Ekstraksi termal dan karakterisasi pektin dari produk sampingan semi-padat industri minyak zaitun

Abstrak
LATAR BELAKANG
Pemanfaatan produk sampingan agroindustri sangat penting untuk mendorong keberlanjutan dan ekonomi sirkular. Produk sampingan semipadat dari penggilingan zaitun (OMSbP), yang juga dikenal sebagai alperujo, mengandung senyawa bioaktif yang berharga, termasuk pektin, yang dapat diekstraksi dan digunakan dalam aplikasi makanan. Namun, sifat struktural dan potensi antioksidan pektin ini memerlukan karakterisasi lebih lanjut untuk menilai potensinya sebagai bahan fungsional.

HASIL
Dalam penelitian ini, pektin diekstraksi dari OMSbP menggunakan proses ekstraksi termal berbasis asam sitrat. Hasil bervariasi tergantung pada varietas zaitun dan tingkat kematangan, dengan efisiensi ekstraksi yang lebih tinggi pada sampel yang lebih matang (48,2 g kg −1 ). Analisis struktur dengan spektroskopi reflektansi total teredam/transformasi Fourier-inframerah mengonfirmasi kandungan homogalakturonan yang tinggi (~500 g kg −1 ) dan tingkat esterifikasi metil sekitar 60%. Profil monosakarida menunjukkan pengayaan dalam arabinosa, rhamnosa, galaktosa dan manosa. Aktivitas antioksidan, dinilai melalui pembersihan radikal DPPH (yaitu 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil), menunjukkan korelasi yang kuat dengan kandungan manosa ( r  = −0,9967). Selain itu, film berbasis pektin menunjukkan stabilitas termal yang sebanding dengan pektin komersial yang digunakan dalam kemasan makanan.

KESIMPULAN
Studi ini menyoroti potensi pektin yang berasal dari OMSbP sebagai bahan biofungsional dengan aktivitas antioksidan dan stabilitas termal. Metode ekstraksi memastikan pendekatan berkelanjutan untuk memanfaatkan produk sampingan industri zaitun. Penelitian di masa mendatang harus mengeksplorasi bioavailabilitas dan aplikasinya dalam lapisan dan pelapis yang dapat dimakan. © 2025 Penulis. Jurnal Ilmu Pangan dan Pertanian yang diterbitkan oleh John Wiley & Sons Ltd atas nama Society of Chemical Industry.

PERKENALAN
Tantangan lingkungan yang semakin meningkat yang dihadapi manusia saat ini mendorong pengembangan sistem produksi dan konsumsi yang lebih berkelanjutan. Sumber daya biomassa, sebagai hasil dari kelimpahannya, merupakan peluang berharga untuk penciptaan produk bernilai tinggi. 1 Di sektor minyak zaitun, sistem ekstraksi dua fase menghasilkan produk sampingan semipadat yang dikenal sebagai produk sampingan semipadat penggilingan zaitun (OMSbP) atau alperujo. 2 – 4 Produk sampingan ini, yang terutama terdiri dari kulit zaitun, pulp, biji dan fragmen lubang, mengandung senyawa bioaktif yang berharga seperti polifenol dan karbohidrat, termasuk selulosa, hemiselulosa dan pektin. 5 Sejak tahun 1990-an, OMSbP telah berperan dalam mengurangi dampak lingkungan dari ekstraksi minyak zaitun dengan meminimalkan akumulasi limbah cair. Namun, kadar airnya yang tinggi menimbulkan tantangan untuk manajemen yang efisien. Pra-perlakuan termal industri baru-baru ini telah meningkatkan ekstraksi senyawa bioaktif, termasuk hidroksitirosol dan berbagai fraksi karbohidrat. Kemajuan ini menandai langkah signifikan menuju pembangunan biorefineri OMSbP, di mana mengoptimalkan ekstraksi dan pemanfaatan karbohidrat tetap menjadi tujuan utama.

Pektin, heteropolisakarida kompleks, sebagian besar terdiri dari domain homogalakturonan (HG) dan daerah rhamnogalakturonan I (RG-I) dengan tulang punggung asam galakturonat (GalA). Unit GalA dapat digantikan dengan gugus metil, karena beberapa gugus karboksil C-6 diesterifikasi dengan metil. Esterifikasi ini memengaruhi karakteristik struktural dan sifat fisikokimia pektin, sehingga menentukan fungsinya dalam makanan dan aplikasi industri lainnya. Ditemukan di dinding sel primer dan lamela tengah jaringan tanaman, pektin berkontribusi secara signifikan terhadap struktur dan integritas tanaman. 6 Pektin yang berasal dari OMSbP telah menunjukkan aktivitas biologis yang penting, termasuk efek antioksidan, antiproliferatif, dan antiinflamasi, yang menyoroti potensinya sebagai bahan fungsional. 7 – 12

Meningkatnya permintaan akan bahan tambahan pangan alami mendorong minat terhadap sumber pektin yang berkelanjutan. 13 Penelitian saat ini menyelidiki ekstraksi dan karakterisasi pektin dari OMSbP menggunakan metode termal berbasis asam sitrat, menganalisis sifat struktural, kapasitas antioksidan, dan aplikasi potensial dalam teknologi pangan.

BAHAN DAN METODE
Bahan mentah
OMSbP (yaitu alperujo), produk sampingan semipadat yang terdiri dari kulit zaitun, daging buah, biji, dan fragmen biji, diperoleh dari Almazara de la Subbetica SCA (Cordoba, Spanyol). Sampel OMSbP dikumpulkan dari dua varietas zaitun yang berbeda: Arbequina dan Hojiblanca selama musim panen awal tahun 2022–2023 (masing-masing diberi nama aeOMSbP dan heOMSbP). Selain itu, sampel diambil dari campuran varietas ini pada dua tahap pematangan yang berbeda selama musim panen yang sama: sampel tahap awal (meOMSbP) dan sampel yang sudah matang sepenuhnya (mmOMSbP). Sampel dikumpulkan langsung di ujung sentrifus horizontal dalam sistem ekstraksi dua fase dan disimpan pada suhu −20 °C hingga diproses lebih lanjut.

Persiapan bahan dinding sel dan ekstraksi pektin
Sampel OMSbP diproses mengikuti metode Renard dengan modifikasi untuk memperoleh pektin yang diekstraksi. 14 Secara singkat, 1 L etanol 800 g kg −1 ditambahkan ke 1 kg OMSbP segar, dan campuran tersebut diinkubasi semalaman di bawah pengocokan terus-menerus pada suhu ruangan. Setelah disentrifugasi pada 15000 ×  g selama 20 menit (RC5C; Sorvall, Mechelen, Belgia), supernatan dibuang, dan residu yang tidak larut dalam alkohol (AIR) yang tersisa dikeringkan pada suhu 40 °C selama 24 jam. Ekstraksi pektin dilakukan dengan mensuspensikan 30 g AIR dalam 300 mL larutan asam sitrat 30 g kg −1 , mengatur pH menjadi 3,0, dan mengaduk pada suhu 95 °C selama 95 menit. 15 Campuran tersebut kemudian disentrifugasi pada 3700 ×  g pada suhu 4 °C selama 15 menit, dan supernatan diolah dengan etanol (2:1 v/v) dan disimpan pada suhu 4 °C selama 16 jam untuk mengendapkan pektin. Setelah langkah sentrifugasi tambahan pada 3700 ×  g selama 30 menit pada suhu 4 °C, endapan dicuci tiga kali dengan etanol anhidrat dan dikeringkan dengan beku.

Karakterisasi kimia pektin yang diekstraksi
Hasil pektin dihitung sebagai rasio pektin kering yang diekstraksi dengan berat AIR asli, dinyatakan dalam g kg −1 OMSbP kering. Kandungan gula netral (NSC) ditentukan menggunakan metode Anthrone, seperti yang dijelaskan oleh Dishe. 16 Secara singkat, 100 μL sampel (rangkap tiga) dicampur dengan 200 μL 0,2% (b/v) anthrone dalam asam sulfat pekat, dipanaskan pada 100 °C selama 5 menit, dan diukur pada 630 nm dalam pembaca mikroplat (iMark; Bio-Rad, Hercules, CA, AS). Glukosa digunakan sebagai standar (0,02–0,2 mg mL −1 ). Kandungan asam uronat diukur menggunakan metode m-hidroksidifenil, seperti yang dijelaskan oleh Blumenkrantz dan Asboe-Hansen. 17 Sampel (200 μL, rangkap tiga) dicampur dengan 1,2 mL natrium tetraborat 0,0125  m dalam asam sulfat, dipanaskan pada suhu 100 °C selama 5 menit, dan direaksikan dengan 20 μL m -hidroksibifenil 0,15% dalam NaOH 0,5%. Absorbansi diukur pada 520 nm menggunakan standar asam galakturonat. Komposisi glikosida dianalisis dengan kromatografi gas (GC, HP6890 Plus; Hewlett Packard, Palo Alto, CA, AS) setelah derivatisasi menjadi alditol asetat, dengan hidrolisis asam trifluoroasetat awal menggunakan inositol sebagai standar internal. 18 Kuantifikasi dilakukan menggunakan larutan standar l -rhamnosa (Rha), l -arabinosa (Ara), d -galaktosa (Gal), d -glukosa (Glc), d -manosa (Man), d -fukosa (Fuc) dan d -xilosa (Xyl). Kondisi kromatografi dijelaskan oleh Lama-Muñoz et al . 19 Total kandungan fenolik (TPC) ditentukan menggunakan metode spektrofotometri Folin–Ciocalteu dengan sedikit modifikasi. 20 Secara singkat, 20 μL dari setiap sampel dicampur dengan 100 μL reagen Folin–Ciocalteu dan 80 μL larutan natrium karbonat 0,70  m dalam air. Campuran diaduk dan diinkubasi selama 10 menit untuk memungkinkan perkembangan warna. Absorbansi diukur pada 655 nm. Kurva kalibrasi dibuat menggunakan asam galat sebagai standar. Kandungan protein dalam sampel ditentukan menggunakan penganalisis unsur nitrogen (LECO, St Joseph, MI, AS), berdasarkan pembakaran internal pada suhu 1000 °C diikuti dengan deteksi konduktivitas termal. Kandungan protein (g kg −1 ekstrak kering) dihitung menggunakan faktor konversi 6,25, sesuai dengan metode ISO. 21

Kapasitas penangkal radikal DPPH
Sampel pektin yang diliofilisasi dilarutkan dalam air pada 10 mg mL −1 dan disaring melalui filter nilon 0,45-μm. Aktivitas antioksidan dinilai menggunakan metode penangkapan radikal 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH), 22 di mana 5 μL setiap ekstrak ditambahkan ke 195 μL larutan DPPH 3,8 mg per 50 mL dalam metanol, diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar, dan diukur pada 490 nm. Hasilnya dinyatakan sebagai nilai EC 50 (mg mL −1 ), yang mewakili konsentrasi yang diperlukan untuk mengurangi aktivitas radikal hingga 50%.

Derajat metil esterifikasi dengan spektroskopi ATR/FT-IR dan 1H NMR
Spektroskopi ATR/FT-IR dilakukan untuk menentukan derajat esterifikasi metil dari pektin yang diekstraksi. Tiga ulangan dari setiap sampel dianalisis, dan intensitas puncak digunakan untuk pengukuran. Metode ini memberikan penilaian kualitatif dan semi-kuantitatif yang andal dari esterifikasi pektin, seperti yang dilaporkan oleh Muñoz-Almagro et al . 23 Sampel digiling dalam mortar akik untuk homogenisasi yang tepat sebelum analisis. Spektrum direkam menggunakan spektrofotometer FT/IR-4700 (Jasco, Tokyo, Jepang) pada rentang 400–4000 cm −1 . Derajat esterifikasi metil (DM) dihitung menggunakan rasio pita serapan pada 1730 dan 1620 cm −1 : DM =  A 1730 /( A 1730  +  A 1620 ).

Spektroskopi NMR 1D  1H pada sampel meOMSbP dan mmOMSbP juga dilakukan untuk menentukan karakteristik strukturalnya. Setiap sampel pektin dilarutkan dalam D 2 O, dan spektrum NMR 1H direkam pada suhu 25 °C menggunakan spektrometer Avance NEO 500 MHz (Bruker, Billerica, MA, AS) yang dilengkapi dengan konsol Onebay yang memiliki tiga saluran frekuensi radio dan probe gradien Z resonansi ganda BBFO 5 mm.

Analisis morfologi permukaan dengan mikroskop elektron pemindaian (SEM)
Sampel pektin yang diliofilisasi dianalisis dengan SEM untuk memeriksa morfologi permukaan. Sampel dilapisi dengan lapisan tipis emas-paladium dalam vakum menggunakan instrumen EM ACE600 (Leica Microsystems, Wetzlar, Jerman) untuk meningkatkan konduktivitas. Pencitraan dilakukan dengan mikroskop elektron pemindaian Zeiss Crossbeam 550 (Zeiss, Madrid, Spanyol) pada tegangan percepatan 2,00 kV dan perbesaran yang berbeda. 24

Analisis termogravimetri film pektin
Film pektin dari sampel meOMSbP dan mmOMSbP diperoleh melalui teknik pengecoran, di mana 20 g kg −1 dispersi pektin dalam air suling dituangkan ke dalam cawan Petri dan dikeringkan pada suhu 37 °C semalaman. Film yang dihasilkan (ketebalan: 45–55 μm) dianalisis untuk stabilitas termal menggunakan instrumen analisis termogravimetri (TGA) Q-500 (TA Instruments, New Castle, DE, AS). Sekitar 5–8 mg dari setiap sampel ditempatkan dalam kapsul alumina dan dikenakan pada kisaran suhu 30–800 °C pada laju pemanasan 10 °C min −1 di bawah atmosfer nitrogen (50 mL min −1 ). Suhu degradasi maksimum ( T d ) ditentukan.

Analisis statistik
Koefisien korelasi Pearson dihitung untuk mengidentifikasi hubungan signifikan antara hasil pektin, komponen kimia, fitur molekuler dan aktivitas antioksidan. Peta panas korelasi dibuat menggunakan paket ggplot2 (Wickham H, ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. Springer-Ver-lag, New York (2016)). (v3.4.2). https://link.springer.com/book/10.1007/978-3-319-24277-4 . Model regresi linier digunakan untuk mengevaluasi daya prediktif variabel spesifik untuk aktivitas antioksidan, dengan koefisien determinasi ( R 2 ) digunakan untuk menilai kesesuaian model. Semua nilai dinyatakan sebagai mean ± SD. Jumlah replikasi yang digunakan untuk setiap pengukuran dinyatakan secara eksplisit untuk memastikan transparansi dan reproduktifitas. Analisis statistik dilakukan menggunakan Prism, versi 8.01 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, AS). Signifikansi antar kelompok sampel ditentukan menggunakan uji t berpasangan untuk varians yang sama. Nilai P  < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.

HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakterisasi kimia pektin yang diekstraksi dari OMSbP
Pektin yang diekstraksi dari OMSbP menggunakan asam sitrat pada suhu 95 °C dari berbagai varietas zaitun (yaitu, aeOMSbP versus heOMSbP) dan tahap kematangan (yaitu, meOMSbP versus mmOMSbP) dikarakterisasi sepenuhnya untuk komposisi kimianya, seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1. Pembekuan bahan baku sebelum ekstraksi asam sitrat sangat penting untuk mencegah aktivitas enzim pektinolitik. Hasil ekstraksi pektin berkisar antara 24,8 g kg −1 (aeOMSbP) hingga 48,2 g kg −1 (mmOMSbP). Hasil yang jauh lebih tinggi diperoleh dari mmOMSbP (48,2 g kg −1 ) dibandingkan dengan meOMSbP (40,0 g kg −1 ), yang menunjukkan penurunan efisiensi ekstraksi sebesar 20% pada tahap kematangan yang lebih awal. Namun, hasil ini lebih rendah daripada yang dilaporkan untuk pektin dari kulit jeruk (sekitar 200 g kg −1 ), yang merupakan limbah agroindustri utama yang digunakan untuk produksi pektin komersial, 25 kulit buah delima (110 g kg −1 ), 26 apel muda (80 g kg −1 ) 27 dan bit gula (160 g kg −1 ). 28 Kandungan protein pektin yang diekstraksi berada dalam kisaran yang dilaporkan untuk pektin apel komersial (sekitar 30 g kg −1 ) 29 dan lebih tinggi daripada yang ditemukan dalam ampas kopi (sekitar 10 g kg −1 ). 30 Selain itu, kandungan fenolik pektin OMSbP lebih tinggi dibandingkan pektin jeruk (1,5–1,8 g kg −1 ), namun serupa dengan nilai yang dilaporkan untuk pektin apel (hingga 6 g kg −1 ). 31

Tabel 1. Hasil, komposisi kimia dan fitur molekuler pektin OMSbP dari dua varietas zaitun yang berbeda (aeOMSbP dan heOMSbP) dan dua tahap kematangan yang berbeda (meOMSbP dan mmOMSbP)

Data dinyatakan sebagai mean ± SD ( n  = 3).
a Berdasarkan AIR.
b Dinyatakan dalam g kg −1 ekstrak kering.
c Relatif %.
d Rasio molar: menunjukkan sifat struktural utama molekul pektin; HG = GalA – Rha, homogalacturonan; RGI = 2(Rha) + Ara + Gal, R1 = GalA/(Fuc + Rha + Glu + Ara + Gal+Xyl), linearitas pektin; R2 = Rha/GalA, kontribusi RG ​​terhadap populasi pektin; R3 = (Gal+Ara)/Rha, panjang rantai samping yang melekat pada RGI.
e Derajat metil esterifikasi (DM) ditentukan dengan ATR/FT-IR.
Untuk menilai komposisi karbohidrat dan derajat percabangan, kandungan monosakarida ditentukan menggunakan kromatografi gas. Perbedaan signifikan diamati antara tahap kematangan yang berbeda, dengan sampel eOMSbP yang dipanen lebih awal menunjukkan kandungan asam uronat dan gula netral yang lebih tinggi. Hal ini mengakibatkan hilangnya karbohidrat total secara preferensial dari dinding sel polimer pada sampel yang dipanen akhir, khususnya Rha dan Xyl, yang berkontribusi pada struktur arabinoxylan di dinding sel. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1 , sampel OMSbP mengandung tujuh monosakarida primer: Rha, Ara, Gal, Glu, Xyl, Fuc dan Man, dalam proporsi yang bervariasi. GalA adalah monosakarida dominan, dengan kadar berkisar antara 500,3 g kg −1 (mmOMSbP) hingga 624,8 g kg −1 (aeOMSbP), yang mengonfirmasi kandungan HG-nya yang tinggi.

Rasio GalA melebihi 50% dalam semua sampel pektin yang dianalisis, yang lebih tinggi dari 35% yang dilaporkan oleh penelitian sebelumnya. 32 Rha, Gal dan Ara bersama-sama menyumbang lebih dari setengah dari total gula netral, yang menunjukkan kontribusi tinggi RG-I terhadap struktur pektin. Kandungan HG (49,34–60,43%) lebih besar daripada RG-I (21,45–27,99%), yang menunjukkan bahwa struktur tulang punggung linier lebih dominan daripada rantai samping. Pektin yang mengandung lebih dari 74% GalA telah dilaporkan memengaruhi komposisi mikrobiota usus dan metabolit mikrobanya, 33 khususnya melalui aktivitas RG-I, yang berperan dalam modulasi respons imun. 34 Dalam penelitian ini, nilai R1 sampel pektin OMSbP (1,11–1,80) ditemukan lebih rendah daripada yang dilaporkan untuk pektin kulit jeruk bali (2,52) 35 dan pektin kulit hijau pistachio (1,97), 36 yang menunjukkan bahwa pektin OMSbP memiliki tingkat percabangan yang lebih tinggi. Namun, nilai R1 pektin aeOMSbP (1,80) lebih tinggi daripada kulit lemon manis (1,53), 37 yang menyoroti variasi dalam kompleksitas struktural di antara berbagai sumber. Nilai R2 dan R3 selanjutnya mendukung bahwa kontribusi utama terhadap struktur pektin berasal dari domain RG-I, dengan mmOMSbP menunjukkan tingkat percabangan tertinggi (38,59) dibandingkan dengan sampel lain (sekitar 11).

Untuk lebih memahami hubungan antara komponen struktural dan sifat pektin, koefisien korelasi Pearson dihitung (Gbr. 1 ). Korelasi yang kuat (> 0,95) diamati antara beberapa variabel, termasuk hasil dan total karbohidrat (−0,96), hasil dan arabinosa (0,97), hasil dan manosa (0,99), hasil dan R1 (−0,97), dan hasil dan DPPH (−0,98). Selain itu, korelasi signifikan ditemukan antara kandungan protein dan galaktosa (−0,96), fenol dan xilosa (0,95), total karbohidrat dan asam galakturonat (0,98), total karbohidrat dan manosa (−0,98), total karbohidrat dan glukosa (0,96), total karbohidrat dan DPPH (0,99), ramnosa dan R2 (0,99), ramnosa dan R3 (−0,96), xilosa dan R2 (0,95), manosa dan R1 (−0,97), glukosa dan rhamnogalakturonan I (0,99), glukosa dan R1 (−0,96), homogalakturonan dan DPPH (0,96), dan R1 dan DPPH (0,97). Kompleksitas struktural dan fungsionalitas pektin saling terkait erat. 38 Penelitian terkini telah memodelkan korelasi antara struktur pektin dan sifat tekno-fungsionalnya. Xie dkk . 39 hubungan yang mapan antara karakteristik pektin dan atribut fungsional menggunakan koefisien korelasi Pearson, yang menyoroti sifat-sifat seperti reologi, kekenyalan, adhesi, stabilitas beku-cair, dan kekerasan. Hasil-hasil ini memperkuat gagasan bahwa konformasi pektin, komposisi monosakarida, dan berat molekul adalah faktor-faktor utama yang memengaruhi perilaku fisikokimianya. Penelitian lebih lanjut telah menunjukkan dampak struktur pektin dan DM-nya pada sifat gelatinisasi. 40 Sebuah penelitian oleh Luo et al . 41 memvalidasi model regresi berganda yang menunjukkan bagaimana variasi kandungan GalA, berat molekul, DM, dan derajat amidasi memengaruhi karakteristik gelatinisasi seperti viskositas puncak dan lembah, serta nilai kemunduran dan kerusakan. Temuan-temuan ini menggarisbawahi pentingnya parameter struktural dalam menentukan fungsionalitas pektin, yang selanjutnya mendukung interaksi kompleks antara komposisi kimia dan atribut tekno-fungsional.

Gambar 1
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Peta panas koefisien korelasi Pearson yang menunjukkan hubungan antara karakteristik struktural, konformasi, dan kapasitas antioksidan pektin. Gradien warna menunjukkan koefisien korelasi Pearson, dengan nilai yang ditampilkan dalam setiap kotak.
Aktivitas antioksidan dan korelasi dengan komponen struktural
Gambar 2A menyajikan aktivitas antioksidan dari pektin yang diekstrak, diukur melalui penangkalan radikal DPPH. Nilai EC 50 menunjukkan bahwa meOMSbP menunjukkan kemampuan penangkalan radikal bebas 6% lebih tinggi dibandingkan dengan mmOMSbP. Peningkatan ini berbanding lurus dengan kandungan fenolik 7% lebih tinggi yang ditemukan dalam meOMSbP, yang mengonfirmasi bahwa aktivitas antioksidan dari ekstrak ini terutama disebabkan oleh senyawa fenoliknya daripada struktur pektin itu sendiri. Fenol mudah terikat pada gula, mentransfer sifat antioksidannya ke molekul-molekul ini. 7 Nilai EC 50 yang diperoleh untuk pektin yang diekstrak yang berasal dari produk sampingan ampas zaitun lebih rendah daripada yang dilaporkan untuk Spirulina sp., mikroalga yang dikenal karena kapasitas antioksidannya yang luar biasa. Konsentrasi yang paling efektif adalah 2,5 mg mL −1 , dan aktivitas ini terutama disebabkan oleh keberadaan senyawa bioaktif seperti asam fenolik, fikosianin, dan tokoferol. 42

Gambar 2
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
(A) Aktivitas penangkal radikal DPPH (EC 50 ) dari sampel pektin. Nilai (mg mL −1 ) dinyatakan sebagai rata-rata ± SD ( n  = 3). Signifikansi statistik antara varietas dan tingkat kematangan ditunjukkan oleh nilai- P . (B) Analisis korelasi antara komposisi kimia dan kapasitas antioksidan (EC 50 , mg mL −1 ). Panjang batang mewakili koefisien korelasi Pearson, dengan nilai ditampilkan dengan batang.
Gula juga dapat meningkatkan ketersediaan hayati fenol, sehingga menciptakan hubungan fungsional yang sinergis antara kedua kelompok senyawa tersebut.43 Interaksi ini sangat penting secara gizi karena membuat pektin yang diekstraksi dari OMSbP lebih bernilai untuk formulasi produk makanan yang berorientasi kesehatan dibandingkan dengan pektin komersial yang tidak memiliki asosiasi fenolik.

Untuk menyelidiki lebih lanjut apakah karakteristik spesifik pektin turunan OMSbP, seperti hasil, komposisi kimia dan struktur molekuler, memengaruhi kapasitas antioksidannya, koefisien korelasi Pearson dihitung. Gambar 2B menunjukkan bahwa DPPH menunjukkan korelasi yang kuat (> ±0,5) dengan beberapa variabel, baik positif maupun negatif. Korelasi terkuat ditemukan antara DPPH dan kandungan mannosa ( r  = −0,9967). Untuk menilai signifikansi hubungan ini, model regresi linier sederhana diterapkan, menghasilkan persamaan y  = 2,3805–0,1991 x , di mana ‘ y ‘ mewakili aktivitas antioksidan dan ‘ x ‘ mewakili konsentrasi mannosa. Model tersebut mengonfirmasi bahwa mannosa memiliki dampak signifikan ( P  < 0,05) pada DPPH, menjelaskan 99% varians dalam data ( R 2  = 0,9901). Hal ini menunjukkan bahwa peningkatan kandungan mannosa dalam pektin yang diekstraksi dapat meningkatkan sifat antioksidannya. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan oligogalakturonida berkaitan erat dengan atribut strukturalnya, termasuk komposisi monosakarida dan berat molekul.44 – 47 Mekanisme antioksidan pektin rumit, dan penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengeksplorasi hubungan antara struktur polisakarida dan fungsi antioksidan secara lebih mendalam.48

Derajat metil esterifikasi pektin hasil ekstraksi dari OMSbP
Spektrum ATR/FT-IR dianalisis untuk menentukan apakah pektin OMSbP liofilisasi yang diekstraksi dari varietas zaitun dan tingkat kematangan yang berbeda mempengaruhi gugus fungsi dan konfigurasi ikatan (Gbr. 3 ).

Gambar 3
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Spektrum Fourier transform-infrared spectroscopy (ATR/FT-IR) dari pektin OMSbP beku-kering yang diekstrak dari (A) varietas zaitun yang berbeda dan (B) tingkat kematangan yang berbeda. Varietas arbequina (aeOMSbP, garis hijau), varietas hojiblanca (heOMSbP, garis oranye), kematangan tahap awal (meOMSbP, garis merah muda) dan kematangan tahap matang (mmOMSbP, garis biru).
Secara keseluruhan, sedikit variasi diamati dalam profil spektral pektin yang diekstraksi dari varietas Arbequina (aeOMSbP) (Gbr. 3A , garis hijau) dan varietas Hojiblanca (heOMSbP) (Gbr. 3A , garis oranye). Selain itu, perbedaan dicatat antara sampel pektin awal musim (meOMSbP) (Gbr. 3B , garis merah muda) dan akhir musim (mmOMSbP) (Gbr. 3B , garis biru). Pita serapan lebar pada 3400 cm −1 , yang sesuai dengan getaran peregangan O  H dari gugus hidroksil, tampak lebih tajam dalam mmOMSbP dibandingkan dengan meOMSbP, kemungkinan karena kandungan fenolik yang lebih rendah (Tabel 1 ). 49 Tidak ada perbedaan signifikan yang terdeteksi antara kedua varietas zaitun, sejalan dengan temuan berharga, dan berpotensi dikaitkan dengan konstanta disosiasi tinggi dari asam sitrat yang digunakan selama ekstraksi. 50

Pita serapan pada 2925 cm −1 yang dikaitkan dengan C  H (—CH, —CH 2 , —CH 3 ), tetap konsisten di seluruh sampel pektin, yang menunjukkan bahwa kematangan tidak memengaruhi gugus fungsi ini. Namun, aeOMSbP menunjukkan intensitas yang lebih tinggi di wilayah ini dibandingkan dengan heOMSbP. Khususnya, pektin yang diekstraksi dari zaitun akhir musim (mmOMSbP) dan Hojiblanca (heOMSbP) menunjukkan penurunan pada pita dekat 1730 cm −1 , yang sesuai dengan peregangan CO dari gugus karboksil metilesterifikasi (COO-R), sedangkan ada peningkatan pada 1620 cm −1 , yang terkait dengan peregangan ion karboksilat (COO − ), yang menunjukkan sedikit variasi dalam derajat DM, seperti yang tercermin dalam Tabel 1 . Pita serapan pada 1146 cm −1 dan 1405 cm −1 , masing-masing terkait dengan peregangan C—OH pada gugus samping dan vibrasi ikatan glikosidik C—O—C, tetap tidak berubah di seluruh sampel, yang menunjukkan konsistensi dalam ikatan glikosidik. 51 , 52 Demikian pula, pita karakteristik pada 1250 cm −1 , ( peregangan —CH 3 CO), 957 cm −1 (tekukan C  O), 912 cm −1 (mode goyangan CH 3 ) dan 820 cm −1 (tekukan —CCH dan —COH pada posisi C-6) dipertahankan, terlepas dari tahap kematangan atau varietas zaitun, yang memperkuat stabilitas struktural pektin yang diekstraksi.

Analisis 1H NMR
Spektrum 1 H NMR (Gbr. 4 ) pektin yang diekstraksi dari meOMSbP dan mmOMSbP diperoleh pada 500 MHz untuk lebih menguatkan dan mengklarifikasi fitur strukturnya. Spektrum direkam pada 60 °C menggunakan sampel yang dilarutkan dalam D2O , yang bertujuan untuk mengurangi viskositas sampel. Pengukuran pada suhu ini juga memiliki manfaat tambahan untuk menggeser sinyal air residual ke sekitar 4,4 ppm, menghindari tumpang tindih dengan sinyal pektin yang relevan. Sinyal yang paling relevan muncul di wilayah 3,0–5,5 ppm, yang sesuai dengan proton rangka dan anomerik dari monosakarida. Sampel pektin dengan tingkat metilasi tinggi, seperti yang dianalisis, biasanya menampilkan puncak proton anomerik sekitar 5 ppm. Khususnya, proton H-1 dan H-5 anomerik (COO − ) diamati pada δ 5,3 ppm dan δ 4,8 ppm, masing-masing, karakteristik residu GalA yang dihubungkan melalui ikatan glikosidik α-1,4. Selain itu, puncak pada 4,6 ppm sesuai dengan proton H-4, sedangkan sinyal pada sekitar 4,2 dan 4,1 ppm dikaitkan dengan proton H-3 dan H-2, masing-masing, sesuai dengan penelitian sebelumnya. 53 Wilayah antara 3,0 hingga 4 ppm menunjukkan sinyal yang tumpang tindih yang ditetapkan untuk proton cincin galaktosa, arabinosa, dan rhamnosa, yang menunjukkan keberadaan struktur arabinogalactan atau rantai samping pektik. Selain itu, sinyal sekitar 1,0–1,5 ppm kemungkinan besar terkait dengan gugus metil rhamnosa, yang menunjukkan wilayah bercabang dalam struktur pektin. Khususnya, serangkaian sinyal doublet dari doublet dari doublet (ddd) yang diamati antara δ 2,7 dan δ 2,9 ppm mungkin terkait dengan pengikatan pektin ke asam sitrat yang digunakan selama ekstraksi. Sinyal-sinyal ini dikaitkan dengan proton metilen dari asam sitrat, seperti yang sebelumnya disarankan oleh Kermani et al . 54 Profil spektral ini mengonfirmasi komposisi kompleks pektin yang diekstraksi, yang meliputi tulang punggung GalA dengan potensi substitusi oleh gula netral.

Gambar 4
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Spektrum 1D 1 HNMR pektin yang diekstraksi dari meOMSbP dan mmOMSbP direkam pada 500 MHz dalam D₂O pada suhu 60 °C.
Analisis morfologi permukaan dengan SEM
Morfologi permukaan pektin OMSbP liofilisasi yang diekstraksi dari berbagai varietas zaitun (Gbr. 5A–D ) dan pada berbagai tahap kematangan (Gbr. 5E–H ) dianalisis menggunakan SEM (Gbr. 5 ). Gambar SEM mengungkapkan perbedaan struktural antara sampel pektin. Dalam sampel eOMSbP, degradasi menjadi fragmen yang lebih kecil diamati setelah musim panen, yang menyebabkan pengurangan ukuran partikel dalam kondisi pencitraan yang identik (Mag = 50× dan AV = 2,0 kV/Mag = 250× dan AV = 2,0 kV). Pektin yang diekstraksi dari aeOMSbP menunjukkan permukaan yang halus, kemungkinan karena kandungan HG yang lebih tinggi dan gangguan struktural yang lebih sedikit. Sebaliknya, pektin mOMSbP menunjukkan struktur yang berbeda dengan retakan panjang yang terlihat di permukaan. Arsitektur heterogen ini, yang dicirikan oleh struktur kasar, padat, dan bersisik, mungkin disebabkan oleh rendahnya kandungan rantai samping gula asam, yang memengaruhi organisasi dan sifat mekanis pektin yang diekstraksi. 23

Gambar 5
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
Morfologi permukaan pektin OMSbP beku-kering yang diekstrak dari berbagai varietas zaitun dan berbagai tingkat kematangan. (A, B) Varietas Arbequina (aeOMSbP), (C, D) Varietas Hojiblanca (heOMSbP), (E, F) kematangan tahap awal (meOMSbP) dan (G, H) kematangan tahap matang (mmOMSbP), dianalisis dengan SEM pada dua perbesaran (Mag.). Gambar SEM atas diambil pada Mag = 50x dan AV = 2,0 kV (skala batang = 100 μm), sedangkan gambar SEM bawah diambil pada Mag = 250x dan AV = 2,0 kV (skala batang = 30 μm).
Stabilitas termal film berbasis pektin OMSbP
Kurva TGA dan turunannya (DTGA) (Gbr. 6A,B ) memberikan wawasan penting ke dalam stabilitas termal dan perilaku dekomposisi film berbasis pektin yang berasal dari OMSbP, khususnya dari berbagai tahap kematangan. Memahami transisi termal ini penting tidak hanya untuk mengevaluasi kemampuan proses di bawah panas, tetapi juga untuk memprediksi perilaku mereka dalam aplikasi penggunaan akhir seperti pengemasan makanan, film yang dapat dimakan atau sistem pelepasan terkendali. Seperti yang ditunjukkan pada Gbr. 6A , kedua sampel pektin menunjukkan profil degradasi termal yang sama, dengan perbedaan kecil lebih jelas dalam kurva DTGA (Gbr. 6B ). Degradasi mengikuti pola tiga tahap yang khas, karakteristik bahan berbasis polisakarida. 55 , 56 Kehilangan massa awal, diamati sekitar 93 °C, berhubungan dengan penguapan kelembaban bebas dan terikat, yang mencerminkan sifat higroskopis pektin dan keberadaan gugus hidroksil yang mampu membentuk ikatan hidrogen dengan air. 35 Langkah ini khususnya penting dalam film yang dapat dimakan karena retensi kelembaban dapat memengaruhi integritas mekanis dan kinerja masa simpan. Tahap degradasi kedua, yang terjadi pada sekitar 233 °C, dikaitkan dengan depolymerisasi dan pemecahan tulang punggung HG, yang sebagian besar terdiri dari unit GalA. Proses dekomposisi tambahan terkait dengan pembelahan ikatan glikosida dan dekarboksilasi GalA. Ketahanan termal dalam fase ini dapat dipengaruhi oleh tingkat esterifikasi, berat molekul dan keberadaan pengotor atau senyawa fenolik residu yang diekstraksi bersama dari matriks produk sampingan zaitun. 57 , 58 Puncak dekomposisi utama ketiga, yang diamati sekitar 443 °C, kemungkinan berhubungan dengan pemecahan fraksi yang lebih stabil secara termal dan degradasi oksidatif residu karbon. Kehadiran bahu kecil pada kurva DTGA menunjukkan karbonisasi parsial dan pembentukan arang sisa, mungkin sebagai akibat dari fragmen lignoselulosa atau residu fenolik yang umumnya tertahan dalam pektin yang diekstraksi dari residu agroindustri. 58 Temuan ini menunjukkan bahwa pektin OMSbP menunjukkan stabilitas termal yang sebanding dengan pektin komersial, mendukung potensi penggunaannya dalam aplikasi yang diproses secara termal seperti pengeringan suhu rendah, ekstrusi atau laminasi. 59

Gambar 6
Buka di penampil gambar
Kekuatan Gambar
(A) Kurva analisis termogravimetri (TGA) dan (B) turunan TGA (DTGA) yang sesuai dari film berbasis pektin OMSbP yang diekstraksi dari tahap kematangan awal (meOMSbP, garis merah muda) dan tahap kematangan matang (mmOMSbP, garis biru).

KESIMPULAN
Studi saat ini menyoroti potensi pektin yang diekstrak dari OMSbP sebagai bahan fungsional dan berkelanjutan untuk aplikasi makanan. Pektin yang diperoleh dari sampel OMSbP tahap awal kematangan (eOMSbP) menunjukkan kandungan GalA dan tingkat metilasi yang lebih tinggi, bersama dengan perbedaan komposisi monosakarida yang jelas. Meskipun terdapat variasi kimia di antara pektin yang diekstrak dari berbagai varietas zaitun dan tahap kematangan, pektin tersebut menunjukkan sifat antioksidan yang signifikan, yang kemungkinan besar disebabkan oleh kandungan fenoliknya dan korelasi yang kuat dengan konsentrasi mannosa. Stabilitas termal film berbasis pektin OMSbP sebanding dengan pektin komersial, memenuhi sifat reologi utama yang dibutuhkan dalam industri makanan. Penerapan perlakuan termal, serupa dengan yang semakin banyak diadopsi oleh pengolah ampas minyak zaitun, dikombinasikan dengan ekstraksi asam sitrat, memungkinkan produksi pektin bioaktif dengan sifat pembentuk film dan tahan panas. Karakteristik ini mendukung potensi penggunaannya dalam pengawetan dan formulasi makanan. Temuan penelitian ini menegaskan bahwa praperlakuan termal merupakan strategi yang efektif untuk meningkatkan ekstraksi senyawa bioaktif dari ampas zaitun, yang berkontribusi pada peningkatan nilai jual penuh produk sampingan ini. Pektin yang diperoleh menunjukkan integritas struktural, stabilitas fungsional, dan aktivitas antioksidan, yang memperkuat kesesuaiannya untuk dimasukkan ke dalam produk makanan sekaligus mempromosikan keberlanjutan dalam industri minyak zaitun. Penelitian di masa mendatang harus difokuskan pada pengoptimalan kondisi ekstraksi untuk lebih meningkatkan hasil pektin dan bioaktivitas. Selain itu, menyelidiki bioavailabilitas dan efek kesehatan pektin yang berasal dari OMSbP dalam aplikasi makanan fungsional dapat memperluas potensinya dalam nutraceutical dan formulasi label bersih.