk menghasilkan prostesis katup jantung (B). Pemintalan elektro pada kolektor aluminium lembaran datar, yang menunjukkan pengendapan serat yang tidak istimewa (C), atau pada kolektor aluminium berpola sarang lebah, yang menunjukkan pengendapan serat yang istimewa (D). Representasi skematis dari proses pemintalan elektro (E). Polimer awal yang digiling yang digunakan untuk pencetakan 3D dengan ekstrusi butiran yang menyatu (F). Representasi skematis dari teknik manufaktur aditif berbasis termal (G). Perancah cetak 3D (5 × 4 cm) (H).
2.2.2 Pemintalan Elektro
Elektrospinning adalah teknik menarik yang digunakan untuk memproduksi serat nonwoven skala mikro hingga nano mulai dari larutan polimer. Serat elektrospun digunakan dalam banyak aplikasi, [ 70 ] dan khususnya di sektor biomedis untuk memproduksi perancah (misalnya, pendekatan rekayasa jaringan) karena tikar serat yang dibuat dengan rasio luas permukaan terhadap volume yang tinggi dan porositas tinggi sangat cocok untuk meningkatkan kultur sel, yang memungkinkan regenerasi jaringan. [ 71 – 73 ] Selama proses ini, tetesan cairan, yang terletak di outlet jarum suntik berisi larutan, dialiri listrik oleh catu daya bertegangan tinggi untuk menghasilkan jet bermuatan, yang meregang dan memanjang sementara pelarut menguap, untuk menghasilkan serat yang diendapkan pada kolektor konduktif (Gambar 2E ). [ 70 , 74 ] Berbagai membran PHOx berserat diproduksi di sini dengan melakukan pemintalan elektro larutan PHOx dalam diklorometana (0,667 g mL −1 ) selama total waktu pemintalan elektro 3 jam pada tiga kolektor aluminium yang berbeda. Yang terakhir adalah lembaran aluminium datar (Gambar 2C ), atau kolektor berpola sarang lebah dengan ukuran yang berbeda (lihat Bagian Eksperimen untuk detailnya dan Gambar 2D ). Gambar SEM dari tikar yang dipintal secara elektro dengan perbesaran yang berbeda ditunjukkan pada Gambar S7 (Informasi Pendukung). Pada kolektor datar, serat diendapkan tanpa orientasi preferensial di seluruh permukaan (Gambar S7A , Informasi Pendukung), sedangkan pada kolektor berbentuk sarang lebah berongga, serat diendapkan secara preferensial di tepinya. Memang, kepadatan serat yang lebih besar dapat dilihat di tepinya daripada di bagian tengah, yang masih mengandung serat yang diendapkan dengan orientasi non-preferensial (Gambar S7B , Informasi Pendukung). Diameter rata-rata serat yang diendapkan adalah ≈2,0–2,8 µm untuk kedua jenis kolektor. Deposisi, bentuk, dan diameter yang seragam menunjukkan keberhasilan pemintalan elektro PHOx dan pemrosesannya menjadi tikar serat yang menarik untuk berbagai aplikasi. [ 70 ]

2.2.3 Percetakan 3D
Pencetakan 3D PHOx ini dengan proses ekstrusi termal kemudian dipertimbangkan. Manufaktur aditif yang memproduksi perangkat sesuai permintaan sangat cocok dalam kerangka pengobatan yang dipersonalisasi dan dengan demikian sangat berkembang di bidang ini. Printer ekstrusi butiran menyatu (FGE) digunakan karena memungkinkan PHOx dicetak di bawah 120 °C, langsung dari pelet/butiran (Gambar 2G ). Printer ini dilengkapi dengan nosel yang dipanaskan pada 110 °C dan dua kipas pendingin untuk mendinginkan polimer yang dicetak dengan cepat dan menghindari perambatan panas. Set alas diatur pada 60 °C untuk meningkatkan daya rekat lapisan cetak pertama pada platform bangunan. Setelah pengoptimalan, parameter yang diatur (lihat Bagian Eksperimen untuk detailnya) memungkinkan pencetakan 3D logo Universitas Liège (5 × 4 cm) yang berhasil (Gambar 2H ). Untuk menghasilkan bentuk yang lebih kompleks dan meningkatkan resolusi komponen cetak di masa mendatang, prosesnya masih harus dioptimalkan lebih lanjut, karena suhu cetak PHOx yang rendah menyebabkan perambatan panas. Memang, seperti yang terlihat pada Gambar 2H dan melalui gambar SEM (Gambar S8A , Informasi Pendukung), lapisan objek cetakan ini mempertahankan ukuran yang diinginkan setelah dicetak dan menempel dengan baik satu sama lain pada sumbu Z, meskipun sedikit under-extrusion terlihat di beberapa daerah terbatas pada sumbu XY (Gambar S8B,C , Informasi Pendukung). Ini mungkin karena ukuran pelet PHOx yang heterogen, yang dapat diatasi dengan mengubah prosedur pembuatan pelet. Keberhasilan manufaktur aditif PHOx menggunakan teknik ini memungkinkan fabrikasi perangkat dan prototipe yang disesuaikan dengan mudah dan cepat. Selain itu, dibandingkan dengan teknik manufaktur tradisional, FGE membutuhkan jumlah material yang rendah, mengurangi limbah material, dan lebih cepat dan hemat biaya. FGE bahkan lebih murah daripada fabrikasi filamen fusi karena biaya ekstruder pelet/granul secara signifikan lebih rendah daripada ekstruder filamen, mengingat produksi pelet yang lebih mudah. ​​[ 75 , 76 ]

2.3 Evaluasi Biologis PHOx
2.3.1 Pengujian Hemokompatibilitas dan Sifat Anti-Fouling In Vitro
Untuk mengkarakterisasi hemokompatibilitas PHOx, cakram dipotong dari film tekan panas dan disterilkan di bawah sinar UV (lampu UV-C kuman, 253,7 nm). Kami pertama-tama melakukan uji hemolisis dengan menginkubasi cakram dengan sel darah merah (RBC) manusia ( Gambar 3A ). Tingkat hemolisis untuk PU (referensi tingkat medis) dan PHOx sama-sama rendah (di bawah ambang batas 2% yang ditunjukkan oleh standar internasional), dengan nilai masing -masing 0,199 ± 0,238% dan 0,261 ± 0,349%. Waktu pembekuan plasma miskin trombosit (PPP) manusia kemudian diukur setelah inkubasi dengan PU dan PHOx (Gambar 3B ). Waktu pembekuan yang tidak diaktifkan sama dengan 241 ± 25 detik untuk PU dan 240 ± 14 detik untuk PHOx, yang tidak berbeda dari nilai yang ditemukan untuk plasma kontrol yang belum bersentuhan dengan polimer (271 ± 33 detik). Aktivitas seperti kalikrein plasma juga diukur (Gambar 3C ), yang mengungkapkan aktivasi yang lebih rendah oleh PHOx (124,8 ± 5,1 U/l) daripada oleh PU ( p = 0,02). Nilai yang ditemukan untuk PHOx tidak berbeda dari aktivitas yang diukur dalam plasma kontrol (119,6 ± 5,1 U/l). Kalikrein plasma memainkan peran penting dalam koagulasi, bertindak sebagai aktivator proteolitik faktor XII, [ 77 ] yang memiliki kepentingan kritis untuk inisiasi pembentukan trombus setelah kontak dengan bahan asing. Aktivitas rendah seperti kallikrein yang diukur setelah inkubasi dengan PHOx menunjukkan bahwa polimer tidak mendukung aktivasi fase kontak dari koagulasi. Sebagai pelengkap dari fase kontak, adhesi trombosit pada permukaan merupakan peristiwa penting lainnya dalam respons trombotik material. Oleh karena itu, kami menilai adhesi trombosit pada permukaan PHOx setelah inkubasi dengan plasma kaya trombosit (PRP) (Gambar 3D ). Trombosit yang melekat diukur dengan mengukur aktivitas laktat dehidrogenase (LDH). Pengujian ini mengungkapkan adhesi trombosit yang lebih rendah pada PHOx dibandingkan pada PU. Aktivitas LDH mendekati garis dasar, oleh karena itu menunjukkan adhesi trombosit yang sangat rendah pada PHOx. Hasil ini dikonfirmasi dengan mengukur nikotinamida adenina dinukleotida (NADH) tereduksi yang dihasilkan pada permukaan material (Gambar 3E ), yang menunjukkan nilai 2,2 ± 0,2 nmol untuk trombosit yang melekat pada PHOx, secara signifikan lebih rendah ( p = 0,001) daripada jumlah yang dihasilkan oleh sampel yang diinkubasi dengan PU (10,8 ± 2,7 nmol). Untuk lebih memahami adhesi trombosit rendah yang diamati pada PHOx, kami mengukur adhesi protein plasma ke kedua polimer, dengan menginkubasi PU dan PHOx dengan PPP, dan mengukur konsentrasi protein pada permukaan (Gambar 3F ). Hasil mengungkapkan konsentrasi protein 1,9 ± 0,8 µg mL −1 untuk sampel PHOx, secara signifikan lebih rendah ( p = 0,022) daripada 3,9 ± 2,1 µg mL −1diperoleh untuk PU. Perilaku menolak protein yang diamati untuk PHOx mungkin menjelaskan, setidaknya sebagian, adhesi trombosit rendah yang diamati dibandingkan dengan PU karena penyerapan protein plasma adalah kejadian awal yang mengarah pada adhesi trombosit ketika bahan asing bersentuhan dengan darah. Secara keseluruhan, data kami menunjukkan trombogenisitas PHOx yang rendah, yang mengungguli PU tingkat medis. Secara historis, polikarbonat, polieter, dan poliester telah banyak digunakan dalam PU tersegmentasi yang ditujukan untuk aplikasi biomedis. [ 78 ] Untuk meningkatkan hemokompatibilitas PU, beberapa teknik telah dikembangkan, seperti modifikasi permukaan yang meningkatkan resistensi terhadap penyerapan protein dan adhesi trombosit, sambil menurunkan rasio hemolisis. PDMS, di sisi lain, telah dilaporkan menunjukkan hemokompatibilitas dan stabilitas hidrolitik/oksidatif yang lebih baik, toksisitas yang lebih rendah, dan resistensi yang lebih tinggi terhadap adhesi protein dan trombosit. [ 79 – 81 ] Fakta bahwa PHOx mengandung segmen PDMS yang lembut mungkin dapat menjelaskan, setidaknya sebagian, hemokompatibilitas yang sangat baik dari NIPU ini.

Gambar 3
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Penilaian hemokompatibilitas dan sifat anti-adhesif in vitro. Laju hemolisis dalam sel darah merah setelah 3 jam kontak langsung dengan cakram PU dan PHOx, dinilai dengan pengukuran absorbansi dalam supernatan. Larutan 1:7 sel darah merah/air suling digunakan sebagai CTL+, sedangkan larutan 1:7 sel darah merah/PBS adalah CTL- (A). Waktu titik akhir pembekuan PPP setelah 2 jam kontak langsung dengan cakram PU dan PHOx. Penutup gelas berlapis kaolin digunakan sebagai CTL+, sedangkan PPP sendiri digunakan sebagai CTL- (B). Pengukuran aktivitas mirip kalikrein plasma dalam PPP setelah 2 jam kontak langsung dengan cakram PU dan PHOx. PPP sendiri digunakan sebagai CTL-, sedangkan PPP yang diinkubasi dengan pathromtin (Siemens) digunakan sebagai CTL+. * p ≤ 0,05, ANOVA satu arah biasa dengan uji perbandingan berganda Dunnett, n = 3 (C). Aktivitas LDH dari trombosit manusia yang melekat setelah 2 jam kontak langsung dengan cakram PU dan PHOx, dinilai dengan uji kolorimetri. CTL+ dan CTL- disediakan dengan kit uji Sigma-Aldrich (D). NADH diproduksi oleh trombosit manusia yang melekat pada cakram PU dan PHOx. CTL+ dan CTL- disediakan dengan kit uji Sigma–Aldrich. ** p ≤ 0,01, ANOVA satu arah biasa dengan uji perbandingan berganda Dunnett, n = 3 (E). Kuantifikasi adhesi protein pada cakram PU dan PHOx setelah 1 jam inkubasi dengan PPP, menggunakan deteksi kolorimetri dengan kit uji protein asam mikro bicinchoninic (BCA). * p ≤ 0,05, uji t tidak berpasangan , n = 6 (F). Pengukuran waktu yang dibutuhkan aktivitas bakteri untuk mencapai puncaknya pada populasi S. epidermidis yang menempel pada cakram PU dan PHOx. ** p ≤ 0,01, uji t tidak berpasangan , n = 4 (G).
Kami kemudian ingin menilai sifat anti-fouling PHOx terhadap bakteri, kriteria penting lainnya saat mengembangkan polimer untuk MD implan. Kami menyelidiki adhesi strain Staphylococcus epidermidis ( S. epidermidis ), bakteri pembentuk biofilm yang sering kali menjadi ancaman bagi manusia (Gambar 3G ). Bakteri diinkubasi dengan polimer selama periode pra-adhesi 2 jam, setelah itu cakram PU/PHOx dibilas dengan lembut untuk menghilangkan bakteri yang tidak melekat dan ditempatkan dalam mikrokalorimeter (calScreener), yang memungkinkan untuk mengikuti aktivitas metabolisme bakteri, yang berbanding lurus dengan jumlah bakteri yang melekat, melalui pengukuran aliran panas waktu nyata. [ 82 , 83 ] Kami menemukan bahwa waktu yang dibutuhkan S. epidermidis untuk mencapai puncak aliran panas secara signifikan lebih lama ( p = 0,005) untuk bakteri yang melekat pada PHOx (541 ± 45 menit), yang menunjukkan jumlah bakteri yang lebih rendah yang ada setelah langkah pra-adhesi 2 jam. Namun demikian, ketika periode pra-adhesi ditingkatkan menjadi 24 jam, efek ini tidak lagi ada (Gambar S9 , Informasi Pendukung), dan tidak ditemukan perbedaan signifikan secara statistik antara PU dan PHOx. Ini menunjukkan bahwa efek anti-adhesif PHOx ada pada menit-menit pertama setelah terpapar bakteri, tetapi memudar setelah 24 jam. Meskipun efek jangka panjang akan lebih disukai, efek jangka pendek yang kami amati masih relevan, karena mencerminkan jam-jam pertama kontak antara permukaan dan bakteri, yang menentukan dalam konteks implantasi. Percobaan ini juga dilakukan dengan bakteri Gram. Dalam kasus ini, Pseudomonas aeruginosa digunakan, karena diketahui menyebabkan infeksi terkait kateter pada pasien. Sekali lagi, tidak ada perbedaan yang diamati antara PU dan PHOx (Gambar S10 , Informasi Pendukung), baik di antara bakteri yang melekat maupun yang planktonik. Oleh karena itu, kami menyimpulkan bahwa, setelah periode tantangan 24 jam, PHOx bekerja serupa dengan PU tingkat medis dalam hal kolonisasi bakteri Gram + dan Gram –. Penghambatan adhesi bakteri pada PHOx tidak dapat diantisipasi berdasarkan literatur, yang sebagian besar menunjukkan bahwa permukaan hidrofilik dan/atau superhidrofobik menghambat adhesi bakteri. PHOx kami bersifat hidrofobik (sudut kontak 105°). Data dari periode tantangan yang lebih lama untuk uji adhesi bakteri konsisten dengan fakta bahwa PHOx tidak secara ampuh menghambat adhesi bakteri dalam jangka panjang. Hanya adhesi awal yang menurun dibandingkan dengan PU medis.

2.3.2 Biokompatibilitas In Vitro: Interaksi dengan Fibroblas dan Sel Endotel
Seperti yang direkomendasikan dalam ISO 10 993 untuk material baru yang dimaksudkan untuk bersentuhan dengan tubuh manusia, kami melakukan uji biokompatibilitas in vitro setelah paparan langsung dan tidak langsung sel endotel dan fibroblas terhadap PHOx. Pengukuran aktivitas metabolik dilakukan setelah 24 jam kontak tidak langsung ( Gambar 4 A, B ), 24 jam kontak langsung ( Gambar 4 C, D ) dan 7 hari kontak langsung ( Gambar 4 E, F ), setelah itu morfologi sel juga diamati ( Gambar 4 G, H ). Data menunjukkan bahwa dalam semua pengujian (terlepas dari jenis dan durasi kontak) aktivitas metabolik HUVEC dan HFF-1 yang terpapar PHOx selalu lebih tinggi dari 70% (ambang batas yang ditetapkan oleh standar internasional). Selain itu, setelah 24 jam kontak langsung dengan PHOx, sel HFF-1 menunjukkan aktivitas metabolik yang lebih tinggi daripada yang ditemukan untuk PU (92 ± 3% untuk PU dan 100 ± 4% untuk PHOx, p = 0,03). Morfologi sel diverifikasi setelah 7 hari kontak langsung dengan polimer untuk HUVEC dan HFF-1 (pewarnaan inti dan F-aktin). HUVEC menunjukkan bentuk seperti batu bulat yang sehat, sementara HFF-1 menunjukkan morfologi seperti spindel normal, setelah kontak dengan PU dan PHOx. Kumpulan penilaian ini memastikan bahwa PHOx yang mengandung gugus hidroksil dan gugus oksazolidon, yaitu ikatan uretan siklik dalam strukturnya, berbeda dengan PU konvensional yang hanya mengandung gugus uretan linier, bersifat non-sitotoksik, yang menunjukkan biokompatibilitas yang hebat secara in vitro.

Gambar 4
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Penilaian biokompatibilitas in vitro. Aktivitas metabolisme HUVEC (A) dan HFF-1 (B) setelah 24 jam kontak tidak langsung dengan PU dan PHOx. Aktivitas metabolisme HUVEC (C) dan HFF-1 (D) setelah 24 jam kontak langsung dengan PU dan PHOx. * p ≤ 0,05, ANOVA satu arah biasa dengan uji perbandingan berganda Tukey, n = 4. Aktivitas metabolisme HUVEC (E) dan HFF-1 (F) setelah 7 hari kontak langsung dengan PU dan PHOx. Sel yang diinkubasi dengan media kultur digunakan sebagai CTL -, sedangkan sel yang diinkubasi dengan larutan Triton (X-100) 0,1% v/v digunakan sebagai CTL +. Morfologi sel HUVEC (G) dan HFF-1 (H) setelah 7 hari kontak langsung dengan PU dan PHOx. Gambar mewakili proyeksi tumpukan z setinggi minimal 50 µm. Skala batang: 200 µm.
2.3.3 Biokompatibilitas In Vivo: Implantasi Subkutan PHOx pada Kelinci
Bahasa Indonesia: Setelah verifikasi biokompatibilitas in vitro, cakram PHOx diuji in vivo dengan implantasi subkutan pada kelinci putih Selandia Baru (NZW) menggunakan Carbothane kelas medis sebagai referensi. Protokol implantasi pertama berlangsung selama 1 minggu ( Gambar 5A ). Tidak ada hewan yang menunjukkan perilaku abnormal dan luka-luka tersebut teratasi dengan cara yang sama untuk kedua polimer. Gambar 5B menunjukkan gambar representatif dari 4 jahitan yang dilakukan pada setiap hewan (satu jahitan per implan) dan sampel yang diambil setelah pelepasan implan. Secara makroskopis, tidak ada perbedaan nyata yang diamati antara cakram PU dan PHOx, dan keduanya mudah dipisahkan dari jaringan di sekitarnya. Semua implan yang diambil utuh dalam hal bentuk dan diameter. Penilaian histopatologi (Gambar 5C ) dilakukan pada potongan jaringan yang diwarnai hematoxylin-eosin (H&E) dan trikrom Masson oleh para ahli yang dibutakan (Gambar 5D ). Penilaian tersebut mencakup infiltrasi jaringan dengan sel imun, yang serupa untuk PU dan PHOx, yang dikaitkan dengan respons peradangan dini normal yang disebabkan oleh implantasi.

Gambar 5
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Penilaian biokompatibilitas in vivo setelah 1 minggu. Skema protokol implantasi subkutan cakram PU dan PHOx pada kelinci selama 1 minggu (A). Gambar representatif kulit segera dan 24 jam setelah pemasangan 4 implan per hewan (kiri) dan pelepasan implan (kanan) (B). Penilaian parameter yang berbeda pada sampel jaringan. ** p ≤ 0,01, ANOVA dengan uji perbandingan berganda Tukey, n = 12 (C). Gambar representatif irisan histologis jaringan di sekitar implan PU dan PHOx yang diwarnai dengan H&E dan trikrom Masson. Skala batang: 200 µm untuk gambaran umum, 50 µm untuk area yang diperbesar (D).
Selain itu, penilaian tersebut mengevaluasi nekrosis, neovaskularisasi, fibrosis, dan infiltrasi lemak. Secara keseluruhan, tidak ada atau hanya sedikit nekrosis yang diamati. Menariknya, PHOx menyebabkan lebih sedikit neovaskularisasi daripada PU ( p = 0,0039). Memang, pembentukan pembuluh darah baru yang berlebihan merupakan penanda yang tidak diinginkan dalam konteks peradangan dan reaksi benda asing yang merugikan.

Kami selanjutnya menyelidiki biokompatibilitas PHOx setelah 4 minggu implantasi ( Gambar 6 A ). Selama tindak lanjut, tidak ada hewan yang mengembangkan reaksi abnormal. Gambar 6B menunjukkan gambar representatif dari 4 jahitan yang dilakukan pada setiap hewan (satu jahitan per implan) dan sampel yang diambil setelah pelepasan implan. Mirip dengan apa yang diamati setelah 1 minggu implantasi, implan mempertahankan karakteristik mekanis dan permukaannya setelah 4 minggu, tanpa tanda-tanda degradasi. Analisis skoring dan histologi (Gambar 6C, D ) menunjukkan tingkat infiltrasi sel imun yang sama untuk kedua polimer. Tidak ada nekrosis yang diamati, dengan skor 0 untuk semua sampel, dan hampir tidak ada infiltrasi lemak yang terlihat. Menariknya, PU memicu fibrosis secara signifikan lebih banyak daripada PHOx ( p <0,0001), yang dicirikan oleh adanya fibroblas yang lebih besar dan endapan kolagen yang lebih padat pada PU, diwarnai merah muda di H&E dan biru/hijau di trikrom Masson (Gambar 6D ). Mengingat fibrosis yang berlebihan dapat mengganggu fungsi MD dan/atau menyebabkan masalah perlekatan jaringan, [ 84 ] pengamatan jaringan fibrotik yang lebih sedikit setelah implantasi PHOx semakin mendukung keunggulan PHOx dibandingkan referensi PU tingkat medis. Yang penting, tidak ada NIPU yang dijelaskan sebelumnya dalam literatur yang pernah diuji secara in vivo selama 4 minggu.

Gambar 6
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Penilaian biokompatibilitas in vivo setelah 4 minggu. Skema protokol implantasi subkutan cakram PU dan PHOx pada kelinci selama 4 minggu (A). Gambar representatif kulit 24 dan 48 jam setelah pemasangan 4 implan per hewan (kiri) dan pelepasan implan (kanan) (B). Penilaian parameter yang berbeda pada sampel jaringan. **** p ≤ 0,001, ANOVA dengan uji perbandingan berganda Tukey, n = 12 (C). Gambar representatif irisan histologis jaringan di sekitar implan PU dan PHOx yang diwarnai dengan H&E dan trikrom Masson. Skala batang: 500 atau 200 µm untuk gambaran umum, 50 µm untuk area yang diperbesar (D).

3 Kesimpulan
Kami melaporkan TPE poliuretan bebas isocyanate baru yang mengandung ikatan uretan siklik (oxazolidones), mudah disiapkan, dan yang menunjukkan sifat termo-mekanis yang luar biasa mirip dengan beberapa jaringan kardiovaskular asli. Perilaku TPE yang menarik membuatnya ideal untuk fabrikasi perangkat berbagai bentuk yang mudah melalui serangkaian teknik manufaktur industri, seperti pengepresan panas, pencetakan injeksi, pemintalan elektro, dan bahkan pencetakan 3D. Kemungkinan pemrosesan PHOx yang hemat biaya dan serbaguna ini membuka jalan bagi produksi perangkat yang dapat disesuaikan dengan pasien. PHOx ini menunjukkan hemo- dan biokompatibilitas yang luar biasa yang mengungguli TPE PU kelas medis, bahan yang paling umum digunakan untuk memproduksi MD yang dapat bersentuhan dengan darah seperti kateter intravaskular. Uji in vitro menunjukkan bahwa adhesi protein plasma, adhesi trombosit, dan aktivitas kallikrein berkurang secara signifikan pada permukaan PHOx. Selain itu, uji adhesi menggunakan S. epidermidis menunjukkan lebih sedikit adhesi bakteri pada PHOx dibandingkan pada PU kelas medis setelah tantangan 2 jam. Setelah 4 minggu implantasi in vivo, PHOx menunjukkan biokompatibilitas yang luar biasa, tanpa degradasi apa pun, dan bekas luka fibrotik di sekitar implan PHOx bahkan berkurang dibandingkan dengan PU. Oleh karena itu, polimer ini merupakan material baru yang dapat diproses secara termal yang menjanjikan untuk pembuatan atau pelapisan MD yang bersentuhan dengan darah (yang akhirnya dapat disesuaikan dengan pasien) dengan kinerja perangkat dan hasil pasien yang lebih baik.

4 Bagian Eksperimen
Sintesis Material–Sintesis Bis(α-alkilidena Karbonat Siklik)
Protokol terperinci untuk sintesis bis(α-alkilidena siklik karbonat) dapat ditemukan dalam berkas Informasi Pendukung .

Sintesis Poli(Hidroksi-Oksazolidon)
Poli(hidroksi-oksazolidon) (PHOx) disintesis dengan mengadaptasi protokol Habets. [ 50 ] Bis(α-alkilidena karbonat siklik) (bisαCC, sintesis dalam Informasi Pendukung , 2,016 g, 8 mmol, 1 ekuivalen) ditimbang dalam labu bundar 100 mL dan diaduk secara magnetis dengan 8 mL CH 2 Cl 2 kering . Polidimetilsiloksan bis(3-aminopropil) berujung (PDMS-NH 2 , rata-rata Mn = 2.500 g mol −1 , 20 g, 8 mmol, 1 ekuivalen) kemudian ditambahkan dalam atmosfer nitrogen dengan spuit dan larutan diaduk pada suhu 80 °C selama 24 jam. PHOx kemudian dianalisis dengan 1 H-NMR (Gambar S1 , Informasi Pendukung), FTIR (Gambar S2 , Informasi Pendukung), dan GPC (Gambar S3 , Informasi Pendukung). GPC dalam kloroform menunjukkan massa molar rata-rata jumlah nyata sebesar 26.000 g mol −1 . PHOx kemudian juga dikarakterisasi dengan DSC (Gambar S5 , Informasi Pendukung), TGA (Gambar S6 , Informasi Pendukung), sudut kontak, penyerapan air kesetimbangan, DMA (Gambar 1A ; Gambar S4 , Informasi Pendukung), dan eksperimen reologi (Gambar 1B,C ). Polimer disimpan dalam desikator untuk menghindari penyerapan kelembapan sebelum pengukuran apa pun.

PHOx: 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ (ppm) = 3,13 (d, 2H), 2,24 – 1,43 (m, 10H), 1,36 (d, J = 8,2 Hz, 3H), 0,46 (d, 2H), 0,07 (d, 108H).

Pengolahan Material–Prosedur Hot Pressing
Film PHOx diproduksi dengan menempatkan potongan-potongan PHOx yang digiling dalam cetakan setebal 1 mm (pelat logam yang dilubangi di bagian tengahnya dan ditekan di antara 2 film Teflon dan 2 pelat logam penuh), menggunakan alat pres 4122CE.4010C00 (Carver) selama 10 menit pada suhu 80 °C dan dengan tekanan 6 metrik ton.

Prosedur untuk Injection Molding
PHOx dimasukkan langsung setelah sintesisnya (saat masih panas) ke dalam cetakan berbentuk katup jantung baja tahan karat yang dikembangkan oleh tim kami [ 43 ] yang sebelumnya dilapisi dengan agen pelepas polivinil alkohol (PVA) untuk memudahkan pelepasan cetakan. Cetakan berisi PHOx dipanaskan selama 2 jam pada suhu 85 °C dalam oven dan kemudian didinginkan dalam lemari es selama 2 jam pada suhu 6 °C sebelum dibuka untuk melepaskan objek. Katup jantung PHOx kemudian dicuci perlahan dengan air untuk menghilangkan agen pelepas PVA.

Prosedur untuk Electrospinning
Membran PHOx berserat diproduksi dengan melakukan pemintalan elektro larutan PHOx dalam diklorometana (0,667 g mL −1 ) yang ditempatkan dalam spuit 10 mL (diameter internal 13 mm) pada kolektor aluminium (baik lembaran datar atau berpola sarang lebah dengan sisi heksagonal 3 mm dan ketebalan 7 mm atau sisi heksagonal 1,3 mm dan ketebalan 5 mm), menggunakan peralatan pemintalan elektro tegangan tinggi (ND-ES Electrospinning). Tegangan awalnya ditetapkan pada 21 kV dan ditingkatkan sebesar 1 kV setiap jam; laju aliran ditetapkan pada 5 µL min −1 , jarak antara bagian atas jarum dan kolektor ditetapkan pada 17 cm, dan total waktu durasi pemintalan elektro ditetapkan sebagai 3 jam. Tikar elektrospun kemudian dianalisis dengan mikroskop elektron pemindaian (SEM) menggunakan Mikroskop Elektron Pemindaian Resolusi Ultra Tinggi (TESCAN CLARA).

Prosedur untuk Pencetakan 3D
PHOx digiling lalu diekstrusi melalui ekstruder sekrup ganda pada suhu 70 °C dan 30 rpm untuk memperoleh filamen yang homogen. Filamen didiamkan selama 30 menit pada suhu ruangan lalu dipotong menjadi pelet menggunakan alat pelet. Pelet yang dihasilkan disimpan dalam desikator untuk menghindari penyerapan kelembapan. Pelet kemudian diisi dalam Ender 3 NEO yang dilengkapi dengan ekstruder pelet V4 dan nosel berdiameter 0,8 mm. Nosel diatur pada suhu 110 °C dan platform pembuatan yang dipanaskan (set alas) pada suhu 60 °C. Kecepatan cetak 7,5 mm s −1 bersama dengan pengali ekstrusi 1,2 diterapkan. Lapisan 0,2 mm dicetak. Skirt yang terdiri dari 6 garis digunakan untuk mencapai pengendapan filamen yang stabil. Film polipropilena digunakan sebagai substrat karena dilaporkan dapat melekat lebih baik pada polimer hidrofobik. Untuk menghindari panas berlebih, dua kipas pendingin dipasang: satu mendinginkan hopper pelet, dan yang kedua dekat dengan kepala yang dipanaskan. Pengamatan SEM dan pengukuran sampel yang dicetak dilakukan pada mikroskop Hitachi TM3030Plus.

Pengujian Biologis Material
Dalam semua uji biologis, Carbothane PU kelas medis digunakan sebagai bahan referensi. Carbothane PU, serta PHOx yang disintesis, dipotong menjadi cakram dan disterilkan di bawah sinar UV (lampu UV-C kuman, 253,7 nm), dengan memaparkan setiap sisi selama 15 menit.

Pengujian Hemokompatibilitas dan Sifat Anti-Fouling In Vitro
Untuk uji hemokompatibilitas, sampel darah dari donor sehat digunakan. Persetujuan yang diberikan telah diberikan. Penelitian ini disetujui oleh Komite Etik Rumah Sakit Universitas Liège, Belgia, dan dilakukan sesuai dengan peraturan Uni Eropa tentang pengumpulan dan penggunaan sampel bahan tubuh manusia untuk tujuan penelitian (Keputusan Kerajaan dan ketentuan Undang-Undang tentang biobank mulai berlaku pada bulan November 2018, undang-undang 19/12/2008).

Tes Hemolisis (Eritrosit)
Hemokompatibilitas in vitro pertama kali dievaluasi melalui pengujian hemolisis, menggunakan sel darah merah (RBC). Prosedur ini sebelumnya dijelaskan secara rinci oleh penulis [ 42 , 43 ] dan ringkasannya dapat ditemukan di berkas Informasi Pendukung .

Uji Koagulasi (Waktu Pembekuan)
Untuk percobaan ini, digunakan plasma miskin trombosit (PPP, CRYOcheck). Prosedur ini sebelumnya dijelaskan secara rinci oleh penulis [ 42 , 43 ] dan ringkasannya dapat ditemukan dalam berkas Informasi Pendukung .

Pengukuran Aktivitas Mirip Kalikrein
Pertama, substrat (S-2302, Chromogenix) dilarutkan kembali dalam dH 2 O dan buffer tris disiapkan di rumah, dengan pH disesuaikan menjadi 7,8 pada 25 °C. Cakram PU dan PHOx diinkubasi dengan PPP selama 2 jam pada 37 °C. PPP sendiri digunakan sebagai CTL -, sedangkan PPP yang diinkubasi dengan pathromtin (Siemens) digunakan sebagai CTL +. CaCl 2 , buffer tris, S-2302, dan asam asetat (metode penghentian asam) ditambahkan secara berurutan ke plasma yang diinkubasi, mengikuti waktu dan jumlah yang direkomendasikan oleh Chromogenix. Nilai absorbansi (λ ≈405 nm) diukur dan dibandingkan dengan CTL – dan CTL +. Persamaan berikut digunakan untuk menghitung aktivitas seperti kallikrein plasma dalam unit aktivitas enzim: U/l = A x 344, di mana A adalah absorbansi bacaan.

Aktivitas Dehidrogenase Laktat (Adhesi Trombosit)
Prosedur ini sebelumnya dijelaskan secara rinci oleh penulis [ 42 , 43 ] dan ringkasannya dapat ditemukan dalam berkas Informasi Pendukung .

Kit Uji Protein Asam Bicinchoninic Mikro (BCA) (Kuantifikasi Protein)
Pertama, cakram PU dan PHOx diinkubasi dengan PPP selama 1 jam pada suhu 37 °C, dengan agitasi sedang (100 rpm). Setelah inkubasi, cakram dibilas untuk menghilangkan protein yang tidak terikat, dan larutan natrium dodecyl sulfate (SDS) kemudian digunakan untuk memulihkan protein yang melekat. Untuk mengukur konsentrasi protein yang dipulihkan, kit uji protein BCA mikro (Thermo Scientific) digunakan. Ampul standar bovine serum albumin (BSA) (2 mg mL −1 ), yang disertakan dengan kit, digunakan untuk menyiapkan larutan yang berbeda, pada konsentrasi yang berbeda, dan memplot kurva standar. Reagen kit ditambahkan mengikuti jumlah dan waktu yang direkomendasikan dalam panduan pengguna. Nilai absorbansi (λ ≈562 nm) diukur, memungkinkan deteksi kolorimetri dan kuantisasi total protein dalam setiap sampel.

Sifat Anti-Perekat Terhadap Bakteri (Tantangan 2 jam)
Uji adhesi bakteri dilakukan dengan menggunakan strain pembentuk biofilm dari Staphylococcus epidermidis ( S. epidermidis ) (ATCC 35 984). Cakram PU dan PHOx diinkubasi dengan inokulum bakteri 10 5 CFUs/mL dalam kaldu kedelai tripsin (TSB) selama 2 jam pada suhu 37 °C dalam kondisi statis. Setelah langkah adhesi 2 jam, cakram polimer dibilas tiga kali dengan 500 µL PBS, sehingga bakteri yang tidak menempel atau menempel dengan buruk dapat dihilangkan. Cakram dengan bakteri yang menempel dipindahkan ke sisipan plastik steril bermutu optik (calWell, SYMCEL) dan 300 µL TSB segar ditambahkan ke setiap sampel. Sisipan plastik kemudian ditempatkan di dalam cawan titanium, ditutup dengan tutup titanium, dan rangkaian logam diinkubasi dalam biokalorimeter kami (calScreener, SYMCEL) selama 24 jam dalam kondisi statis pada suhu 37 °C. Aktivitas bakteri diukur melalui deteksi panas yang dihasilkan, produk sampingan dari proses biologis.

Biokompatibilitas In Vitro: Interaksi dengan Fibroblas dan Sel Endotel
Uji biokompatibilitas in vitro dilakukan menggunakan lini sel fibroblas manusia (HFF-1, ATCC-SCRC-1041, RRID: CVCL_3285) dan sel endotel vena umbilikalis manusia yang digabungkan (HUVEC, Katalog #C2519A, Lot #23TL163040). Sel diuji dan dipastikan tidak ada kontaminasi. Sel ditumbuhkan seperti yang dijelaskan sebelumnya secara rinci oleh penulis. [ 43 ] Setelah mencapai konfluensi 90%, sel dibilas dengan 5 mL PBS (37 °C) dan dilepaskan dari tabung kultur menggunakan 2 mL larutan Tripsin-EDTA.

Kontak Tidak Langsung (Ekstrak)
Kompatibilitas sitotoksik PHOx awalnya dievaluasi menggunakan uji kontak tidak langsung, yang sebelumnya dijelaskan secara rinci oleh penulis. [ 43 ] Secara singkat, sel diinkubasi selama 24 jam dengan ekstrak bahan, yang disiapkan seperti yang dijelaskan dalam ISO 10993−12:2004. Larutan Triton (X-100) 0,1% v/v digunakan sebagai CTL + sitotoksisitas. Media kultur digunakan sebagai CTL -.

Kontak Langsung
Kompatibilitas sitokimia PHOx dikonfirmasi melalui kontak langsung antara cakram polimer dan sel HFF-1/HUVEC selama 24 jam dan 1 minggu. Sel disemai pada kepadatan 105 sel mL −1 dan disimpan dalam kultur hingga 1 minggu pada suhu 37 °C dengan 5% v/v CO 2 dalam kontak langsung dengan cakram PU dan PHOx. Larutan Triton (X-100) 0,1% v/v digunakan sebagai CTL + sitotoksisitas. Media kultur digunakan sebagai CTL -.

Pengukuran Aktivitas Metabolisme
Aktivitas metabolisme sel diukur setelah 24 jam kontak tidak langsung dan setelah 24 jam dan 1 minggu kontak langsung dengan polimer, menggunakan uji berbasis resazurin. Untuk itu, media kultur dibuang dan media segar yang mengandung 10% v/v resazurin diinkubasi dengan sel selama 4 jam pada suhu 37 °C dengan 5% v/v CO 2 . Media yang dimetabolisme kemudian dipindahkan ke pelat hitam 96-well dan unit fluoresensi relatif (RFU) diukur (λ ex ≈530 nm, λ em ≈590 nm) menggunakan pembaca mikroplat. Hasil ditampilkan sebagai persentase yang dihitung relatif terhadap CTL -.

Visualisasi Sel yang Melekat
Setelah 1 minggu kultur, HFF-1 dan HUVEC difiksasi menggunakan paraformaldehida (PFA) 4% b/v dalam PBS selama 15 menit, dibilas dengan PBS, dan disiapkan untuk mikroskopi fluoresensi. Sel diwarnai untuk identifikasi asam deoksiribonukleat (DNA) dan aktin filamen (F-aktin), menggunakan 6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorida (DAPI) dalam konsentrasi 3 µg mL −1 , dan faloidin terkonjugasi dengan Alexa Fluor 488 dalam pengenceran 1:100, masing-masing. Inkubasi dengan faloidin dilakukan selama 1 jam dalam gelap, dengan agitasi ringan, sementara inkubasi dengan DAPI berlangsung selama 15 menit. Sel diamati dengan mikroskop resonansi hibrida Nikon A1R confocal. Seri-z pindaian representatif dari sampel diproyeksikan ke satu bidang dan diwarnai semu menggunakan perangkat lunak ImageJ.

Biokompatibilitas In Vivo: Implantasi Subkutan PHOx pada Kelinci
Percobaan pada hewan yang dijelaskan dilakukan setelah persetujuan protokol oleh Institutional Animal Care and Use Committee dari University of Liège, Belgia, sesuai dengan European Directive 2010/63 tentang perlindungan hewan yang digunakan untuk tujuan ilmiah. Laboratorium kami memiliki nomor akreditasi yang diperlukan (LA1610002), dan percobaan dijelaskan dalam berkas #2198. Penentuan ukuran sampel didasarkan pada rekomendasi ISO 10993–6 dan 12 cakram dari setiap polimer ditanamkan untuk setiap titik waktu. Dua cakram PU kelas medis dan dua cakram PHOx ditanamkan per hewan, dengan demikian menggunakan total 6 hewan untuk setiap titik waktu percobaan.

Model Hewan dan Kondisi Perumahan
Uji biokompatibilitas in vivo dilakukan menggunakan kelinci betina New Zealand white (NZW), berusia 112–118 hari (Charles River Laboratories, Prancis). Kondisi kandang mematuhi persyaratan ISO 10993-2. Hewan dipelihara dalam lingkungan yang suhu dan kelembapannya terkontrol dengan makanan kelinci standar dan air keran sepuasnya. Kelinci menjalani masa aklimatisasi minimal 1 minggu dan diperiksa setiap 24 jam.

Operasi
Pembedahan dilakukan menurut rekomendasi ISO 10993–6, setelah anestesi umum dan dengan cara yang meminimalkan trauma pada lokasi implan. Setelah menimbang hewan, anestesi diinduksi dengan suntikan intramuskular droperidol (0,625 mg kg −1 ), xylazine (5 mg kg −1 ), dan ketamin (35 mg kg −1 ) di kaki belakang. Rambut dari area pembedahan (dorsal) dihilangkan dengan cara dicukur, untuk memastikan bahwa implan atau permukaan luka tidak bersentuhan dengan rambut. Area kulit yang terbuka didesinfeksi, sayatan untuk membuat kantong untuk setiap cakram polimer dibuka, dan cakram PU dan PHOx yang disterilkan ditempatkan secara subkutan, dengan jarak setidaknya 2 cm di antara implan yang berbeda. Kantong ditutup dengan setidaknya 2 jahitan menggunakan jahitan Prolene.

Prosedur Pasca Bedah
Fase kebangkitan kelinci biasanya berlangsung kurang dari 1 jam pasca-implantasi. Hewan diawasi setiap 30 menit pada hari implantasi, dan setiap 24 jam pada hari-hari setelahnya. Buprenorfin (0,05 mg kg −1 ) disuntikkan secara subkutan 24 jam setelah implantasi. Jika terjadi garukan di sekitar luka yang tertutup, iodopovidone (iso-Betadine Gel 10%, Mylan) dioleskan pada kulit yang teriritasi.

Eutanasia, Pengambilan Implan dan Pengumpulan Sampel Jaringan
Setelah 1 atau 4 minggu, hewan-hewan tersebut dibius, dieutanasia, dan implan dikeluarkan bersama dengan jaringan di sekitarnya. Eutanasia dilakukan pada hewan yang dibius dengan injeksi intrakardiak pentobarbital (200 mg kg −1 ). Implan, bersama dengan jaringan di sekitarnya, difiksasi dalam larutan 4% PFA dalam PBS selama 24 jam. Implan kemudian dipisahkan dari jaringan sebelum persiapan histologis. Jaringan didehidrasi dalam larutan etanol 70% (semalaman pada suhu kamar) dan kemudian ditanamkan dalam lilin parafin, dipotong, dan diwarnai dengan hematoxylin-eosin (H&E) dan trikrom Masson. Potongan histologis dianalisis oleh ahli patologi dan diberi skor.

Penilaian Penanda Peradangan
Efek lokal dievaluasi dengan membandingkan respons histopatologi jaringan yang disebabkan oleh PHOx (spesimen uji) dan yang disebabkan oleh PU (digunakan dalam perangkat medis dengan penerimaan klinis yang mapan), mengikuti ISO 10993–6. Parameter respons biologis yang dianalisis meliputi: tingkat fibrosis/kapsul fibrosa; perubahan morfologi jaringan; jumlah dan distribusi leukosit neutrofilik polimorfonuklear (PMN), limfosit, sel plasma, makrofag, dan sel raksasa; keberadaan, tingkat, dan jenis nekrosis; perubahan jaringan seperti neovaskularisasi atau infiltrasi lemak; parameter material seperti fragmentasi dan/atau keberadaan serpihan. Prosedur penilaian didasarkan pada rekomendasi ISO 10993–6 (Lampiran E, tabel E.1 dan E.2). Perbandingan antara penanda inflamasi yang berbeda dalam PU atau PHOx dilakukan dengan ANOVA dengan uji perbandingan berganda Tukey.

Analisis Statistik
Data disajikan sebagai nilai rata-rata ± SD di semua grafik yang ditunjukkan pada Gambar 3-5 , dan 6. Uji statistik dan perbandingan berganda yang digunakan untuk mengungkap perbedaan signifikan secara statistik, serta ukuran sampel (n), bervariasi di antara analisis statistik yang berbeda: * p ≤ 0,05, ANOVA satu arah biasa dengan uji perbandingan berganda Dunnett, n = 3, untuk Gambar 3C ; ** p ≤ 0,01, ANOVA satu arah biasa dengan uji perbandingan berganda Dunnett, n = 3, untuk Gambar 3E ; * p ≤ 0,05, uji-t tidak berpasangan , n = 6, untuk Gambar 3F ; ** p ≤ 0,01, uji- t tidak berpasangan , n = 4, untuk Gambar 3G ; * p ≤ 0,05, ANOVA satu arah biasa dengan uji perbandingan berganda Tukey, n = 4, untuk Gambar 4D ; ** p ≤ 0,01, ANOVA dengan uji perbandingan berganda Tukey, n = 12, untuk Gambar 5C ; dan **** p ≤ 0,001, ANOVA dengan uji perbandingan berganda Tukey, n = 12, untuk Gambar 6C . GraphPad Prism adalah perangkat lunak yang digunakan untuk analisis statistik.